CC BY-ND
15
Февраль №2 (203) знисо
41
НАНОРАЗМЕРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ С ЦЕЛЬЮ ГИГИЕНИЧЕСКОГО НОРМИРОВАНИЯ
Е.А. Сопова, О.А. Ганковская, В.И. Баранов, В.Ф. Лавров, В.В. Зверев
NANO-DIMENSIONAL COMPOUNDS AND THE PROSPECTS OF RAPID DETERMINATION OF THEIR CYTOTOXIC CHARACTERISTICS WITH THE PURPOSE OF HYGIENIC STANDARDIZATION
E.A. Sopova, O.A. Gankovskaya, V.I. Baranov, V.F. Lavrov, V.V. Zverev
ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
Токсические свойства наносоединений значительно отличаются от соответствующих характеристик их массивных аналогов. Продемонстрирована способность наночастиц (НЧ) различной природы преодолевать гематоэнцефалический барьер, накапливаться в печени, почках, гонадах, селезенке, проникать в ткани головного мозга. В опытах с использованием в качестве субстрата культивирования перевиваемых эпителиальных клеток Vero установлена высокая цитоток-сическая активность наноформ ряда металлов и других химических соединений. Обнаружен противовирусный эффект, вызываемый наносеребром в культуре клеток Vero, инфицированных вирусом простого герпеса 2 типа, который выражался в опосредованном НЧ серебра подавлении репродуктивных возможностей вирусного агента. Разработан лабораторный метод ускоренного определения цитотоксической активности нанопорошков in vitro.
The article shows that toxic properties of nanoformations differ from relevant characteristics of their massive analogues. The authors demonstrate the ability of nanoobjects of different kind to overcome the hematoencephalic barrier, to accumulate in hepar, nephros, gonads, spleen, to penetrate into cerebral tissue. In tests with the usage of finite epithelial cells Vero as substance of cultivation the authors have determined high cytotoxic activity of nanoforms belonging to the metals range and other chemical compounds. There was found out antiviral effect induced by nanosilver in cell culture Vero infected with herpes simplex of the 2 type which was expressed in suppression of the viral agent's reproductive capacity mediated by nanoobjects of silver. There was elaborated the laboratory method of rapid determination of cytotoxic activity of nanopowders in vitro.
Реализация Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноинду-стрии в РФ на 2008—2010 годы» предполагает увеличение промышленного производства на-номатериалов, технология которых во многом основана на получении нанопорошков и их последующем переделе (компактировании). Сложившаяся ситуация в области развития нанотехнологий по ряду оценок аналогична ситуации, возникшей в канун всеобщей компьютерной революции, однако, последствия нанореволюции будут, по-видимому, обширнее и глубже.
Нанотехнологии входят в сферу исследовательской и производственной деятельности, связанной с созданием и использованием материалов, размер первичных структур которых не превышает 100 нм. Наночастицы (НЧ) обладают отличными от соответствующих массивных образцов, свойствами, которые связаны с относительным увеличением в их поверхностных слоях количества атомов, имеющих электронную структуру, существенно отличающу-
юся от структуры атомов, находящихся внутри объема НЧ. Доля поверхностных атомов возрастает по мере уменьшения размера НЧ, вследствие чего ноноразмерные соединения приобретают необычные физико-химические характеристики, происходит увеличение их реакционной способности и каталитической активности. Кроме того, во многих случаях отмечается значительное повышение цитоток-сических свойств НЧ [1; 2]. В процессе эволюции человечество постоянно подвергалось влиянию наноразмерных объектов (продуктов извержения вулканов, НЧ, образующихся вследствие лесных пожаров, ураганов и др.), однако, только резкий рост индустриального развития привел к многократному усилению опасности влияния нанообъектов на здоровье человека и среду его обитания. Это связано с массовым появлением антропогенных источников ультрадисперсных соединений (двигатели внутреннего сгорания, тепловые электростанции и т. д.), а также в связи с масштабным увеличением производства и реали-
42
ЗНиСО Февраль №2 (203)
зации наноматериалов. Есть все основания полагать, что в ближайшие годы антропогенный «пресс» на окружающую нас природную среду со стороны ноноразмерных соединений будет усиливаться. Появление новой дисциплины, нанотоксикологии — науки о наноструктурах и искусственно созданных ноноустройствах, изучающей результаты их воздействия на живой организм, также является следствием грядущей нанореволюции. Исследование массового распространения наноструктур, включая золото, серебро, кремний, титан, вольфрам и другие, промышленно значимые элементы, изучение их потенциальной опасности (через воздух, воду или почву) для здоровья людей, становится приоритетным.
В ряде научных публикаций говорится о высокой цитотоксической активности НЧ металлов в культуре клеток. Установлено, что НЧ серебра размером 25, 80 и 130 нм и их агломераты способны интенсивно поглощаться клетками печени и альвеолярными макрофагами крыс, соответственно, линий BRL3A и МАС, нейроэндокринными клетками РС-12 in vitro, быстро ассоциироваться с элементами их плазматических мембран, проникать в цитоплазму клеток. НЧ серебра размером 15 и 100 нм оказывали токсическое действие на клетки печени крыс линии BRL3A в концентрациях от 5 до 50 мкг/мл, которое заключалось в увеличении проницаемости клеточных мембран для лактатдегидрогеназы, повреждении митохондрий, а также вызывали накопление в гепатоцитах перекисных соединений и снижение концентрации в клетках печени свободных тиолов. НЧ Fe3O4, Al, MoO3 и TiO2 в сопоставимых концентрациях подобных эффектов не вызывали [3]. Исследование биоактивных свойств НЧ оксидов, сульфидов, и селенитов титана, железа, кадмия и цинка показало, что цитотоксические возможности указанных наносоединений достоверно превышают таковые соответствующих объемных структур [4]. При изучении распределения и накопления НЧ золота размером 5 нм в органах и тканях беспородных мышей и крыс было показано, что максимальное количество на-ноформ металла концентрируется в селезенке, главным образом, в тонком слое клеток, на границе между белой и красной пульпой. В печени крыс нанозолото обнаруживали, преимущественно, в купферовских клетках (в ЦНС — в оболочках головного мозга) в течение 10 суток после парентерального введения. Было установлено, что нанозолото, скопив-
шееся в клетках ретикуло-эндотелиальной системы, стимулирует процесс пролиферации гепатоцитов и способствует формированию в печени очагов экстрамедуллярного кроветворения. Однако, была продемонстрирована также эмбриотоксическая и тератогенная активность наносоединений золота [2]. Показан дозозависимый цитотоксический эффект НЧ диоксида кремния размером 15 и 46 нм в культуре клеток бронхоальвеолярной карциномы человека [5].
Цель работы — изучение особенностей действия нанопорошков различного химического состава и дисперсности (кремний, серебро, вольфрам и их модификации) на различные биологические объекты (лабораторные животные, культивируемые in vitro клетки, вирусы). Было установлено, что токсический эффект, вызываемый НЧ, в значительной степени отличается от токсического действия традиционных порошков. Так, в опытах in vivo было показано, что НЧ диоксида кремния, карбида вольфрама и серебра нарушают проницаемость гематоэнцефалического барьера, проникая в нейроны головного мозга. Отмечено, что НЧ размером 15—60 нм достаточно быстро попадают из легочной ткани в клетки печени, почек, гонады, головного мозга [6; 7]. НЧ вольфрам-углеродной шихты размером 15 нм, через 7 дней после интратрахеального введения обнаруживались в головном мозге крыс в концентрации в 6 раз превышающей контрольные значения [8]. Беспородным лабораторным крысам интратрахеально вводили нанодисперсный (15—20 нм) кремниевый порошок, который затем с помощью электронной микроскопии выявлялся в клетках эндотелия капилляров, легочных альвеол, паренхиматозной ткани печени и почек. НЧ кремния локализовались в цитоплазме клеток и клеточных органеллах, в т. ч. митохондриях и ядрах. При этом наряду с НЧ кремния, внутри ядер клеток часто обнаруживались, соразмерные с ними и более крупные биообъекты (возможно бактериальной или вирусной природы). Необходимо отметить, что многие ядра клеток, содержащие данные биообъекты, имели отчетливые признаки апоптоза в виде конденсации, фрагментации, периферической локализации хроматина и разрушения кариолеммы. Результаты исследований указывают на возникновение в организме лабораторных животных разнообразных физиологических реакций, возникающих под воздействием нанопорош-ков, и проявляющихся в виде окислительного
Февраль №2 (203) знсо
43
стресса, нарушения продукции цитокинов, апоптоза [6; 7]. Изучение особенностей действия нанопорошков серебра, диоксида кремния, вольфрама и карбидов вольфрама in vitro (в культуре клеток Vero) показало, что НЧ серебра размером 60—80 нм в концентрации от 1,0 мг/мл до 0,075 мг/мл полностью разрушают монослой клеток. При добавлении к клеткам НЧ диоксида кремния полная деструкция монослоя наступала при его концентрации от 1,0 до 0,1 мг/мл. НЧ вольфрама размером 25 и 50 нм, обладали выраженным цитотокси-ческим действием в концентрациях от 1,0 до 0,1 мг/мл. Карбид вольфрама, модифицированный кобальтом, размером 50 нм, проявлял цитотоксические свойства уже в концентрации 0,01 мг/мл, вызывая деструкцию 35 % клеточного монослоя, что было обусловлено, по-видимому, наличием в этом химическом соединении молекул кобальта. По мере уменьшения концентрации исследуемых наносоеди-нений в культуральной среде, уровень их ци-тотоксической активности также постепенно снижался [9]. Кроме того, был установлен прямой и клеточно-опосредованный противовирусный эффект наносеребра in vitro, который выражался в значительном снижении репродуктивных способностей вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) под воздействием НЧ серебра в культуре клеток. Степень противовирусной активности наносеребра была прямо пропорциональна количеству НЧ, внесенных в культуру клеток с одновременным инфицированием клеток вирусом, или зависела от концентрации НЧ серебра, используемых для прямой обработки вируса in vitro, перед заражением искомым вируссодержащим материалом, культуры клеток [9].
Известно, что основными «входными воротами» организма человека для наноразмер-ных соединений являются респираторный и пищеварительный тракты [1]. После вдыхания НЧ оседают на всем протяжении дыхательных путей и, благодаря высокой проникающей способности, преодолевают плазматическую мембрану клеток, а также используют другие механизмы проникновения в цитоплазму, например, рецепторный эндоцитоз. Биологические барьеры организма, предотвращающие обычно проникновение крупных (массивных) объектов, не обеспечивают защиту от проникновения НЧ. В связи с этим особое внимание должно уделяться изучению способности НЧ преодолевать гематоэнцефалический и плацентарный барьеры. Необходимо исследовать
молекулярные механизмы воздействия НЧ на клетки, клеточные органеллы, изучить вероятность возникновения синергидного цитопа-тического эффекта НЧ и соразмерных с ними вирусных агентов, учитывая возможность появления НЧ-опосредованного «пути» заражения клеток вирусами.
Кроме того, необходимо учитывать, что нанопорошки одних и тех же химических соединений, полученные с помощью различных технологий (плазмохимический и химико-металлургический методы, электрический взрыв проводников, разложение нестабильных соединений и т. д.), могут отличаться по физико-химическим характеристикам и, соответственно, оказывать различное влияние на организм человека. Ввиду этого, нанопорошки из каждой полученной партии, должны подвергаться отдельной токсикологической оценке. Учитывая длительность традиционных токсикологических исследований и существенные материальные затраты при их проведении, назрела необходимость в разработке быстрых, точных и экономически рентабельных методов предварительного лабораторного тестирования токсичности наноматериалов с целью прогнозирования их потенциальной опасности для здоровья человека. В лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИВС им. И.И. Мечникова был разработан экспресс-метод первичной (предварительной) токсикологической оценки нанопорошков, позволяющий в сжатые сроки (в течение 24—48 ч) определять их цитотоксические свойства in vitro. Суть метода заключается в определении цитотоксической активности НЧ с использованием стандартизованной перевиваемой культуры клеток Vero, источником которой являются эпителиальные клетки почек зеленой африканской мартышки, традиционно применяемые в вирусологических исследования [9; 10].
Вывод. Для обоснования токсикологической оценки и гигиенического регламентирования наноматериалов в различных средах необходимо:
1. проведение стандартизации методов оценки дисперсности и определения площади удельной поверхности наносоединений;
2. исследование особенности токсического действия нанопорошков на биологические объекты in vitro и in vivo с учетом физико-химических характеристик поверхности, дисперсности и способа получения НЧ;
44
ЗНиСО ФИШ №2 (203)
3. изучение клеточных и молекулярных механизмов действия НЧ in vivo, пути их накопления в организме, распределение в органах и тканях и способы выведения в окружающую среду.
Таким образом, учитывая широкое распространение наноматериалов в современном промышленном производстве и связанное с этим возникновение реальной угрозы здоровью людей во время их получения и последующей переработки, а также в результате распространения и возможного накопления нано-продуктов в окружающей среде (воздухе, воде, почве), оценка гигиенической безопасности наносоединений приобретает приоритетное значение.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Володин А.С., Шапошников А.А., Баранов В.И. Медико-экологические и гигиенические аспекты в чрезвычайных ситуациях. Защита здоровья человека от воздействия вредных факторов. М. 2008. 381 с.
2. Лебкова Н.П., Баранов В.И. Внутриклеточные изменения в гепатоцитах крыс и влияние на них уридина при интратрахе-альном введении высокодисперсного диоксида кремния //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. М. 2006. Т. 141. № 5. С. 596-600.
3. 11. Skebo J.A., Grabinski C.M., Schrand A.M., et al. Assessment of metal nanoparticle agglomeraction, uptake, and interaction using higt-illuminating system //Int. J. Toxicol. 2007. Vol. 26. № 2. Р. 135-141.
4. Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M., et al. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat l iver cells //Toxicol. In vitro. 2005. Vol. 9. № 7. Р. 975-983.
5. Brayner R., Ferrari-Iliou R., Toxicological Impact Studies Based on Escherichia coli
Bacteria in Ultrafine ZnO Nanoparticles Colloidal Medium //Nano letter. 2006. Vol. 6. № 4. Р. 866—870.
6. Лебкова Н.П., Баранов В.И. Ультраструктурные и цитохимические изменения в респираторном отделе легких при соче-танном воздействии высокодисперсного диоксида кремния и уридина //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины M. 2004. Т. 137. № 6. С. 633—637.
7. Сопова E.A., Ганковская O.A., Баранов В.И., Лавров В.Ф. Изучение влияния нанопорошков серебра и диоксида кремния на развитие герпесвирусной инфекции (экспериментальное исследование) //Сб. науч. трудов. Aктуaльные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. M., Вып. 9. 2009. С. 346—350.
8. Adili A., Crowe S., Beaux M.F., Cantrell T. et al. Differential cytotoxicity exhibited by silica nanowires and nanoparticle. Nanotoxicology. 2008. Vol. 2. Iss. 1. Р. 1—8.
9. Цветков Ю.И., Баранов В.И., Казенас Е.К. и др. Исследование распределения нано-порошков карбида вольфрама в органах животных с применением метода атомно-эмиссионной спектрометрии с индукционной плазмой //Перспективные материалы. M., 2008. №4. С. 52—57
10. Баранов В.И., Лавров В.Ф., Сопова E.A., Ганковская O.A. Экспресс-метод определения цитотоксичности и противовирусной активности наночастиц //Maте-риалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. M. 2007. С. 57—58.
11. Глушкова A^., Радилов A.Q, Рембов-ский В.Р. Нанотехнологии и нанотоксико-логия — взгляд на проблему //Токсикологический вестник. M. 2007. № 6. С. 4—8.
