Направленная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в энтодерму Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

Направленная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в энтодерму

Одной из наиболее сложных задач в развитии методов направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток [ЭСК] считается индукция их развития по энтодермаль-ному пути. Вместе с тем, решение этой проблемы позволит вплотную подойти к получению клеток поджелудочной железы и печени для их последующей трансплантации больным людям. Об актуальности такой работы говорит хотя бы тот факт, что число страдающих сахарным диабетом 1-го типа приближается во всем мире к 60 млн. Недавно группа калифорнийских исследователей из компании CyThera Inc. заявила, что получила обнадеживающие результаты в этом направлении [1].

В ходе онтогенеза энтодерма млекопитающих обособляется в первую фазу гаструляции - в ходе деляминации [расслоения эпибласта с образованием экто- и энтодермы]. В дальнейшем, в соответствии с учением Н.Г. Хлопина, этот зародышевый листок дает начало эпителиям энтодермального типа - эпителию желудка, кишечника, печени, желчевыво-

дящих путей и желчного пузыря, поджелудочной железы [рис.]. Еще в середине ХХ века было отмечено, что эпителии этого типа плохо поддаются культивированию in vitro [2].

Традиционной моделью для изучения энтодермального эпителия служит эпителий желточного мешка, что, естественно, учитывает их гистогенетическое единство [см. рис.]. Именно с этими клетками были проведены эксперименты по направленной дифференцировке под влиянием факторов микроокружения - мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) [3]. Показано, что в отсутствии влияния мезенхимы клетки энтодермы дифференцируются в клетки слизистого типа, но только при кокультивировании с ММСК - в типичные энтероциты с выраженной щеточной каемкой. В последнее время удалось наблюдать образование слоя клеток в культуре с синтезом морфофункционально полноценной базальной мембраны [4, 5].

Ряд исследователей считает, что для перспективного клинического применения работы с ЭСК представляются

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1 (3), 2006

I I I I I I

Ш

Новости клеточных технологий

наиболее целесообразными. Кроме того, in vitro система дифференцировки ЭСК служит отличной моделью эмбриогенеза. Калифорнийские авторы применили оригинальную методику культивирования этих клеток с пониженным содержанием сыворотки и в присутствии активина А - представителя суперсемейства TGF-p. Через 5 дней культивирования до 80% клеток культуры демонстрировали экспрессию генов энтодермальной дифференцировки - SOX17, FOXA2. В дальнейшем клетки были очищены при помощи положительной селекции по поверхностному рецептору CXCR4, при этом частота выделенной популяции стремилась к 100%. Через 5 недель после трансплантации этих клеток под почечную капсулу иммунодефицитным мышам обнаружили сформированные эпителиодные структуры, образующие однослойные мембраны.

Иммуногистохимическое исследование на основные энто-дермальные маркеры [CDX2, Villin - маркеры кишечного эпителия, HSA - специфический печеночный антиген) показало, что данные клетки способны in vivo прогрессивно реализовывать энтодермальную программу дифференцировки.

□б особом методе направленной дифференцировки ЭСК по энтодермальному пути было заявлено и ранее группой Ron McKay [6], однако работа была выполнена с клетками мыши. Авторы интуитивно обогатили нестин-по-зитивную популяцию производных ЭСК культивированием в бессывороточной среде. Затем на клетки воздействовали ростовыми факторами - FGFb и никотинамидом. Были получены клетки, экспрессирующие основные гены эпителия энтодермального типа, однако количество инсулин положительных клеток составило всего 31,5%. Клетки in vitro организовывались в подобие островков Лангерганса и часть клеток которых продуцировала глюкагон и соматос-татин. Были получены положительные результаты при трансплантации их животным с моделью сахарного диабета, однако по непонятным причинам публикации результатов дальнейших исследований не было.

□чевидно, что вопрос о получении гепатоцитов стоит не так остро как с р-клетками поджелудочной железы, ведь они способны делиться в зрелом состоянии и могут быть получены в ходе биопсии. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы в клинике явно не покрывает существующие сегодня потребности и осуществляется лишь в нескольких центрах. Альтернативный метод клеточного трансплантационного лечения сахарного диабета 1 -го типа - пересадка клеток костного мозга, пока не имеет вразумительного теоретического объяснения. Так, по данным различных исследователей трансдифференцировка клеток костного моз-

га в инсулин-продуцирующие клетки остается весьма спорной [7]. Несмотря на это, в отечественной практике данное направление уже используется клиницистами [8].

Разработка способов индукции направленной энтодермальной дифференцировки ЭСК животных и человека может привести к созданию не только методов коррекции различных патологий, но и стать одним из существенных аргументов в пользу продолжения исследований с этим материалом. Будущие исследования будут направлены на получение максимального количества дифференцированных клеток из ЭСК с чистотой приближающейся к 100%.

Схема строения зародыша млекопитающего на ранних стадиях развития [сагиттальный срез):

1 — собственно зародыш; 2 — область будущей кишки; 3 — полость желточного мешка; 4 — область закладки сердца у краниального конца зародыша; 5 — кровяные островки; 6 — хорион По L.B. Агеу [1974), с изменениями

ЛИТЕРАТУРА:

1. D'Amour K.A., Agulnick A.D., Eliazer S. et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005; 23[12):1534-41.

2. Хлопин Н.Г. Общебиологические и экспериментальные основы гистологии. - АН СССР; 1946.

3. Loncar D. Ultrastructural analysis of differentiation of rat endoderm in vitro. Adipose vascular-stromal cells induce endoderm differentiation, which in turn induces differentiation of the vascular-stromal cells into chondrocytes. J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 1992; 24[4):509-19.

4. Ishizuya-Oka A., Mizuno T. Intestinal cytodifferentiation in vitro of chick stomach endoderm induced by the duodenal mesenchyme. J. Embryol. Exp. Morphol. 1984; 82:163-76.

5. Fowler K.J., Mitrangas K., Dziadek M. In vitro production of Reichert's membrane by mouse embryo-derived parietal endoderm cell lines. Exp. Cell Res. 1990; 191[2):194-203.

6. Lumelsky N., Blondel O., Laeng P. et al. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 2001; 292[5520):1389-94.

7. Берсенев А.В. Инсулин-продуцирующие клетки поджелудочной железы из костного мозга и новые надежды в лечениии диабета: миф или реальность? http://celltranspl.ru/science/publications/ ?MESSAGES[1]=SHOW_PUBUCATIONS.PUBUCAT ION_ID=366.

8. Шахов Н.Л., Атамонов С.Д., Сускова В.С. и др. Первый клинический опыт использования аутологичных гемопоэтических клеток для коррекции нарушений при сахарном диабете первого типа. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2005; 3: 48.

Подготовил Р.В. Деев По материалам Nat. Biotechnol. 2005; 23(12): 1534-41

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1 (3), 2006