CC BY-ND
15
40
ЗНиСО
МАЙ №5 (218)
НАНОРАЗМЕРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ С ЦЕЛЬЮ ГИГИЕНИЧЕСКОГО НОРМИРОВАНИЯ
Е.А. Сопов, О.А. Ганковская, В.И. Баранов, В.Ф. Лавров, В.В. Зверев
NANOSIZED CONNECTIONS AND PROSPECTS FOR ACCELERATED DETERMINATION OF THEIR CYTOTOXIC PROPERTIES WITH THE PURPOSE
OF HYGIENIC STANDARDIZATION
E.A. Sopov, O.A. Gankovskaya, V.I. Baranov, V.F. Lavrov, V.V. Zverev
ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава, НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
Показано, что токсические свойства наносоединений значительно отличаются от соответствующих характеристик их массивных аналогов. Продемонстрирована способность наночастиц (НЧ) различной природы преодолевать гематоэн-цефалический барьер, накапливаться в печени, почках, гонадах, селезенке, проникать в ткани головного мозга. В опытах с использованием в качестве субстрата культивирования перевиваемых эпителиальных клеток Vero установлена высокая цитотоксическая активность наноформ ряда металлов и других химических соединений. Обнаружен противовирусный эффект, вызываемый наносеребром в культуре клеток Vero, инфицированных вирусом простого герпеса 2 типа, который выражался в опосредованном НЧ серебра подавлении репродуктивных возможностей вирусного агента. Разработан лабораторный метод ускоренного определения цитотоксической активности нанопорошков in vitro.
Ключевые слова: гематоэнцефалический барьер, цитотоксическая активность на-ноформ, ультрадисперсные соединения.
The article shows that the toxic properties of nano-connections differ significantly from the corresponding characteristics of their bulk counterparts. The ability of nanoparticles (NP) of different nature to overcome the blood-brain barrier, accumulate in the liver, kidney, ovary, spleen, and penetrate into the brain tissue is demonstrated. A high cytotoxic activity of nanoforms of number of metals and other chemical compounds was installed during experiments using transplanted epithelial cells Vero as a substrate of cultivation. The authors have discovered an antiviral effect caused by nanosilver in cell culture Vero, infected with herpes simplex virus of type 2, which was expressed in indirect NP silver suppression of reproductive capacity of viral agent. A laboratory method for rapid determination of cytotoxic activity of nanopowder in vitro was developed.
Keywords: blood-brain barrier, cytotoxic activity of nanoforms, detonation compound.
Реализация Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноинду-стрии в РФ на 2008—2010 годы», предполагает увеличение промышленного производства на-номатериалов, технология которых во многих случаях основана на получении нанопорош-ков и их последующем переделе (компактиро-вании). Сложившаяся ситуация в области развития нанотехнологий по ряду оценок аналогична ситуации, возникшей в канун всеобщей компьютерной революции, однако, последствия нанореволюции будут, по-видимому, обширнее и глубже.
Нанотехнологии входят в сферу исследовательской и производственной деятельности, связанной с созданием и использованием материалов, размер первичных структур которых не превышает 100 нм. Наночастицы (НЧ) обладают отличными от соответствующих массивных образцов, свойствами, которые связаны с относительным увеличением в их поверх-
ностных слоях количества атомов с электронной структурой, существенно отличающейся от структуры атомов, находящихся внутри объема НЧ. Доля поверхностных атомов возрастает по мере уменьшения размера НЧ, вследствие чего ноноразмерные соединения приобретают необычные физико-химические характеристики, происходит увеличение их реакционной способности и каталитической активности. Кроме того, во многих случаях отмечается значительное повышение цитоток-сических свойств НЧ [1; 2]. В процессе эволюции человечество постоянно подвергалось влиянию наноразмерных объектов (продуктов извержения вулканов, НЧ, образующихся вследствие лесных пожаров, ураганов и др.), однако, только резкий рост индустриального развития привел к многократному усилению опасности влияния нанообъектов на здоровье человека и среду его обитания. Это связано, главным образом, с массовым появлением ан-
МАЙ №5 (218)
41
тропогенных источников ультрадисперсных соединений (двигатели внутреннего сгорания, тепловые электростанции и т. д.), а также в связи с масштабным увеличением производства и реализации наноматериалов. Есть все основания полагать, что в ближайшие годы антропогенный «пресс» на окружающую нас природную среду со стороны ноноразмерных соединений будет усиливаться. Появление новой дисциплины — нанотоксикологии — науки о наноструктурах и искусственно созданных ноноустройствах, изучающей результаты их воздействия на живой организм, также является следствием грядущей нанореволюции. Исследование массового распространения наноструктур, включая золото, серебро, кремний, титан, вольфрам и другие, промышленно значимые элементы, изучение их потенциальной опасности (через воздух, воду или почву) для здоровья людей приобретают приоритетное значение.
В ряде научных публикаций указывается на высокую цитотоксическую активность НЧ металлов в культуре клеток. Так, установлено, что НЧ серебра размером 25, 80 и 130 нм и их агломераты способны интенсивно поглощаться клетками печени и альвеолярными макрофагами крыс, соответственно, линий BRL3A и МАС, нейроэндокринными клетками РС-12 in vitro, быстро ассоциироваться с элементами их плазматических мембран, проникать в цитоплазму клеток [11]. НЧ серебра размером 15 и 100 нм оказывали токсическое действие на клетки печени крыс линии BRL3A в концентрациях от 5 до 50 мкг/мл, которое заключалось в увеличении проницаемости клеточных мембран для лактатдегидрогеназы, повреждении митохондрий, вызывали накопление в ге-патоцитах перекисных соединений и снижение концентрации в клетках печени свободных ти-олов. Примечательно, что НЧ Fe3O4, Al, MoO3 и TiO2 в сопоставимых концентрациях подобных эффектов не вызывали [10]. Исследование биоактивных свойств НЧ оксидов, сульфидов, и селенитов титана, железа, кадмия и цинка показало, что цитотоксические возможности указанных наносоединений достоверно превышают таковые соответствующих объемных структур [9]. При изучении распределения и накопления НЧ золота размером 5 нм в органах и тканях беспородных мышей и крыс было показано, что максимальное количество на-ноформ металла концентрируется в селезенке, главным образом, в тонком слое клеток, на границе между белой и красной пульпой.
В печени крыс нанозолото обнаруживали, преимущественно, в купферовских клетках, в ЦНС — в оболочках головного мозга, в течение 10 суток после парентерального введения. Было установлено, что нанозолото, скопившееся в клетках ретикуло-эндотелиальной системы, стимулирует процесс пролиферации гепатоцитов и способствует формированию в печени очагов экстрамедуллярного кроветворения. Однако, при этом была продемонстрирована эмбриотоксическая и тератогенная активность наносоединений золота [3]. Показан дозозависимый цитотоксический эффект НЧ диоксида кремния размером 15 и 46 нм в культуре клеток бронхоальвеолярной карциномы человека [8].
Цель данной работы — изучение особенностей действия нанопорошков различного химического состава и дисперсности (кремний, серебро, вольфрам и их модификации) на различные биологические объекты (лабораторные животные, культивируемые in vitro клетки, вирусы). В результате было установлено, что токсический эффект, вызываемый НЧ, в значительной степени отличается от токсического действия традиционных порошков. Так, в опытах in vivo было показано, что НЧ диоксида кремния, карбида вольфрама и серебра нарушают проницаемость гематоэн-цефалического барьера, проникая в нейроны головного мозга. Отмечено, что НЧ размером 15—60 нм достаточно быстро попадают из легочной ткани в клетки печени, почек, гонады, головной мозг [4,5]. НЧ вольфрам-углеродной шихты, размером 15 нм, через 7 дней после интратрахеального введения обнаруживались в головном мозге крыс в концентрации в 6 раз превышающей контрольные значения [7]. Беспородным лабораторным крысам ин-тратрахеально вводили нанодисперсный (15— 20 нм) кремниевый порошок, который затем с помощью электронной микроскопии выявлялся в клетках эндотелия капилляров, легочных альвеол, паренхиматозной ткани печени и почек. НЧ кремния локализовались в цитоплазме клеток и клеточных органеллах, в т. ч. митохондриях и ядрах. При этом наряду с НЧ кремния, внутри ядер клеток часто обнаруживались, соразмерные с ними и более крупные биообъекты, возможно, бактериальной или, вероятнее всего, вирусной природы. Необходимо отметить, что многие ядра клеток, содержащие данные биообъекты, имели отчетливые признаки апоптоза в виде конденсации, фрагментации, периферической локализации
42
ЗНиСО
МАЙ №5 (218)
хроматина и разрушения кариолеммы. Результаты исследований указывают на возникновение в организме лабораторных животных разнообразных физиологических реакций, возникающих под воздействием нанопорош-ков, и проявляющихся в виде окислительного стресса, нарушения продукции цитокинов, апоптоза [4,5]. Изучение нами особенностей действия нанопорошков серебра, диоксида кремния, вольфрама и карбидов вольфрама in vitro (в культуре клеток Vero) показало, что НЧ серебра размером 60—80 нм в концентрации от 1,0 до 0,075 мг/мл полностью разрушают монослой клеток. При добавлении к клеткам НЧ диоксида кремния полная деструкция монослоя наступала при его концентрации от 1,0 до 0,1 мг/мл. НЧ вольфрама размером 25 и 50 нм, обладали выраженным цитоток-сическим действием в концентрациях от 1,0 до 0,1 мг/мл. Карбид вольфрама, модифицированный кобальтом, размером 50 нм, проявлял цитотоксические свойства уже в концентрации 0,01 мг/мл, вызывая деструкцию 35 % клеточного монослоя, что было обусловлено, по-видимому, наличием в этом химическом соединении молекул кобальта. По мере уменьшения концентрации исследуемых наносое-динений в культуральной среде, уровень их цитотоксической активности также постепенно снижался [6]. Кроме того, нами был установлен прямой и клеточно-опосредованный противовирусный эффект наносеребра in vitro, который выражался в значительном снижении под воздействием НЧ серебра репродуктивных способностей вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) в культуре клеток. Степень противовирусной активности наносеребра была прямо пропорциональна количеству НЧ, внесенных в культуру клеток с одновременным инфицированием клеток вирусом, или зависела от концентрации НЧ серебра, используемых для прямой обработки вируса in vitro, перед заражением искомым вируссодержащим материалом, культуры клеток [6].
Известно, что основными «входными воротами» организма человека для наноразмер-ных соединений являются респираторный и пищеварительный тракты [2]. После вдыхания НЧ оседают на всём протяжении дыхательных путей и, благодаря высокой проникающей способности, преодолевают плазматическую мембрану клеток, а также используют другие механизмы проникновения в цитоплазму, например, рецепторный эндоцитоз. Биологические барьеры организма, обычно предот-
вращающие проникновение крупных (массивных) объектов, защиту от проникновения НЧ, как правило, не обеспечивают. В связи с этим особое внимание должно уделяться изучению способности НЧ преодолевать гема-тоэнцефалический и плацентарный барьеры. Необходимо исследовать молекулярные механизмы воздействия НЧ на клетки, клеточные органеллы, изучить вероятность возникновения синергидного цитопатического эффекта НЧ и, соразмерных с ними, вирусных агентов, учитывая, возможность появления НЧ-опосредованного «пути» заражения клеток вирусами. Кроме того, необходимо учитывать, что нанопорошки одних и тех же химических соединений, полученные с помощью различных технологий (плазмохимический метод, химико-металлургический метод, электрический взрыв проводников, разложение нестабильных соединений и т. д.), могут отличаться по физико-химическим характеристикам и, соответственно, оказывать различное влияние на организм человека. Ввиду этого, нанопо-рошки из каждой полученной партии, должны подвергаться отдельной токсикологической оценке. Учитывая длительность традиционных токсикологических исследований и существенные материальные затраты при их проведении, назрела необходимость в разработке быстрых, точных и экономически рентабельных методов предварительного лабораторного тестирования токсичности наноматериалов с целью прогнозирования их потенциальной опасности для здоровья человека. В лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН был разработан экспресс-метод первичной (предварительной) токсикологической оценки на-нопорошков, позволяющий в сжатые сроки (в течение 24—48 ч) определять их цитотоксиче-ские свойства in vitro. Суть метода заключается в определении цитотоксической активности НЧ с использованием стандартизованной перевиваемой культуры клеток Vero, источником которой являются эпителиальные клетки почек зеленой африканской мартышки, традиционно применяемые в вирусологических исследования [1,6].
С целью обоснования токсикологической оценки и гигиенического регламентирования наноматериалов в различных средах необходимо: а) провести стандартизацию методов оценки дисперсности и определения площади удельной поверхности наносоединений; б) исследовать особенности токсического действия
МАЙ №5 (218)
43
нанопорошков на биологические объекты in vitro и in vivo с учётом физико-химических характеристик поверхности, дисперсности и способа получения НЧ; в) изучить клеточные и молекулярные механизмы действия НЧ in vivo, пути их накопления в организме, распределение в органах и тканях и способы выведения в окружающую среду. Таким образом, учитывая широкое распространение наноматериалов в современном промышленном производстве, и связанное с этим возникновение реальной угрозы здоровью людей во время их получения и последующей переработки, а также в результате распространения и возможного накопления нанопродуктов в окружающей среде (воздухе, воде, почве), оценка гигиенической безопасности наносоединений приобретает приоритетное значение.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Володин А.С., Шапошников А.А., Баранов В.И.
Медико-экологические и гигиенические аспекты
в чрезвычайных ситуациях. Защита здоровья человека от воздействия вредных факторов. М., 2008. 381 с.
2. Глушкова А.В., Радилов А.С., Рембовский В.Р. Нанотехнологии и нанотоксикология — взгляд на проблему //Токсикологический вестник. M., 2007. № 6. С. 4—8.
3. Skebo J.A., Grabinski C.M., Schrand A.M., et al. Assessment of metal nanoparticle agglomeraction, uptake, and interaction using higt-illuminating system //Int. J. Toxicol. 2007. Vol. 26. № 2. Р. 135-141
4. Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M., et al. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells //Toxicol. In vitro. 2005. Vol. 9. № 7. Р. 975—983.
5. Brayner R., Ferrari-Iliou R., Toxicological Impact Studies Based on Escherichia coli Bacteria in Ultrafine ZnO Nanoparticles Colloidal Medium //Nano letter. 2006. Vol. 6. № 4. Р. 866—870.
Контактная информация: Сопов Е.А.
7 495 255-45-80, 7495 255-54-14
Contact information: Sopov E.A.
7 495 255-45-80, 7495 255-54-14
