CC BY
35
^^(gCTiipfe [ЩсоЖГГЩ^
УДК 615.1:615.272.4
НАПРАВЛЕННЫЙ ПОИСК НОВЫХ АНТИОКСИДАНТНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
МЕТОДАМИ IN SILICO И IN VITRO
В.А. Косолапов1, Д.В. Сороцкий1, П.М. Васильев1, О.Н. Жуковская2, В.А. Анисимова2
1ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; 2НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, Ростов-на-Дону
Был проведен прогноз антиоксидантной активности 1231 нового соединения. Для дальнейшего скрининга in vitro были отобраны 29 ранее не изученных соединений c индексом сходства «2» и «3» и 30 соединений с индексом сходства <1. В результате, были выявлены 3 соединения с высокой АОА.
Ключевые слова: антиоксиданты, перекисное окисление липидов, свободные радикалы, in silico, компьютерный прогноз.
DOI 10.19163/1994-9480-2018-3(67)-24-27
THE DIRECTED SEARCH OF THE NOVEL ANTIOXIDANT COMPOUNDS IN SILICO
AND IN VITRO
V.A. Kosolapov1, D.V. Sorotskij1, P.M. Vasil'ev1, O.N. Zhukovskaya2, V-А. Аnisimova2
1FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation; 2South federal university, Research institute for physical and organic chemistry, Rostov-on-Don
The in silico prognosis of antioxidant properties has been made for 1231 novel compounds. For the further experimental screening 29 novel compounds with similarity index «2» & «3» and 30 compound with similarity index <1 have been chosen. As a result, three substances with high antioxidant activity have been found.
Key words: antioxidants, lipid peroxidation, free radicals, in silico, computer prognosis
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) одно из звеньев патогенеза более чем 200 заболеваний и патологических состояний. Оксидативный стресс имеет большое значение в развитии сердечно-сосудистых патологий, хронических заболеваний печени, нейроде-генеративных, инфекционных и ряда других свободно-радикальных патологий патологий [7]. Особо чувствительны к окислительному стрессу ткани головного мозга в силу высокого потребления кислорода и особенностей состава вещества мозга - наиболее высокое содержание фосфолипидов, полиненасыщенных жирных кислот, ионов двухвалентного железа и низкое содержание антиоксидантных витаминов, низкая плотность глутатионпероксидазы и почти полное отсутствие каталазы [4]. Избыточная продукция свободных радикалов кислорода и азота играет ключевую роль при ишемических и поражениях с образованием гидроксиль-ных радикалов, которые преимущественно и вызывают окисление липидов, белков и ДНК с дальнейшим повреждением тканей мозга [4, 8]. Все это делает актуальным поиск новых антиоксидантных соединений с высокой активностью.
Использование методов т silico для поиска новых лекарственных веществ позволяет экономить время на поиск новых активных соединений, и существенно снизить затраты на разработку эффективных лекарственных средств [12]. Особо интенсивно развиваются консенсусные подходы к прогнозу [9], основанные на обобщении результатов, полученных с помощью не-
скольких QSAR-зависимостей. Методы компьютерного прогноза широко применяются и при поиске новых антиоксидантных соединений [10].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Оптимизация поиска новых антиоксидантных соединений с использованием методов in silico и изучением перспективных соединений in vitro.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
В ходе работы была создана оригинальная верифицированная база данных по химической структуре и уровню активности антиоксидантных веществ ингибиторов свободно-радикальных процессов среди производных конденсированных азолов, изученных в лаборатории фармакологии антиоксидантных средств НИИ фармакологии ВолгГМУ до 2014 г. [1, 2, 5]. Формирование базы данных было выполнено с помощью СУБД ИТ «Микрокосм» [3]. Для прогноза in silico антиоксидантной активности были выбраны 1231 соединение из ряда конденсированных азолов из банка субстанций кафедры фармакологии ВолгГМУ, синтезированных в НИИ физической и органической химии ЮФУ, г. Ростов-на-Дону, ранее не изучавшихся на антиоксидантную активность. Прогноз антиоксидантной активности у новых соединений in silico был выполнен с помощью модуля TestSim программного комплекса ИТ «Микрокосм» [3] методом сходства к 11 активным референсным ан-тиоксидантным соединениям из созданного банка хи-
I^mpfö ©©СаГГГМЩ
мических структур с изученной антиоксидантной активностью.
Для каждого нового соединения рассчитывалось среднее значение модифицированного коэффициента 2D-сфуктурноro сходства Танимото (общий коэффициент сходства (ОКС)) [11] к 11 референсным соединениям (эталонам), отобранным из верифицированной базы данных по химической структуре и уровню активности антиоксидантных веществ ингибиторов свободно-рад и-кальных процессов.
О возможном наличии антиоксидантной активности у новых соединений судили по степени сходства к референсным соединениям. При прогнозе расчитывались средние значения общего коэффициента сходства по 11 типам QL-дескрипторов и разделялись на 3 основные группы:
Max.E = 0,4100 (максимальное среднее);
Med.E = 0,3632 (общее среднее);
Min.E = 0,3248 (минимальное среднее).
Далее, соединениям условно присваивался индекс принадлежности в зависимости от значений ОКС, если значение ОКС > Max.E, то присваивался индекс 3; если Max.E > ОКС > Med.E присваивался индекс 2; если Med.E > ОКС > Min.E присваивался индекс 1; если ОКС < Min.E то присваивался индекс 0. Чем выше индекс принадлежности, тем соединение имеет большее сходство к эталонным соединениями.
Антиоксидантную активность in vitro новых веществ изучали на модели аскорбат-зависимого пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) [6]. В качестве субстрата использовали 4%-й гомогенат печени крыс. Го-могенат получали в гомогенизаторе Поттера стеклянном с электрическим приводом МШ-2 (Россия) в 0,1 моль/л трис-НС!-буфере рН 7,4. Реакцию инициировали 50 мМ аскорбиновой кислоты (Chemapol, Чехия), и пробы инкубировались в течение 15 мин в бане серологической СБ-СЛ-01М (Россия) при t 37 °C. Реакцию останавливали 50%-м раствором трихлоруксусной кислоты (Россия), и пробы центрифугировали 15 мин при 3000 об./ мин на центрифуге Elmi СМ-6МТ (Латвия). К надоса-дочной жидкости добавляли 0,8%-й раствор 2-тиобар-битуровой кислоты (Диа-М, Россия), и пробы кипятились 10 мин на водяной бане. Скорость ПОЛ определяли по накоплению малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой. Оптическую плотность окрашенного продукта измеряли при длине волны 532 нм на спектрофотометре PD-303 UV (APEL, Япония) в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Активность веществ рассчитывали по формуле x = 100-^оп/ Eконтр*100). Вещества изучались в концентрации 1 х 10-6 моль/л. Вещества, проявившие высокий уровень активности, изучались в широком диапазоне молярных концентраций, и для них рассчитывали величину ИК^ (концентрация, ингибирующая реакцию на 50 %) методом линейного уравнения регрессии.
В качестве препаратов сравнения использовали субстанции водорастворимого антиоксиданта тролокса
(6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота, CAS 53188-07-1) (Fluka, Швейцария), и цереброп-ротектора с антиоксидантными свойствами мексидола (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат) (ООО «НПК «ФАРМАСОФТ», Россия).
Обработка результатов выполнялась в программе Microsoft Excel (Microsoft, США) с расчетом базовых статистических показателей: среднего арифметического M, стандартной ошибки среднего арифметического m. ИК50 (концентрация, ингибирующая реакцию на 50 %) рассчитывался в программе Microsoft Excel (Microsoft, США) методом уравнения линейной регрессии и парного коэффициента корреляции (R2) по трем парам значений (LgC; D%). Статистическая обработка проводилась с применением парного t-критерия Стью-дента в программе Statistica 10.0 (StatSoft, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
С помощью СУБД ИТ «Микрокосм» [3] была сформирована и верифицирована база данных оригинальных веществ производных конденсированных азолов, и был проведен прогноз по сходству к эталонам. По результатам прогноза антиоксидантной активности 1231 соединений была сформирована выборка из 240 соединений с высоким коэффициентом сходства с эталонными антиоксидантными веществами. Среди них было выявлено 97 соединений с индексом ОКС «3» и 142 соединения с индексом ОКС «2». Из них для экспериментального изучения были выбраны 29 соединений (табл. 1).
Таблица 1
Антиоксидантная активность соединений в концентрации 1*10-6 моль/л, %инг. (M± m)
№ Шифр Активность, % инг.
1. RU-210 42,03 ± 4,89*#
2. RU-179 32,87 ± 3,54*#
3. RU-31 28,41 ± 3,67*#
4. RU-704 24,58 ± 2,46*#
5. RU-64 22,89 ± 3,21 *#
6. RU-636 21,36 ± 1,49*#
7. RDMA-5 19,15 ± 3,67*#
8. RDMA-1 13,22 ± 2,65*
9. RU-708 9,87 ± 3,56
10. RU-630 9,00 ± 4,87
11. RU-870x 8,98 ± 2,48
12. RU-709 7,62 ± 3,65
13. RU-696 7,38 ± 2,35
14. RU-694 6,78 ± 1,89
15. RU-700 4,32 ± 1,39
16. RU-631 4,05 ± 2,62
17. RU-30 4,01 ± 1,57
18. RU-638 3,80 ± 2,45
19. RU-692 3,57 ± 0,98
20. RU-629 3,43 ± 1,24
21. RU-707 2,69 ± 1,32
Окончание таблицы 1
№ Шифр Активность, % инг.
22. RU-693 2,52 ± 0,98
23. RU-639 2,24 ± 01,45
24. RU-691 0,30 ± 0,12
25. RU-701 0
26. RU-1202 0
27. RU-711 0
28. RU-1192 0
29. RU-1195 0
30. Тролокс 0
31. Мексидол 7,5 ± 2,34
*Данные статистически значимы по отношению к контролю (р < 0,05); "данные статистически значимы по отношению к мексидолу (р < 0,05).
Было установлено, что наибольшую активность в концентрации 1 мкмоль/л проявило соединение РУ-210, которое лишь незначительно уступало по активности эталонному веществу тролокс и статистически значимо превосходило по активности мексидол. Соединения РУ-179, РУ-31, РУ-704, РУ-64, РУ-636 и РДМА-5 также были более активны, чем мексидол, но уступали тролоксу.
При изучении наиболее активных соединений в широком диапазоне концентраций было установлено, что по уровню ИК50 (табл. 2) наибольшей активностью обладали вещества под шифрами РУ-210 и РУ-636.
Таблица 2
ИК антиоксидантных соединений, моль/л
С целью проверки эффективности прогноза были рассчитаны ошибки первого и второго рода. По результатам скрининга было выявлено, что из 29 веществ с индексом ОКС «2» и «3» у 24 соединений (82,8 %) имелась антиоксидантная активность. Таким образом, ошибка первого рода составила 17,2 %. Для расчета ошибки второго рода были рандомизированно отобраны и исследованы 30 соединений разных химических рядов с индексом ОКС < 1 в концентрации 1 *10-6 моль/л. Было установлено, что из 30 веществ у 8 соединений проявлялась антиоксидантная активность в интервале от 17 до 68 %. Таким образом, ошибка вторгого рода составила 26,6 %. Среди 8 соединений выделено соединение РУС-197, активность которого в данной концентрации составила 68,7 %, и ИК^ был 8,58 х 10-7 моль/л 0,9), что позволяет также отнести его к высоко активным.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенный in silico прогноз наличия антиоксидантной активности у 1231 нового производного азолов позволил выявить 240 потенциально активных антиоксидантных веществ. Экспериментальное изучение in vitro АО активности 29 новых веществ с высоким уровнем сходства к эталонным АО соединениям, выбранным по результатам прогноза, и 30 веществ с низким индексом ОКС, позволило выделить 3 вещества с высокой антиоксидантной активностью, перспективных для дальнейшего углубленного изучения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анисимова В.А., Спасов А.А., Островский О.В. и др. Синтез и фармакологическая активность З-(ароил) и 3-(гетароил)имидазо[1,2-а]бензимидазолов // Хим.-фарм. журнал. - 2002. - Т. 36, № 12. - С. 3-8.
2. Анисимова В.А., Толпыгин И.Е., Спасов А.А. и др. Синтез и биологическая активность n-ацилметил-заме-щенных 9Н-2,3-дигидроимидазои 10Н-2,3,4,10-тетра-гидропиримидо[1,2-а]бензимидазолов и продуктов их восстановления // Хим.-фарм. журнал. - 2006. - Т. 40, № 5. - С. 27-33.
3. Васильев П.М., Кочетков А.Н. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2011618547. ИТ «Микрокосм». - № 201616643; за-явл. 02.09.2011; зарег. 31.10.2011.
4. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Нейропротективная терапия ишемического инсульта // Журн. неврологии и психиатрии. Инсульт: прилож. к журн. - 2002. - № 5. - С. 3-16.
5. Косолапов В.А., Спасов А.А., Анисимова В.А. Изучение антирадикальной активности новых соединений методами хемилюминесценций // Биомедицинская химия. - 2005. - Т. 51, № 3. - С. 287-294.
6. Ланкин В.З., Гуревич С.М., Бурлакова Е.Б. Изучение аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов тканей при помощи теста с 2-тиобарбитуровой кислотой // Труды московского общества испытателей природы. - 1975. - Т. 52. - С. 73-78.
7. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.
8. Giasson B.I., Ischiropoulos H., Lee V.M. et al. The relationship between oxidative/nitrative stress and pathological inclusions in Alzheimer's and Parkinson's diseases // Free Radic. Biol. Med. - 2002. - Vol. 32. -P. 1264-1275.
9. Izenman A.J. Modern Multivariate Statistical Techniques Regression, Classification, and Manifold Learning // Springer Texts in Statistics, 2008.
10. Mitra I., Sahay A., Roy K. Chemometric QSAR modeling and in silico design of antioxidant no donor phenols // Sci. Pharm. - 2011. - Vol. 79. - P. 31-57 [Electronic resource]. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC3097501/.
11. Molecular Similarity in Drug Design / Ed. P.M. Dean. -Dordrecht: Springer-Science + Business Media B.V., 2012. - 342 p.
12. Verma J., Khedkar V.M., Coutinho E.C. 3D-QSAR in drug design - a review // Current Topics in Medicinal Chemistry. - 2010. - Vol. 10. - P. 95-115.
Шифр ИК50, моль/л (R2)
РУ-210 2,54 х 10-6 (0,93)
RU-636 2,58 х 10-6 (0,91)
RU-704 3,92 х 10-6 (0,99)
RDMA-1 4,55 х 10-6 (0,99)
RDMA-5 4,45 х 10-6 (0,98)
Тролокс 2,19 х 10-5 (0,86)
Мексидол 4,80 х 10-4 (0,85)
I^mpfö ©©СаГГГМЩ
REFERENCES
1. Anisimova V.A., Spasov A.A., Ostrovskij O.V. i dr. Cintez i farmako-logicheskaya aktivnost' 3-(aroil) i 3-(getaroil)imidazo[1,2-a]benzimidazolov [Synthesis and pharmacological activity of 3- (aroyl) and 3- (hetaroyl) imidazo [1,2-a] benzimidazoles]. Him.-farm. zhurnal. [Chemical-farm. journal], 2002, Vol. 36, no. 12., pp. 3-8. (In Russ.; abstr. in Engl.).
2. Anisimova V.A., Tolpygin I.E., Spasov A.A. i dr. Sintez i biologiche-skaya aktivnost' n-acilmetil-zameshchennyh 9N-2,3-digidroimidazoi 10N-2,3,4,10-tetra-gidropirimido[1,2-a]benzimidazolov i produktov ih vossta-novleniya [Synthesis and biological activity of 10-N-2,3,4,10-tetrahydropyrimido [1,2-a] benzimidazoles and their reduction products]. Him.-farm. zhurnal. [Chemical-farm. journal], 2006, Vol. 40, no. 5, pp. 27-33. (In Russ.; abstr. in Engl.).
3. Vasil'ev P.M., Kochetkov A.N. Svidetel'stvo o gosudarstvennoj regi-stracii programmy dlya EHVM № 2011618547 [Certificate of state registration of the computer program no. 2011618547]. IT «Mikrokosm». № 201616643; zayavl. 02.09.2011; zareg. 31.10.2011.
4. Gusev E.I., Skvorcova V.I. Nejroprotektivnaya terapiya ishemicheskogo insul'ta [Neuroprotective therapy of ischemic stroke]. ZHurn. nevrologiiipsihiatrii. Insul't: prilozh. kzhurn. [Jour. neurology and psychiatry. Stroke: Appl. to the journal], 2002, no. 5, pp. 3-16. (In Russ.; abstr. in Engl.).
5. Kosolapov V.A., Spasov A.A., Anisimova V.A. Izuchenie antiradikal'-noj aktivnosti novyh soedinenij metodami hemilyuminescencij [The study of the anti-radical activity of new compounds by chemiluminescence]. Biome-
dicinskaya himiya [Biomedical Chemistry], 2005, Vol. 51, no. 3, pp. 287-294. (In Russ.; abstr. in Engl.).
6. Lankin V.Z., Gurevich S.M., Burlakova E.B. Izuchenie askorbat-zavisimogo perekisnogo okisleniya lipidov tkanej pri pomoshchi testa s 2-tiobarbiturovoj kislotoj [The study of ascorbate-dependent peroxidation of tissue lipids by a test with 2-thiobarbituric acid]. Trudy moskovskogo obshchestva ispytatelej pri-rody [Proceedings of the Moscow Society of Naturalists], 1975, Vol. 52, pp. 73-78. (In Russ.; abstr. in Engl.).
7. Men'shikova E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z. i dr. Okislitel'nyj stress: Patologicheskie sostoyaniya i zabolevaniya [Oxidative stress: Pathological conditions and diseases]. Novosibirsk: ARTA, 2008. 284 p.
8. Giasson B.I., Ischiropoulos H., Lee V.M. et al. The relationship between oxida-tive/nitrative stress and pathological inclusions in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Free Radic. Biol. Med., 2002, Vol. 32, pp. 1264-1275.
9. Izenman A.J. Modern Multivariate Statistical Techniques Regression, Classifi-cation, and Manifold Learning. Springer Texts in Statistics, 2008.
10. Mitra I., Sahay A., Roy K. Chemometric QSAR modeling and in silico design of antioxidant no donor phenols. Sci. Pharm., 2011, Vol. 79, pp. 31-57 [Elec-tronic resource]. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC3097501/.
11. Molecular Similarity in Drug Design. Ed. P.M. Dean. Dordrecht: Springer-Science + Business Media B.V., 2012. 342p.
12. Verma J., Khedkar V.M., Coutinho E.C. 3D-QSAR in drug design, a review. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2010, Vol. 10, pp. 95-115.
Контактная информация
Косолапов Вадим Анатольевич - д. м. н., профессор кафедры фармакологии и биоинформатики, Волгоградский государственный медицинский университет, е-таП: vad-ak@mail.ru
