CC BY
14
I
НАНОСТРОЕНИЕ ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН ЭОЗИНОФИЛОВ У ПАЦИЕНТОВ С ТОКСОКАРОЗОМ
Т. П. Бондарь, Н. М. Ишкова, Е. А. Мельченко
NANO-STRUCTURE OF EOSINOPHILE MEMBRANE SURFACE OF PATIENTS WITH TOXOCARIASIS
Bondar T. P., Ishkova N. M., Melchenko E. A.
The conditions of clinical manifestation and course of toxocariasis are considered in the article on the basis of studying eosinophile morphometry and morphological peculiarities and their spissitude characteristics.
В статье рассматриваются условия клинического проявления и протекания заболевания токсокароза на основе изучения мор-фометрических и морфологических особенностей эозинофилов и их плотностных характеристик.
Ключевые слова: токсокароз, эозинофи-лы1, зондовая сканирующая микроскопия, на-ностроение клеточной мембраны.
УДК 621.385.833:616-076:616.155.35:616-093/-098
Токсокароз (собачья аскарида) - зоо-нозная инвазия, основным источником которой являются собаки, выделяющие яйца токсокар во внешнюю среду. Заражение происходит при заглатывании яиц находящихся на коже рук, пищевых продуктах, воде. Возможно заражение при непосредственном контакте с загрязненной землей или шерстью животных. Чаще заражаются дети до 6 лет, в связи с более тесным контактом с домашними животными и недостаточными гигиеническими навыками. Возбудитель -нематода семейства Anisakidae рода Toxocara. Заболевание распространено повсеместно. Чаще всего случаи заболевания регистрируются на территории Южного, Центрального, Уральского, Западно-Сибирского регионов Российской Федерации (2).
Токсокароз характеризуется полиморфизмом клинических проявлений, обусловленным миграцией личинок токсокар по различным органам и тканям. Антигены мигрирующих личинок, выделяющиеся в процессе их жизнедеятельности или гибели, повреждают ткани, вызывая некротические, геморрагические, воспалительные изменения.
Маскируясь под различную патологию, токсокароз характеризуется длительным рецидивирующим течением (от нескольких месяцев до нескольких лет), что связано с периодическим возобновлением миграции личинок токсокар (5). Токсокаро-зом болеют как дети, так и взрослые, хотя у детей это заболевание встречается чаще.
Бондарь Т. П., Ишкова Н. М., Мельченко Е. А.
Наностроение поверхности мембран эозинофилов у пациентов с токсокарозом
Существенное значение в постановке диагноза токсокароза имеет эпидемиологический анамнез. Указание на тесный контакт с собаками, наличие привычки пикацизма (поедание мела, земли, откусывание ногтей) свидетельствуют об относительно высоком риске заражения личинками (3).
Лабораторная диагностика токсокароза затруднена. Обнаружение яиц токсокар в кале не является диагностическим критерием для постановки диагноза. Ориентировочным скрининго-вым тестом для всех паразитарных заболеваний является общий анализ крови, с подсчетом лейкоцитарной формулы. Изменения в гемограмме неспецифические, выявляется гипохромная анемия, лимфоцитоз, эозинофилия (4). Сочетание комплекса данных эпидемиологического анамнеза, эозинофилии, и лейкоцитоза в крови, служит показанием дальнейшего обследования пациента на токсокароз. Диагностика токсокароза основана на обнаружении антител в сыворотке крови.
В современной литературе эозинофильный гранулоцит принято рассматривать в качестве активного участника развития аллергических заболеваний и противогельминтного иммунитета. В настоящее время выделяют две основные субпопуляции этих клеток, различающиеся по своей плотности за счет гранул, что отражает функциональную активность эозинофилов. Эозино-филы нормальной плотности получили название нормодансных, пониженной - гиподанс-ных (4). Изучение количества эозинофилов при гельминтозах является обязательным рутинным анализом. Однако сопоставления биохимической активности эозинофила с формой и строением мембраны клеток на наноуровне, полученном с помощью сканирующего зондового микроскопа, в научной литературе не встречалось.
Целью нашего исследования явилось изучение наностроения поверхности мембран в зависимости от биохимических характеристик нормодансных и гиподансных эозинофилов у пациентов с токсокарозом.
Материалы и методы исследования. Всего было обследовано 85 жителей Ставропольского края, обратившихся в Краевой гельминтологический центр или находившихся на стационарном лечении в отделениях Краевой инфекционной больницы с установленным клинически и подтвержденным лабораторными методами диагнозом - токсокароз. Контрольную группу составили 15 здоровых людей, добровольно согласившихся участвовать в исследовании.
Исследование на наличие ^О антител к антигенам токсокар проводилось с помощью им-муноферментной тест-системы «Тиатрис», выпускаемой ЗАО «Вектор-Бест» (чувствительность метода - 91%, специфичность - 85%), в клинико-диагностической лаборатории Ставропольской Краевой инфекционной больницы.
Подсчет количества эозинофилов и оценка плотности гранул осуществлялись методом световой микроскопии препаратов, окрашенных по Романовскому-Гимзе (7). Визуальное подтверждение плотностных характеристик клеток проводилось с помощью морфометрических параметров на аппаратно-программном комплексе «МЕКОС-Ц».
Основываясь на том факте, что усиление цитотоксичности эозинофилов может быть определено их повышенной дегрануляцией, нами была проведена реакция на присутствие перок-сидазы в цитоплазме эозинофилов. Препараты окрашивались по методу Эпштейна. Принцип данного метода основан на том, что после действия энзимов на субстраты, образуются окрашенные, плохо растворимые вещества, являющиеся либо непосредственно продуктами ферментативной реакции, либо возникшими при участии этих продуктов. Степень окрашивания оценивалась микроскопически в баллах от 0 до 3 (1).
Изучение закономерностей изменения структурных свойств мембраны эозинофилов нормальной и пониженной плотности на субнанометровом пространственном разрешении, методом сканирующей зондовой микроскопии, проводилось при помощи атомно-силового микроскопа «Интегра Прима» в ИТЦКП «Нанотехнологии и наноматериалы» Ставропольского государственного университета.
В сканирующих зондовых микроскопах исследование нанорельефа поверхности проводился с помощью специальным образом приготовленных микрозондов. Прибор производит «ощупывание» объекта. Для исследования структуры на основе органических материалов и биологических объектов применяется колебательный (полуконтактный) метод атомно-силовой (сканирующей) микроскопии (АСМ), основанный на регистрации параметров взаимодействия колеблющегося кантилевера с поверхностью (6).
Подвод образца осуществлялся после предварительного обнаружения эозинофила в оптическом микроскопе при увеличении 10х40 и 10х100. Для помещения препарата на предметный столик, с помощью стеклореза выделяли интересующую зону размером 10х10 мм. Сканирование одного участка проводилось несколько раз в различных режимах, с последующей обработкой изображения.
Попытка установить молекулярные изменения в топологии мембраны эозинофилов была предпринята в режиме полуконтактной резонансной атомно-силовой микроскопии с использованием зонда N80-20 (8). АСМ эозинофилов позволила получить двухмерное и трехмерное изображение мембраны изучаемых клеток.
Результаты исследования и обсуждение. В результате оценки полученных данных были установлены некоторые особенности. Так, титры антител к токсокарам у всех обследованных составляли 1:600 и выше, что с большей степенью вероятности подтверждает предположенный клинически диагноз.
Количество эозинофилов в лейко-формуле больных токсокарозом было повышенным в 87% случаев (у 74 человек) и колебалось в пределах от 6 до 19% при общепринятой норме 0-5%. При этом у 53 человек (62,3%) визуально по характеру и размеру гранул выявлены эозинофилы с пониженной плотностью.
Атомно-силовая микроскопия эозино-филов позволила получить двухмерное и трехмерное изображение мембраны изучаемых клеток (6). На трехмерном изображении поверхности четко выявлялись глобулы, предположительно, являющиеся частью мембранных интегральных и полуинтегральных белков, фрагментов гликокаликса, а также выступающие над поверхностью гранулы и ядро. Сканированное изображение препарата крови с эозинофилом в двух- и трехмерном изображении представлены на рисунках 1 и 2.
Рисунок 2. Образец периферической крови человека с эозинофилом. Трехмерная модель изображения, полученного с помощью полуконтактной АСМ
Рисунок 1. Образец периферической крови человека с эозинофилом. Двухмерная модель изображения, полученного с помощью полуконтактной АСМ
ы
Ш Бондарь Т. П., Ишкова Н. М., Мельченко Е. А. Наностроение поверхности мембран эозинофилов у пациентов с токсокарозом
Сравнение изображения мембраны показало вариацию размеров клеток по видимой ширине, высоте и длине. При этом оболочка эозинофилов имела хорошо различимую структурированную поверхность. Многослойные структуры на изображениях замечены не были. Размеры клеток варьировали в зависимости от плотности имеющихся в эозинофилах гранул. Перепад высот рельефа мембран эозинофилов составлял от 250 нм до 800 нм. Размеры клеток колебались в пределах 8-18 мкм по длине и ширине. Высота гранул гиподансных эозинофилов не превышала 450 нм. Изображение гиподансных эозинофилов с гранулами низкой плотности в двух- и трехмерном изображении представлены на рисунках 3 и 4.
Гранулы нормальной и высокой плотности встречались в нормодансных эозинофилах единично в периферической крови у больных токсокарозом и преимущественно у здоровых людей. Высота гранул нормодансных эозино-филов имела перепад от 500 до 800 нм. Изображение нормодансных эозинофилов с гранулами нормальной плотности в двух- и трехмерном изображении представлены на рисунках 5 и 6.
После окрашивания препаратов крови на присутствие пероксидазы в эозинофилах по методу Эпштейна и выявления гиподансных клеток с дегрануляцией определилась закономерность высоты стояния эозинофила, определенная методом атомно-силовой микроскопии, от уровня пероксидазы в клетке. Так, эозино-филы, имеющие в своем составе значительное количество пероксидазы (гиподансные) имели более низкую высоту рельефа, чем эозинофилы с низким содержанием фермента в клетке.
Таким образом, проведенные нами ис-
Рисунок 3. Эозинофил периферической крови человека с гранулами низкой плотности. Двухмерная модель изображения, полученного с помощью полуконтактной АСМ
Рисунок 4. Эозинофил периферической крови человека с гранулами низкой плотности. Трехмерная модель изображения, полученного с помощью полуконтактной АСМ
Рисунок 5. Эозинофил периферической крови человека с гранулами нормальной плотности. Двухмерная модель изображения, полученного с помощью полуконтактной АСМ
Рисунок 6. Эозинофил периферической крови человека с гранулами нормальной плотности. Трехмерная модель изображения, полученного с помощью полуконтактной АСМ
в
следования позволили получить изображения мембран эозинофилов, показали характерные особенности наноструктуры поверхности мембран, в зависимости от плотности гранул эозино-филов и биохимического состава цитоплазмы. Благодаря внедрению новых технологий появилась возможность детального изучения морфометрических и морфологических особенностей эозинофилов и их плотностных характеристик.
Установлено, что у больных токсокарозом, подтвержденным высоким титром специфических антител, отмечается в периферической крови повышенное количество гиподансных эо-зинофилов, характеризующихся высоким содержанием пероксидазы в цитоплазме, дегрануля-цией и низкой высотой рельефа наноповерхности клеточной мембраны.
1. Альтгаузен А. Я. Лабораторные клинические исследования. - М., 1962. - С. 114-115.
2. Антонов Н. Н., Антонова Л. П., Бабченко И. В., Лаврова В. П. Тканевые гельминтозы у взрослых и детей (эпидемиология, клиника, лечение, профилактика) // Методические рекомендации 3.2.1. -04. - СПб., 2004. - 29 с.
3. Лобзин Ю. В., Козлов С. С. Руководство по инфекционным болезням с атласом инфекционной патологии. - СПб.: Феникс, 2007. - 932 с.
4. Луговская С. А., Морозова В. Т., Почтарь М. Е., Долгов В. В. Лабораторная гематология. - М.: Изд-во ЮНИМЕД-пресс, 2002. -120 с.
5. Лысенко А. Я., Владимирова Н. Г., Кондрашина А. К. Клиническая паразитология. - Женева, 2002. - С. 65-66.
6. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. - М.: Изд-во Техносфера, 2005.
7. Пирашвили И. С. К методике подсчета эозинофилов в периферической крови // Лабораторное дело. -1962. - № 3. - С. 20-22.
8. Binnig G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy//Helv. Phys. Acta. - 1982. - V. 55. - P. 726-735.
Бондарь Татьяна Петровна, Ставропольский государственный университет, д-р мед. наук, профессор, заведующая кафедрой физико-химических основ медицины, лабораторной диагностики и фармакологии медико-биолого-химического факультета. Автор более 230 научных работ. Сфера научных интересов -клиническая лабораторная диагностика, гемоцитология, компенсаторные системы крови, физиология и патофизиология крови. bondar_@mail.ru
Ишкова Наталия Михайловна, Ставропольская краевая клиническая больница, заведующая клинико-диагностической лабораторией, соискатель кафедры физико-химических основ медицины, лабораторной диагностики и фармакологии. Сфера научных интересов - клиническая лабораторная диагностика, гема-тоцитология, диагностика паразитарных инфекций. bondar_@mail.ru
Мельченко Евгений Александрович, Ставропольския государственный университет, кандидат мед. наук, ведущий сотрудник ИТЦКП «Нанотехнологии и наноматериалы», старший преподаватель кафедры физико-химических основ медицины, лабораторной диагностики и фармакологии. Сфера научных интересов - зондовая сканирующая микроскопия. bondar_@mail.ru
ЛИТЕРАТУРА
Об авторах
