CC BY
22
УДК 574.6: 577.1 (061.3)
Гупта М.1, Гоял Р.К.1, Базиков И.А.2, Ефременко А.А.2, Рубайло М.В.2
1DPSRUДелийский государственный фармацевтический университет, Нью-Дели, Индия 2ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, Ставрополь, Россия
НАНОЛИПИДНЫИ ГЕЛЬ НА ОСНОВЕ ТВЕРДЫХ ЛИПИДНЫХ ЧАСТИЦ С ЭНДОГЕННЫМИ АНТИМИКРОБНЫМИ ПЕПТИДАМИ
Целью исследования являлось получение нанолипидного геля и сравнительная оценка профиля высвобождения эндогенных антимикробных пептидов при сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, а также физико-химическая характеристика твердых липидных наночастиц in vitro. В исследовании использовали липидные наночастицы, состоящие из 100 мг твердого липида и 60 мг неионного поверхностно-активного вещества, а также 0,5 мл эндогенных антимикробных пептидов в общей липидной наночастице. Таким образом, выявлено, что липидные наночастицы, включенные в гель, показали несколько более медленное высвобождение по сравнению со свободными липидными наночастицами. Это объясняется различием между эффективными двойными барьерами диффузии, состоящими как из оболочки липидных, так и гелевых наночастиц. Ключевые слова: наночастицы, антимикробюные пептиды, гель.
Gupta M. 1, Goyal R K. 1, Bazikov I. A. 2, Efremenko A. A. 2, Rubailo M. V. 2
1 DPSRUDelhi State University of Pharmacy, New Delhi, India
2 FSBEI HE "Stavropol State Medical University" of the Ministry of Health of the Russian Federation, Stavropol, Russia
NANOLIPID GEL BASED ON SOLID LIPID PARTICLES WITH ENDOGENIC ANTIMICROBIAL PEPTIDES
The aim of the study was to obtain a nanolipid gel and preform comparative assessment of the release profile of endogenous antimicrobial peptides by scanning and transmission electron microscopy, as well as the physicochemical characteristics of solid lipid nanoparticles in vitro. We used lipid nanoparticles consisting of 100 mg of solid lipid and 60 mg of a nonionic surfactant, as well as 0.5 ml of endogenous antimicrobial peptides in a total lipid nanoparticle in the study. Thus, it was revealed that the lipid nanoparticles included in the gel showed a slightly slower release compared to free lipid nanoparticles. This is due to the difference between effective double diffusion barriers, consisting of both a shell of lipid and gel nanoparticles.
Keywords: nanoparticles, antimicrobial peptides, gel.
Актуальность. Антибиотикорезистент-ная микрофлора имеет высокую скорость распространения и представляет серьезную угрозу человечеству в условиях сопутствуюшего инфицирования при пандемии COVID-19. В этой связи эндогенные антимикробные пептиды (альфа и бэта-дефензины), выделенные нами ранее [2-10] являются альтернативой антибиотикам, не действующим на резистентную микрофлору. Для повышения эффективности применения в качестве носителей целесообразно использовать наночастицы с
направленной доставкой лекарственных молекул в поражённые ткани, к тому же, важной характеристикой наноконтейнеров является то, что помещенное активное вещество высвобождается постепенно и постоянно [1, 11-14]. Нанотехнологии обеспечивают устойчивое пролонгированное высвобождение, что определяет значительное преимущество, позволяющее проводить более безопасную терапию по сравнению с терапией, использующую свободные пептиды, которая требует более высоких доз и постоянного введения лекарств для
достижения аналогичного терапевтического эффекта. В конечном итоге это значительно оптимизирует эффективность лечения при инфекциях, обусловленных антибиотикорези-стентной микрофлорой. Целевая направленность действия антимикробных пептидов в значительной мере зависит от их профиля высвобождения из липидных наночастиц.
Целью исследования являлось получение нанолипидного геля и сравнительная оценка профиля высвобождения эндогенных антимикробных пептидов при сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, а также физико-химическая характеристика твердых липидных наночастиц in vitro.
Материалы и методы. В исследовании использовали липидные наночастицы, состоящие из 100 мг твердого липида и 60 мг неионного поверхностно-активного вещества, а также 0,5 мл эндогенных антимикробных пептидов в общей липидной наночастице. Способ получения липидных наночастиц осуществлялся при комнатной температуре и характеризовался следующими стадиями:
1. Получали липофильный раствор, состоящий из твердого липида и органического растворителя (этанол/ацетон (1:1 об./об.). Начальная стадия включала приготовление липофильного раствора путем растворения твердого липида при комнатной температуре в органическом растворителе, где доля твердого липида составляет 100 мг от общего количества твердых липидных наночастиц. Выбор органического растворителя обычно основан на липидном компоненте.
2. Получали водный раствор, состоящий из неионного поверхностно-активного агента и эндогенных антимикробных пептидов. Вторая стадия включала растворение неионного поверхностно-активного агента в водной среде, предпочтительно в воде. Пептиды растворяли вместе с водной фазой. Органический растворитель выбирали из ацетона и этанола и их смесей.
3. Добавляли липофильный раствор к водному раствору, далее полученную смесь подвергали механическому перемешиванию (Remi Instruments, Mumbai, India) при 4000 об/мин при комнатной температуре (25-28 °C) в течение 5 мин.
4. Выпаривали органический растворитель полученной эмульсии и доводили рН до
1,10 добавлением 0,1 М соляной кислоты из кислой водной фазы. Дисперсию липидных наночастиц синтезировали и центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 об/мин (Spin-win, Microcentrifuge, India), затем их повторно суспендировали в дистиллированной воде. Полученную дисперсию наночастиц обрабатывали ультразвуком в течение 2 мин.
Динамику высвобождения антимикробных пептидов из липидных наночастиц осуществляли морфологически с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM, Zeiss Evo18 Research) и по форме с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM, JEOL, Токио, Япония), используя медную сетку, покрытую углеродной пленкой и фосфорновольфрамовой кислотой (1 %; w/v) в виде отрицательного пятна. Фотонная корреляционная спектроскопия использовалась для расчета среднего размера (Z-среднее) и индекса полидисперсности (PI). Каждый анализ проводили в трех вариантах. Дзета потенциал определяли с помощью фотонной корреляционной спектроскопии с использованием нано-ZS90 Zetasizer (Malvern Instruments, Ltd., Мал-верн, Великобритания). Метод центрифугирования определял эффективность захвата суспензии SLN. Суспензию SLN (2 мл) центрифугировали для получения надосадочной жидкости при 25 000 об/мин в течение 10 минут в охлажденной центрифуге. После соответствующего разбавления свежим фосфатным буферным солевым раствором рН 7,4 собранную жидкость фильтровали для определения концентрации свободных пептидов. Поглощение измеряли при 364 нм на УФ-спектрофотометре (Shimadzu UV-1800, Япония). Все тесты были выполнены в трех вариантах липидных нано-частиц: 1) нативные, 2) с пептидами и 3) с пептидами в составе геля.
Результаты и обсуждение. Дисперсии были приготовлены в виде гелевой основы для накожного применения. Липидные наночасти-цы в значительной степени связываются с производными полимерами акриловой кислоты, такими, как карбопол. Благодаря гидрофильной природе и биоадгезионным свойствам липидных наночастиц они позволяют удерживать композицию в месте введения в течение длительного периода времени. Для получения геля использовали карбопол 934. Твердые липидные наночастицы представляют
собой частицы, внедренные в твердую матрицу. Матрица содержит липиды, которые являются твердыми в условиях комнатной температуры, помимо температуры тела. Твердый липид в природе при температуре 45 °С обладает способностью связываться с ненасыщенными или насыщенными жирными кислотами с триглицеридами. Твердый липид при комнатной температуре выбирали из тристеарина и триглицерида, полученного из трех молекул стеариновой кислоты. Липидные наночастицы дополнительно включали поверхностно-активное вещество, имеющее неионную природу. Термин «неионный» поверхностно-активный агент рассматривали как соединение, которое содержит гидрофобную часть вместе с гидрофильной частью, с помощью которой получали эмульсию. Неионный поверхностно-активный агент представлял собой такую смесью сополимеров, как полиоксиэти-лен и полиоксипропиленгликоль. В дальнейшем, характеристику липидных наночастиц осуществляли с помощью сканирующей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, что позволяло оценить профиль высвобождения пептидов.
Сканирующая электронная микроскопия подтвердила, что твердые липидные наноча-стицы имеют гладкую сферическую форму. Снимки просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа показали, что сферические частицы имеют однородный состав. Инкапсулированные пептиды имеют профиль высвобождения, характеризующийся взрывным высвобождением (начальное высвобождение), связанным с процентом связанных с субстратом молекул пептидов, далее профиль быстрого высвобождения от 4 часов до одного дня, затем фаза более медленного высвобождения от 1-3 дней, заканчивающуюся окончательным высвобождением пептидов. Ускорение скорости высвобождения пептидов на начальном уровне обусловлено высоким коэффициентом и короткими периодами диффузии в дополнение к наличию поверхностно-активных агентов, ускоряющих высвобождение пептидов из липидных наночастиц. Вы-
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Базиков И.А, Мальцев А.Н. Кремнийорга-нические ниосомы с бактерицидными и парамагнит-
свобождение активных веществ в течение длительного периода времени обусловлено внедрением пептида в матрицу твердого липида. Кроме того, высвобождение активных веществ контролируемым образом было результатом взаимодействия молекул поверхностно-активного вещества и липида, химической природы липидов, а также взаимодействия пептида и липида.
Установлено, что значения индекса полидисперсности (PDI) были меньше 0,5 в обоих составах, что подтверждает однородные размеры состава во всех случаях. Что касается дзета потенциала, то оба состава имели почти одинаковый поверхностный заряд, приблизительно -33,0 мВ. Кроме того, результаты показали, что твёрдые липидные частицы с пептидами имели возбуждение электронов около 68 %.
Исследование высвобождения проводили инкубацией 2 мл следующих составов: пептиды, твёрдые липидные частицы и твёрдые липидные частицы с пептидами в геле в течение 72 ч в 20 мл фосфатно-солевого буфера (pH 7,4). Среду высвобождения отделяли фильтрованием/центрифугированием через выбранные интервалы и заменяли тем же объемом фосфатно-солевого буфера. УФ-спектрофотометр измерял количество лекарственного средства при 364 нм (Shimadzu UV-1800, Япония).
Таким образом, выявлено, что липидные наночастицы, включенные в гель, показали несколько более медленное высвобождение по сравнению со свободными липидными нано-частицами. Это объясняется различием между эффективными двойными барьерами диффузии, состоящими как из оболочки липидных, так и гелевых наночастиц.
Профили высвобождения in vitro показали, что оба состава на основе наночастиц имели сходное высвобождение. Обнаружена двухфазная схема высвобождения, с первоначальным ускоренным высвобождением и последующим процессом медленного пролонгированного высвобождения, что было ранее показано при сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии.
REFERENCES
1. Bazikov I.A, Mal'cev A.N. Kremnijorganich-eskie niosomy s baktericidnymi i paramagnitnymi
ными свойствами. Патент на изобретение RUS 2625722 от 18.07 2017.
2.Базиков И.А., Мальцев А.Н., Седых О.И., Болатчиев А.Д. Разработка ниосомального лекарственного геля с альфа- дефензином hnp-1 // Психофизиология и психонейроэндокринология: материалы 4-й междунар. конф. Ставрополь, 2018. С. 87-89.
3.Базиков И.А., Мальцев А.Н., Седых О.И., Батурин В.А. Выделение эндогенных антимикробных пептидов из клеток крови // Бактериология. 2020. Т. 5. № 1. С. 33-36.
4.Базиков И.А., Мальцев А.Н. Способы выделения природных антимикробных пептидов из лейкоцитарной массы крови. Патент на изобретение № 2729016 от 04.08.2020.
5.Болатчиев А.Д., Батурин В.А., Базиков И.А. Антимикробный гель для лечения инфицированных ран, ожогов и трофических язв. Патент на изобретение RUS 2655522 от 28.05.2018.
6.Мальцев А.Н., Базиков И.А., Батурин В.А., Ефременко А.А., Лысогора Л.В. Выделение природных антимикробных пептидов из лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови // Оценка технологий здравоохранения: место инноваций в национальной системе здравоохранения. Персонализированная медицина: материалы 6-й Междунар. конференции. М., 2019. С. 138.
7.Мальцев А.Н., Базиков И.А., Седых О.И., Болатчиев А.Д., Ефременко А.А. Выделение антимикробных пептидов из плацентарной ткани // Биотехнология: взгляд в будущее : материалы 6-й Международной конференции. Ставрополь, 2020. С. 118.
8.Мальцев А.Н., Бейер Э.В., Базиков И.А., Седых О.И. Изучение острой токсичности ниосомаль-ного геля с антимикробными пептидами// Биотехнология: взгляд в будущее : материалы 6-й Междунар. конф. Ставрополь, 2020. С. 105.
9.Седых О.И., Бейер Э.В., Мальцев А.Н., Ба-зиков И.А. Макроскопическое изучение органов животных при применении антимикробных пептидов // Биотехнология: взгляд в будущее : материалы 6-й Междунар. конф. Ставрополь, 2020. С. 108.
10.Хералова Н.И., Базиков И.А., Мальцев А.Н., Седых О.И. [и др.] Эффект синергии эндогенных антимикробных и низкомолекулярных пептидов в составе ниосомального геля // Волгоградский научно-медицинский журнал. 2020. № 4. С. 33-36.
11. Bolatchiev A., Baturin V., Bazikov I., Maltsev A., Kunitsina E. Effect of antimicrobial peptides hnp-1 and hbd-1 on staphylococcus aureus strains in vitro and in vivo Fundamental and Clinical Pharmacology. 2020. Т. 34. № 1. Pp. 102-108.
12. Diskaeva E.I., Vecher O.V., Bazikov I.A., Maltsev A.N. Dispersion analysis of niosomes different composition // Journal of Nanoparticle Research. 2019. Т. 21, № 1. С. 21-23.
13. Vecher O.V., Diskaeva E.I., Bazikov I.A., Elbekyan K.S. Study of some rheological properties of niosomal dispersions of various concentrations based on PEG-12 dimethicone // 2020 Adv. Nat. Sci: Nanosci. Nanotechnol. 11 pp. 045007.
svojstvami. Patent na izobretenie RUS 2625722 ot 18.07 2017.
2. Bazikov I.A., Mal'cev A.N., Sedyh O.I., Bolatchiev A.D. Razrabotka niosomal'nogo lekarstvennogo gelya s al'fa- defenzinom hnp-1 // Psihofiziologiya i psi-honejroendokrinologiya: Materialy 4 mezhdunarodnoj konferencii. Stavropol' 2018. S.87-89.
3. Bazikov I.A., Mal'cev A.N., Sedyh O.I., Baturin V.A. Vydelenie endogennyh antimikrobnyh pepti-dov iz kletok krovi. Bakteriologiya. 2020. T. 5. № 1. S. 33-36.
4. Bazikov I.A., Mal'cev A.N. Sposoby vydeleni-ya prirodnyh antimikrobnyh peptidov iz lejkocitarnoj massy krovi. Patent na izobretenie №2729016 ot 04.08.2020.
5. Bolatchiev A.D., Baturin V.A., Bazikov I.A. Antimikrobnyj gel' dlya lecheniya inficirovannyh ran, ozhogov i troficheskih yazv. Patent na izobretenie RUS 2655522 ot 28.05.2018.
6. Mal'cev A.N., Bazikov I.A., Baturin V.A., Efremenko A.A., Lysogora L.V. Vydelenie prirodnyh an-timikrobnyh peptidov iz lejkocitarno-eritrocitarno-trombocitarnoj massy krovi // Ocenka tekhnologij zdra-voohraneniya: mesto innovacij v nacional'noj sisteme zdravoohraneniya. Personalizirovannaya medicina: mate-rialy 6-j Mezhdunar. konferencii. M., 2019. S. 138.
7. Mal'cev A.N., Bazikov I.A., Sedyh O.I., Bo-latchiev A.D., Efremenko A.A. Vydelenie antimikrobnyh peptidov iz placentarnoj tkani // Biotekhnologiya: vzglyad v budushchee. Materialy 6 mezhdunarodnoj kon-ferencii. Stavropol', 2020. S. 118.
8. Mal'cev A.N., Bejer E.V., Bazikov I.A., Sedyh
0.1. Izuchenie ostroj toksichnosti niosomal'nogo gelya s antimikrobnymi peptidami// Biotekhnologiya: vzglyad v budushchee. Materialy 6 mezhdunarodnoj konferencii. Stavropol', 2020. S.105.
9. Sedyh O.I., Bejer E.V., Mal'cev A.N., Bazikov
1.A. Makroskopicheskoe izuchenie organov zhivotnyh pri primenenii antimikrobnyh peptidov // Biotekhnologiya: vzglyad v budushchee. Materialy 6 mezhdunarodnoj kon-ferencii. Stavropol', 2020. S.108.
10. Heralova N.I., Bazikov I.A., Mal'cev A.N., Sedyh O.I., Baturin V.A., Ramesh K.G., Madhu G., Rubajlo M.V., Gurov D.YU. Effekt sinergii endogennyh antimikrobnyh i nizkomolekulyarnyh peptidov v sostave niosomal'nogo gelya //Volgogradskij nauchno-medicinskij zhurnal. 2020. № 4. S. 33-36.
11. Bolatchiev A., Baturin V., Bazikov I., Maltsev A., Kunitsina E. Effect of antimicrobial peptides hnp-1 and hbd-1 on staphylococcus aureus strains in vitro and in vivo Fundamental and Clinical Pharmacology. 2020. T. 34. № 1. Pp. 102-108.
12. Diskaeva E.I., Vecher O.V., Bazikov I.A., Maltsev A.N. Dispersion analysis of niosomes different composition // Journal of Nanoparticle Research. 2019. T. 21, № 1. C. 21-23.
13. Vecher O.V., Diskaeva E.I., Bazikov I.A., Elbekyan K.S. Study of some rheological properties of niosomal dispersions of various concentrations based on PEG-12 dimethicone // 2020 Adv. Nat. Sci: Nanosci. Nanotechnol. 11 pp. 045007.
14. Diskaeva E.I., Vecher O.V., Diskaeva E.N., Bazikov I.A., Elbekyan K.S. Review of methods for size and morphology determination of vesicles in niosome dispersion // Scientific and Technical Journal of Information Technologies, Mechanics and Optics, 2020. Vol. 20, No. 3, Pp. 377-381.
14. Diskaeva E.I., Vecher O.V., Bazikov I.A., Elbekyan K.S., Diskaeva E.N. Dependens of the viscosity coefficient of the niosomal dispersion on the temperature and particle size of the dispersed phase //Acta Polytech-nica. 2021. T. 61. № 2. C. 336-341.
14. Diskaeva E.I., Vecher O.V., Diskaeva E.N., Bazikov I.A., Elbekyan K.S. Review of methods for size and morphology determination of vesicles in niosome dispersion // Scientific and Technical Journal of Information Technologies, Mechanics and Optics, 2020. Vol. 20, No. 3, Pp. 377-381.
14. Diskaeva E.I., Vecher O.V., Bazikov I.A., Elbekyan K.S., Diskaeva E.N. Dependens of the viscosity coefficient of the niosomal dispersion on the temperature and particle size of the dispersed phase //Acta Polytech-nica. 2021. T. 61. № 2. C. 336-341.
Мадху Гупта - кандидат медицинских наук, доцент кафедры фармацевтики; Рамеш Гоял - доктор медицинских наук, профессор, ректор; Делийский государственный фармацевтический и исследовательский университет, г. Нью-Дели, Индия. Базиков Игорь Александрович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии; Рубайло Марина Викторовна - аспирант кафедры микробиологии Ставропольского государственного медицинского университета, г. Ставрополь, Россия. Базиков Филипп Игоревич -студент магистратуры факультета науки и технологий Миланского государственного университета, г. Милан, Италия. Ефременко Анна Александровна - доцент кафедры микробиологии Ставропольского государственного медицинского университета, г. Ставрополь, Россия.
УДК 57.083.13:577.1:579.841.93
Курилова А.А.1, Катунина Л.С.1, Сизоненко М.Н.2,. Тимченко Л.Д. 2, 2 111 Ржепаковский И.В. , Ковтун Ю.С. , Сердюк Н.С. , Коняева О.А. ,
Жилченко Е.Б.1, Жаринова Н.В.1
1ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, Ставрополь, Россия 2ФГАОУ ВО «Северо-Кавказский федеральный университет», Ставрополь, Россия
ИЗУЧЕНИЕ РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТА ГИДРОЛИЗАТА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ И ВНЕЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ПТИЦ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ БРУЦЕЛЛ
Изучено действие гидролизата, полученного из эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц, на рост тест-штаммов Brucella abortus 19 BA и B. melitensis Rev I. Контрольной средой служил агар Альбими. Изучаемая субстанция в составе плотной среды культивирования оказывала стимулирующий эффект. Полноценные колонии бруцелл формировались через 48 ч выращивания. Следовательно, данный гидролизат может применяться как стимулятор роста бруцелл в питательных средах.
Ключевые слова: гидролизат эмбриональных и внеэмбриональных тканей птиц, бруцеллы, стимулятор
роста.
Kurilova A.A. 1, Katunina L.S. 1, Sizonenko M.N. 2, Timchenko L.D. 2, Rzhepakovskiy I.V. 2, Kovtun Yu.S. 1, Serdyuk N.S. 1, Konyaeva O.A. 1, Zhilchenko E.B. 1, Zharinova N.V. 1
1FSHI Stavropol Research Anti-Plaque Institute (Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare)
2Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education NCFU
