CC BY
69
УДК 577.1:616-003.269:636
НАНОЧАСТИНКИ АУРУМУ ТА АРҐЕНТУМУ ЯК ПОТЕНЦІЙНІ КРІОПРОТЕКТОРИ ЗА ДОВГОТРИВАЛОГО ЗБЕРІГАННЯ ВИРОБНИЧИХ ШТАМІВ МІКРООРГАНІЗМІВ
М. Є. Романько1 Національний науковий центр «Інститут експериментальної
і клінічної ветеринарної медицини» НААН України, Харків Л. С. Рєзніченко2 2Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф. Д. Овчаренка
НАН України, Київ
Е-mail: marina_biochem@list.ru
Отримано 01.06.2012
Досліджено вплив наночастинок ауруму й арґентуму на показники проліферації, респіраторну активність, проникність клітинної оболонки, активність мембранної Н -АТР-ази і каталази, загальну антиокиснювальну активність бактеріальних клітин виробничих штамів Escherichia сoli та Pasteurella multocida після їх ліофілізації та довготривалого зберігання.
Встановлено, що в результаті оброблення наночастинками при концентрації за металом ауруму
1,93 мкг/мл та арґентуму — 8,64 мкг/мл бактеріальних клітин Escherichia та Pasteurella перед етапом ліофілізації спостерігається стимуляція приросту біомаси, модуляція активності ензимів клітинної енергетики, стабілізація клітинної оболонки й активація антиоксидантної активності клітин. Це є свідченням вираженої активації процесів репарації бактеріальних клітин на стадії їх регідратації під впливом досліджених наночастинок металів.
Виявлені особливості впливу досліджених наночастинок ауруму і арґентуму на клітини Escherichia та Pasteurella після їх ліофілізації/регідратації дають підстави для використання таких наночастинок як кріопротекторів та/або модуляторів у технології довготривалого зберігання виробничих штамів мікроорганізмів.
Ключові слова: виробничі штами мікроорганізмів, наночастинки, аурум, арґентум,
контактна взаємодія, ліофілізація/регідратація, довготривале зберігання.
Проблема виживаності бактеріальних клітин в умовах ліофілізації та довготривалого зберігання набуває особливої актуальності у разі промислово значущих виробничих штамів мікроорганізмів — продуцентів імунобіо-логічних препаратів. Це пов’язано з тим, що зневоднення клітин під час ліофілізації та подальше довготривале зберігання здатні спричинювати ушкодження їхньої структури і конформаційного стану біомолекул [1]. Результатом таких локальних і тотальних незворотних ушкоджень є загибель частини популяції, унаслідок чого виживаність клітин може знижуватися на 90% від початкової. Це призводить до значних економічних збитків, а в деяких випадках — до втрати унікальних виробничих штамів мікроорганізмів — продуцентів імунобіологічних препаратів [2, 3].
Збільшенню відсотка виживаності клітин в умовах ліофілізації та довготривалого зберігання сприяє використанню речовин,
що мають властивості кріопротекторів і біо-стимуляторів штамів мікроорганізмів.
Наночастинки металів, особливо ауруму й арґентуму, завдяки здатності стимулювати активність ензимів [4-6] та виявляти антиоксидантні властивості [7] є потенційно новим класом речовин, які можуть слугувати високоефективними протекторами і модуляторами (стимуляторами) клітин мікроорганізмів за умов їх ліофілізації та дов го тривалого зберігання.
У зв’язку з вищезазначеним завданням цієї роботи було вивчення впливу наночасти-нок ауруму і арґентуму на проліферацію, респіраторну активність, проникність клітинної оболонки, Н+-АТР-азну активність та стан показників антиоксидантної системи бактеріальних клітин виробничих штамів після їх ліофілізації/регідратації з метою визначення перспектив застосування наночастинок як протекторів за їх довготривалого зберігання.
Матеріали і методи
Об’єктом досліджень були виробничі штами мікроорганізмів: Escherichia сoli, штами № 20 (О147, має гени, що кодують утворення термостабільного (ST II) і термолабільного (LT I) ентеротоксинів; шиготок-сину (Stx2e), адгезивних антигенів F18, ентерогемолізину (Ehly), № 57 (О157, має гени, що кодують утворення шиготоксину (Stx2) та ентерогемолізину (Ehly), та Pasteurella multocida, штами № 606 (патогенний для сільськогосподарської птиці) і № 877 (патогенний для свиней) із колекції Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (Київ).
Використані в дослідженнях наноча-стинки ауруму (Au) та арґентуму (Ag) були синтезовані в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф. Д. Овчаренка НАН України (м. Київ) та охарактеризовані за фізико-хімічними параметрами і показниками біобезпеки [8, 9]. Середній розмір наночастинок металів — Au і Ag — становив 30 нм, вихідна концентрація — 19,3 і 86,4 мкг/мл за металом відповідно.
Оброблення бактеріальних клітин виробничих штамів наночастинками металів здійснювали перед етапом ліофілізації. Суспензію клітин інкубували при кімнатній температурі протягом 40 хв із відповідним типом наночастинок з кінцевою концентрацією 1,93 мкг/мл за металом для наночастинок Au і 8,64 мкг/мл — для Ag. Контролем слугувала суспензія клітин, які не контактували з наночастинками металів. Після інкубації до контролю та суспензії клітин
3 наночастинками додавали стерильне саха-розо-желатинове захисне середовище Фай-бича у співвідношенні 1:1 такого складу: 10% сахарози, 1% желатини. Підготовлену суміш розливали у пеніцилінові флакони та піддавали ліофілізації з попереднім заморожуванням за температури мінус (70±1) °С (ліофільне сушіння LP3, Франція). Процес ліофілізації вважали завершеним за умов, коли вміст залишкової вологи не перевищував 3%. Ліофілізовані препарати біомаси виробничих штамів мікроорганізмів зберігали в умовах вакууму за температури від
4 оС до 8 оС.
Візуалізацію взаємодії бактеріальних клітин виробничих штамів з наночастинка-ми металів проводили методом трансмісійної електронної мікроскопії (JEM-1230, JEOL, Японія).
Динаміку приросту біомаси (інтенсивність проліферації) клітин досліджуваних
штамів після ліофілізації та довготривалого зберігання впродовж 6 міс оцінювали за такою схемою: проводили регідратацію ліо-філізатів клітин мікроорганізмів, для чого за умов асептики до флакона з ліофілізатом додавали стерильний фізіологічний розчин. Вміст флакона після регідратації ретельно перемішували і переносили 0,5 мл вмісту до 4,5 мл стерильного МПБ. Інкубацію клітин здійснювали за температури (37±1) °С та визначали оптичну щільність суспензії регідратованих клітин у динаміці через 5,
12, 24, 36, 48 год — проти контрольного зразка, яким слугував МПБ. Визначення оптичної щільності проводили за довжини хвилі 630 нм, після чого перераховували отримані значення до КУО/мл за попередньо побудованими калібрувальними кривими.
Респіраторну активність (РА) вимірювали за допомогою кисневого електрода (тип АЖА 101.1 М, Білорусь) згідно з [10]. Вимірюваним параметром слугувала максимальна швидкість зниження концентрації кисню в середовищі вимірювання, приведена до одиниці біомаси клітин відповідного штаму (питома РА).
Проникність клітинної оболонки бактеріальних клітин оцінювали за вмістом у зовнішньому середовищі внутрішньоклітинних метаболітів, які поглинають світло за довжини хвиль (250-290) нм за методикою [11]. Зміни показників оптичної густини реєстрували спектрофотометрично із кроком 10 нм (СФ 46, Росія, кювета 1 см).
Для визначення стану біохімічних показників після ліофілізації та довготривалого зберігання виробничих штамів отримували мембранну фракцію бактеріальних клітин за методикою [12]. Отримані препарати мембранних фракцій кількісно характеризували за вмістом протеїну, визначеного методом Лоурі. Як стандартний протеїн для побудови калібрувальної кривої використовували BSA (бичачий сироватковий альбумін).
Величину питомої Н+-АТР-азної активності (КФ 3.6.3.6) мембранної фракції реєстрували за накопиченням неорганічного фосфату (Р^), концентрацію якого в середовищі інкубації такого складу (об’єм — 1 мл): 10 мМ трис-HCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ АТР (рН = 7,5) визначали методом Фіске-Субба-роу. Тривалість інкубації — 10 хв. Реакцію ініціювали введенням до середовища інкубації аліквоти мембранної фракції і зупиняли, додаючи 1 мл 10%-го розчину ТХОК.
Інтенсивність процесів окиснювальної модифікації протеїнів (ОМП) визначали за утворенням карбонільних похідних
нейтрального і основного характеру за методикою [13].
Стан антиокиснювальних реакцій оцінювали спектрофотометрично (UNICO 2100, США) за активністю каталази (КФ 1.11.1.6) (з використанням Н2О2) та рівнем загальної антиокиснювальної активності (АОА) клітин бактерій та їх сумарних мембранних фракцій [14, 15].
У роботі застосовували АТР, трис-гідро-ксиметиламінометан (Gibco RBL, Шотландія), інші реактиви — вітчизняного виробництва кваліфікації «ч. д. а.».
На графіках наведено середні значення параметрів не менш ніж 3 повторів у серії з 5 незалежних експериментів.
Статистичну обробку результатів проводили згідно з [16] із використанням критерію Стьюдента (Р < 0,05).
Результати та обговорення
Процес відновлення бактеріальних клітин після ліофілізації можна розділити на три стадії: регідратацію, структурну та функціональну репарацію і відновлення чисельності популяції шляхом розмноження тих клітин, що залишилися життєздатними.
Середній час регідратації становить від декількох секунд до декількох хвилин. На наступному етапі популяція переходить у лаг-фазу розвитку, в якій може відбуватися біохімічне відновлення ензимів, структурних компонентів, а також репарація частково ушкодженого генетичного матеріалу, час якої суттєво залежить від характеру та ступеня ушкоджень. Після завершення процесів структурної та функціональної репарації починається експоненціальний ріст, у результаті якого відновлюється чисельність популяції.
Стадія репарації, під час якої відбувається ліквідація ушкоджень клітинних структур, є ключовою в процесі відновлення клітин після ліофілізації [1].
Важливим фактором репарації є наявність необхідного рівня інтенсивності енергетичного обміну.
Наночастинки металів мають здатність впливати на інтенсивність енергетичних процесів бактеріальних клітин. Найбільшою мірою це притаманно наночастинкам Au і Ag [6].
Окрім того, високий рівень енергізації бактеріальних клітин є визначальним фактором їхньої здатності активно акумулювати наночастинки металів [17, 18].
Проведені нами дослідження показали, що бактеріальні клітини виробничих штамів як E. coli, так і P. multocida, виявляють здатність активно акумулювати наночастин-ки Au і Ag як на поверхні, так і всередині клітин. На рис. 1 на прикладі взаємодії штаму E. coli № 4 з наночастинками Au (А) та штаму E. coli № 20 з наночастинками Ag (Б) наведено типові електронно-мікроскопічні зображення, що ілюструють здатність бактеріальних клітин зв’язувати наночастинки металів середнього розміру 30 нм. Електронограми клітин E. coli дослідних штамів за контактної взаємодії з наночастинками металів отримані перед етапом ліофілізації.
Висока електронна щільність одержаних зображень свідчить про активне концентрування наночастинок металів та їх біотранс-формацію бактеріальними клітинами досліджуваних штамів. Це відкриває нові перспективи у визначенні потенційної ролі наночастинок Au і Ag розміром 30 нм як кріопротекторів і стимуляторів у технології ліофілізації та довготривалого зберігання виробничих штамів мікроорганізмів, передусім з метою стимуляції репарації клітин.
Рис. 1. Бактеріальні клітини штаму E. coli № 4 з акумульованими наночастинками Au (А) та штаму E. coli № 20 — з наночастинками Ag (Б).
Препарати не контрастовані. Наночастинки металів спостерігаються як електронно-щільні включення (показано стрілками)
Отримані експериментальні дані показали, що оброблення бактеріальних клітин штамів E. coli і P. multocida наночастинками металів перед етапом ліофілізації зумовлювало зміни основних фізіолого-біохімічних показників клітин, зокрема ростової активності, Н+-АТР-азної та респіраторної активності, які є ключовими системами трансформації енергії мікроорганізмами; рівня проникності клітинної оболонки, антиокис-нювальної активності. При цьому було виявлено біологічну видову специфічність особливостей такого впливу.
Так, характер кривих росту періодичних культур клітин P. multocida свідчить, що середній час їх лаг-фази був тривалим і становив 24 год, що може вказувати на негативний вплив процесу ліофілізації на функціональний стан цих клітин (рис. 2).
Культивування бактеріальних клітин P. multocida штаму № 606 у присутності наночастинок ауруму перед етапом ліофілізації призводило до значного скорочення періоду лаг-фази (до 5 год) (рис. 2, А). Це зумовлено зростанням потенціалу росту клітин цього штаму під впливом наночастинок
ауруму. Водночас наночастинки арґентуму не справляли такого впливу — характер кривої росту збігався з кривою росту періодичних культур клітин, ліофілізованих за стандартною схемою.
Для клітин P. multocida штаму № 877 введення наночастинок як Аи, так і Ag перед етапом ліофілізації не спричинювало скорочення часу лаг-фази, порівняно з контролем. Проте оброблення клітин наноча-стинками Ag сприяло стимуляції проліферації порівняно з контрольною кривою та кривою, що відображає ріст періодичних культур бактеріальних клітин, оброблених наночастинками Аи (рис. 2, Б).
Порівняно з дослідженими клітинами P. multocida накопичення біомаси клітин E. coli після ліофілізації характеризувалось періодом лаг-фази в межах норми (до 5 год) як для клітин, ліофілізованих за стандартною схемою, так і для таких, що були оброблені наночастинками металів обох типів (рис. 3, А, Б).
Проте слід відзначити інтенсифікацію приросту біомаси в експоненціальній фазі для періодичних культур бактеріальних
Б
Рис. 2. Проліферація бактеріальних клітин P. multocida штамів № 606 (А) та № 877 (Б), ліофілізованих за стандартною схемою (контроль) та оброблених перед ліофілізацією наночастинками Au (НЗ) і наночастинками Ag (НС)
Рис. 3. Проліферація бактеріальних клітин E. ^іі штамів № 20 (А) та № 57 (Б), ліофілізованих за стандартною схемою (контроль) та оброблених перед ліофілізацією наночастинками Au (НЗ) і наночастинками Ag (НС)
клітин штаму E. coli № 20 під впливом нано-частинок Au (рис. 3, А, крива НЗ) та для штаму № 57 — під впливом наночастинок Ag (рис. 3, Б, крива НЗ).
У табл. 1 наведено величини Н+-АТР-аз-ної і респіраторної активності бактеріальних клітин штамів Pasteurella та Escherichia, досліджених за умов ліофілізації.
З таблиці випливає, що Н+-АТР-азна актив ність клітин P. multocida штаму № 606 у разі оброблення наночастинками Au і Ag знижувалась, порівняно з контролем, на 40% і 10% відповідно. Водночас рівень РА клітин цього штаму зростав майже в 4 рази при обробленні наночастками Ag, але знижувався у 2 рази під впливом наночастинок Au.
Для клітин E. coli вплив наночастинок Au не призводив до суттєвих змін величини Н+-АТР-азної активності клітин, порівняно з контролем, тимчасом як оброблення клітин наночастинками Ag спричинювало вірогідне підвищення величини ензиматичної активності у 2,0 та 1,5 раза для штамів № 20 і № 57 відповідно.
Рівень респіраторної активності клітин штаму E. coli № 20 під впливом наночастинок обох типів зростав майже у 2 рази. Для клітин штаму E. coli №57 також відбувалась інтенсифікація РА майже на 30% у разі оброблення клітин наночастинками обох типів.
Отримані дані свідчать про неоднозначний вплив наночастинок Au і Ag на ключові
системи трансформації енергії як клітин різних видів бактерій, так і клітин різних штамів у межах одного виду.
Відомо, що за умов ліофілізації клітинна оболонка бактеріальних клітин унаслідок втрати вільної води і частини зв’язаної зазнає ушкоджень різного рівня, наслідками яких можуть бути зміни основних функцій, таких як бар’єрна, енергогенеруюча, транспортувальна [1]. Тому рівень проникності клітинної оболонки є важливим показником в оцінюванні загального стану клітини за умов її відновлення після ліофілізації і зберігання.
Показано, що рівень проникності клітинної оболонки бактеріальних клітин штаму E. coli № 20 знижувався в разі оброблення клітин наночастинками металів обох типів перед етапом ліофілізації, порівняно з контролем (рис. 4, А).
Для бактеріальних клітин штаму E. coli №57 оброблення наночастинками як ауруму, так і арґентуму перед етапом ліофілізації також сприяло зниженню рівня проникності клітинної оболонки порівняно з контролем. Оброблення клітин штаму P. multo-cida № 606 наночастинками металів обох типів не призводило до значних змін рівня проникності клітинної оболонки порівняно з контролем (дані не наведено).
Водночас, для бактеріальних клітин штаму P. multocida № 877 спостерігалось
Таблиця 1. Показники Н+-АТР-азної та респіраторної активності бактеріальних клітин штамів Pasteurella та Escherichia, ліофілізованих за стандартною схемою (контроль) і оброблених перед ліофілізацією наночастинками Au (НЗ) та Ag (НС) (М±ш; n = 5)
Штам Стан ліофілізації Н+-АТР-азна активність, мкмольРі/мгбхв РА, мг02/лмгбіомасихв
P. multocida № 606 Контроль 40,320±0,831 3,05±0,017
НЗ 25,543±0,454* 1,62±0,017*
НС 36,800±0,924* 11,19±0,103*
P. multocida № 877 Контроль 10,549±0,053 1,06±0,029
НЗ 16,101±0,161* 0,93±0,010
НС 13,785±0,119* 1,24±0,024
E. coli № 20 Контроль 11,917±0,014 0,31±0,009
НЗ 12,637±0,017 0,56±0,009*
НС 20,482±0,033* 0,487±0,003*
E. coli № 57 Контроль 10,428±0,019 0,69±0,012
НЗ 9,840±0,014 0,86±0,012*
НС 14,400±0,035* 0,89±0,007*
Примітка: * — різниця значень вірогідна за Р < 0,05 відносно регідратованих (після ліофілізації) клітин дослідних штамів без додавання наночастинок металу (контроль).
А
D
1.00 ->
0.00
- контроль НЗ НС
240 250 260 270
280 290 300
Довжина хвилі, нм
Б * 2.00 і
1.50
1.00
0.50
0.00
— контроль
— НЗ НС
240 250 260 270 280
290 300
Довжина хвилі, нм
Рис. 4. Рівень проникності клітинної оболонки (D) бактеріальних клітин E. coli штаму № 20 (А) та P. multocida штаму № 877 (Б), ліофілізованих за стандартною схемою (контроль) і оброблених перед
ліофілізацією наночастинками Au (НЗ) та Ag (НС)
підвищення рівня проникності клітинної оболонки під впливом наночастинок як Аи, так і Ag (рис. 4, Б).
Інтенсивність процесів модифікації протеїнів та показники антиокиснювальної регуляції їх деструкції є вагомими індикаторами стану обмінних процесів клітини.
Важливим стартовим чинником запуску механізмів окиснювання протеїнів і ліпідів є радикали О2 та інші активні молекули кисню (АМК). Ураження протеїнів і ліпідів як структурних компонентів біомембран призводить до порушення регуляції метаболізму та проникності мембран клітини, а згодом — до її загибелі. Так, зміна вмісту нена-сичених жирних кислот у мембрані впливає на ступінь плинності її ліпідних компонентів, а отже й на інтенсивність процесів ліпо-пероксидації, унаслідок чого вона в подальшому втрачає резистентність до низької температури та іншої негативної дії [19].
Аеробні та факультативно-аеробні бактерії використовують молекулярний кисень як кінцевий акцептор електронів. У результаті переходу електронів від кисню до води утворюються супероксид аніон (О-2) та пероксид водню (Н2О2) [20]. Аеробним прокаріотам і евкаріотам властиво використовувати набір захисних систем, що знижують ушкоджувальний ефект АМК [21].
Можливість використання наночастинок ауруму та арґентуму як протекторів у технології довготривалого зберігання виробничих штамів мікроорганізмів було визначено і шляхом оцінювання стану інтенсивності процесів ОМП та показників антиокиснювальної модифікації їх деструкції. У зв’язку з тим, що утворення продуктів окиснювання протеїнів може призводити до їх швидкого розкладання і деструкції, саме карбоніли ОМП є первинними маркерами протеїнового окиснювання [22]. Деградовані протеїни можуть міститися в клі-
тинах годинами і навіть днями, а продукти ліпопероксидації піддаються детоксикації вже через декілька хвилин [23].
Показано, що інтенсивність процесів ОМП за рівнем утворення карбонільних похідних у мембранних фракціях клітин P. multocida штаму № 606 достовірно не змінювалась під впливом наночастинок металів обох типів (табл. 2).
Для штаму P. multocida № 877 лише оброблення клітин наночастинками Ag спричинювало інтенсифікацію процесів ОМП у середньому в 2,5 раза порівняно з контролем. Наночастинки Au не впливали на інтенсивність цих процесів: вміст нейтральних і основних карбонільних похідних перебував на контрольному рівні.
У разі оброблення наночастинками металів обох типів рівень нейтральних похідних знижувався в середньому на 10% для клітин штаму E. coli № 20 та знаходився на рівні контролю для клітин штаму № 57, тоді як вміст основних похідних знижувався в середньому на 13% і 11% для клітин E. coli штамів №20 і №57 відповідно. Рівень похідних ОМП у мембранних фракціях E. coli дослідних штамів характеризувався лише тенденцією до змін, тобто не був вірогідним.
Показники антиокиснювальної активності за оброблення клітин штаму P. multocida № 606 наночастинками як Au, так і Ag достовірно не відрізнялись від контрольних значень, за винятком загальної АОА, величина якої знижувалась на 43%, порівняно з контролем, під впливом наночастинок Au (табл. 3).
Для клітин штаму P. multocida № 877 під впливом наночастинок металів обох типів спостерігали пригнічення активності ката-лази у 5 разів. Окрім того, оброблення цих клітин наночастинками Au і Ag призводило до зниження рівня загальної АОА, порівняно з контролем, на 20 та 40% відповідно.
Таблиця 2. Показники інтенсивності окиснювальної модифікації протеїнів у мембранних фракціях клітин Pasteurella та Escherichia, ліофілізованих за стандартною схемою (контроль) і оброблених перед ліофілізацією наночастинками Au (НЗ) та Ag (НС) (М±m; n =5)
Штам Стан ліофілізації Інтенсивність ОМП, карбонільні похідні
нейтрального характеру, ммоль/г протеїну основного характеру, ммоль/г протеїну
P. multocida №606 Контроль 728,57±11,2 538,10±11,45
НЗ 765,31±15,02 510,20±9,80
НС 733,65±12,64 533,65±11,36
P. multocida №877 Контроль 130,82±6,20 78,49±2,02
НЗ 119,51±2,84 76,31±1,13
НС 135,92±5,42* 193,88±2,84*
E. coli №20 Контроль 424,90±18,26 295,71±16,08
НЗ 410,82±6,56 310,35±15,62
НС 397,91±14,06 276,03±13,18
E. coli №57 Контроль 418,06±11,34 304,39±9,13
НЗ 421,57±12,05 289,84±14,60
НС 400,16±10,67 288,11±8,24
Примітка: тут і в табл. 3 * — різниця значень вірогідна заP < 0,05 відносно регідратованих клітин дослідних штамів без додавання наночастинок металу (контроль).
Таблиця 3. Показники антиокиснювальної активності мембранних фракцій клітин Pasteurella та Escherichia, ліофілізованих за стандартною схемою (контроль) і оброблених перед ліофілізацією наночастинками Au (НЗ) та наночастинками Ag (НС) (М±m; n = 5)
Штам Стан ліофілізації Активність каталази, нмоль Н2О2^с-1^(мг протеїну)-1 Загальна АОА, % інгібування
P. multocida №606 Контроль 363,64±8,92 46,30±3,33
НЗ 379,61±11,26 26,21±0,95*
НС 309,09±20,23 49,80±2,63
P. multocida №877 Контроль 179,82±1,48 30,87±2,80
НЗ 34,52±,08* 24,98±2,18 *
НС 33,76±0,84 * 18,43±1,92 *
E. coli №20 Контроль 6,23±0,92 70,80±1,53
НЗ 7,93±1,08 73,33±1,93
НС 20,43±1,02 * 67,73±1,07 *
E. coli №57 Контроль 13,21±1,82 29,33±0,53
НЗ 14,54±0,64 40,40±0,93*
НС 16,87±2,17 49,60±1,33*
Рівень каталазної активності достовірно не змінювався, порівняно з контролем, у разі оброблення клітин штаму E. coli № 20 наночастинками Au, однак зростав більш ніж утричі під впливом наночастинок Ag.
Для клітин штаму № 57 достовірних змін каталазної активності під впливом наночастинок металів обох типів, порівняно з контролем, не спостерігалось.
Водночас, оброблення бактеріальних клітин E. coli штамів № 20 та № 57 наноча-стинками металів призводило до різноспря-мованих змін величини загальної АОА. Так, для штаму E. coli № 20 рівень загальної АОА під впливом Au порівняно з контролем достовірно не змінювався, тоді як під впли-
вом Ag знижувався на 8%. Для клітин штаму № 57 реєстрували збільшення загальної АОА при обробленні клітин наночастинками Au і Ag на 40 та 70% відповідно.
Таким чином, у результаті проведених досліджень встановлено, що оброблення бактеріальних клітин виробничих штамів Escherichia та Pasteurella перед етапом ліофілізації наночастинками ауруму при концентрації за металом 1,93 мкг/мл та арґентуму — 8,64 мкг/мл стимулює проліферацію клітин дослідних штамів за приростом їх біомаси під час подальшого культивування в періодичних культурах.
Виявлена модуляція активності ензимів клітинної енергетики, стабілізація клітинної оболонки та активація антиоксидантної системи бактеріальних клітин виробничих штамів після їх оброблення наночастинками ауруму і арґентуму свідчать про виражену активізацію процесів репарації клітин на стадії їх регідратації.
Особливості біологічного впливу досліджених наночасток ауруму та арґентуму на клітини Escherichia та Pasteurella у процесі їх
ліофілізації/регідратації дають підстави для використання таких наночастинок як кріо-протекторів та/або стимуляторів їх життєздатності у біотехнології довготривалого зберігання виробничих штамів мікроорганізмів.
Водночас, слід враховувати виражену як видову, так і штамову специфічність реакції мікроорганізмів на присутність у середовищі наночастинок металів, виявлену після їх ліофілізації.
ЛІТЕРАТУРА
1. Харчук И. А. Анабиоз: основные понятия и сопровождающие его процессы // Экология моря. — 2005. — Вып. 70. — С. 62-78.
2. Hua L., WenYing Z., Hua W. et al. Influence of culture pH on freeze-drying viability of Oenococcus oeni and its relationship with fatty acid composition // Food Bioprod. Proces. — 2009. — N 87. — P. 56-61.
3. Пушкарь Н. С., Белоус А. М., Цветков Ц. Д. Теория и практика криогенного и сублимационного консервирования. — К.: Наук. думка, 1984. — 264 с.
4. Рєзніченко Л. С., Грузіна Т. Г., Вембер В. В. та ін. Вплив металів-мікроелементів на функціональний стан бактерій-пробіонтів // Укр. біохім. журн. — 2008. — Т. 80, № 1. — C. 96-101.
5. Maiti S., Das D., Shome A. et al. Influence of gold nanoparticles of varying size in improving the lipase activity within cationic reverse micelles // Chemistry - A European J. — 2010. — V. 16. — P. 1941-1950.
6. Романько М. Є., Рєзніченко Л. С., Грузіна Т. Г. та ін. Вплив наночастинок золота та срібла на АТР-азну активність нативних і регідра-тованих клітин Escherichia coli // Укр. біохім. журн. — 2009. — Т. 81, № 6. — С. 70-76.
7. BarathManiKanth S., Kalishwaralal K., Sri-ram M. et al. Antioxidant effect of gold nanoparticles restrains hyperglycemic conditions in diabetic mice// J. Nanobiotechnol. — 2010, 8:16. — http://www.jnanobiotechnology.com/ content/8/1/16.
8. Дибкова С. М., Романько М. Є., Грузіна Т. Г. та ін. Визначення ушкоджень ДНК наночастинками металів, перспективних для біо-технології // Біотехнологія. — 2009. — Т. 2, № 3. — С. 80-85.
9. Ушкалов В. О., Романько М. Є., Грузіна Т. Г. та ін. Визначення біобезпечності та біосу-місності наночастинок металів для потреб ветеринарної медицини // Вет. мед. України. — 2010. — № 6. — С. 30-33.
10. Грузина Т. Г., Вембер В. В., ЗадорожняяА. М. и др. Респираторная активность бактерий в биоэлектрохимической детекции тяжелых
металлов в водных середах // Хим. технол. воды. — 2005. — Т. 27, № 4. — С. 385-391.
11. Грузина Т. Г., Чеховская Т. П., Балаки-на М. Н. и др. Изучение ингибирующего влияния ионов свинца на клетки некоторых штаммов бактерий рода Pseudomonas // Укр. біохім. журн. — 2002. — Т. 74, № 2. — С.115-119.
12. Карамушка В. И., Ульберг З. Р., Грузина Т. Г. Роль мембранных процессов в накоплении золота Au (III) и Au (0) бактериями // Там же. — 1990. — Т. 62, № 1. — С. 76-82.
13. Арчаков А. И., Михосеев И. М. Моди -фикация белков активным кислородом и их распад // Биохимия. — 1998. — Т. 54, № 2. — С. 179-186.
14. Королюк М. А. Определение активности ката-лаз // Лаб. дело. — 1988. — № 1. — С. 16-18.
15. Клебанов Г. И., Бабенкова И. В., Тесел-кин Ю. О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб. дело. — 1988. — № 5. — С. 59-62.
16. Лакин Г. Ф. Биометрия: Уч. пособие для биологических специальностей ВУЗов // М: Высшая школа, 1990. — 352 с.
17. Данилович Г. В., Грузіна Т. Г., Ульберг З. Р. та ін. Ідентифікація та каталітичні властивості Mg2+-залежної АТР-гідролази плазматичних мембран Bacillus sp B 4253, здатних до накопичення золота // Укр. біохім. журн. — 2004. — Т. 76, № 5. — С. 45-51.
18. Данилович Г. В., Грузіна Т. Г., Ульберг З. Р. та ін. Вплив іонного та колоїдного золота на АТР-гідролазні ферментні системи в мембрані мікроорганізмів Bacillus sp B4253 та Bacillus sp В4851 // Там само. — 2007. — Т. 79, № 4. — С. 46-51.
19. Меньщикова Е. Б., Ланкин В. З., Бондарь И. А. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. — М.: Фирма «Слово», 2006. — 556 с.
20. Rocha E. R., Salby T., Coleman J. P. et al. Oxidative stress response in an anaerobe, Bacteroides fragilis: a role for catalase in protection against hydrogen peroxide //J. Bact. — 1996. — V. 178. — P. 6895-6903.
21. Tamarit J., Cabiscol E., Ros J. Identification of the major osidatively damaged proteins in Escherichia coli cells exposed to oxidative stress // J. Biol. Chem. — 1998. — V. 273, N 5. — P. 3017-3032.
22. Гуськов Е. П., Лукаш А. И. Избыточность фенотипа, оксигенный мутагенез и концепция буферного катаболизма. — Ростов
н/Д, 1986. — 20 с. — Деп. в ВИНИТИ
11.05.86, № 3363-В86.
23. Кения М. В. Динамика свободнорадикальных процессов и продуктов азотистого катаболизма в тканях системы крови при гипероксии: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. — Ростов н/Д, 1991. — 19 с.
НАНОЧАСТИЦЫ АУРУМА И АРГЕНТУМА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ КРИОПРОТЕКТОРЫ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
М. Е. Романько1, Л. С. Резниченко2
Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» НААН Украины, Харьков 2Институт биоколлоидной химии им. Ф. Д. Овчаренко НАН Украины, Киев
E-mail: marina_biochem@list.ru
Исследовано влияние наночастиц аурума и аргентума на показатели пролиферации, респираторную активность, проницаемость клеточной оболочки, активность мембранной Н+ -АТР-азы и каталазы, общую антиокислитель-ную активность бактериальных клеток производственных штаммов Escherichia coli и Pasteurella multocida после их лиофилизации и долговременного хранения. Установлено, что в результате обработки наночастицами при концентрации по металлу аурума 1,93 мкг / мл и аргентума — 8,64 мкг / мл бактериальных клеток Escherichia и Pasteurella перед этапом лио-филизации наблюдается стимуляция прироста биомассы, модуляция активности энзимов клеточной энергетики, стабилизация клеточной оболочки и активация антиоксидантной активности клеток. Это является свидетельством выраженной активации процессов репарации бактериальных клеток на стадии их регидратации под влиянием исследованных наночастиц металлов. Выявленные особенности влияния исследованных наночастиц аурума и аргенту-ма на клетки Escherichia и Pasteurella после их лиофилизации/регидратации дают основания для использования таких наночастиц как криопротекторов и/или модуляторов в технологии длительного хранения производственных штаммов микроорганизмов.
Ключевые слова: производственные штаммы микроорганизмов, наночастицы, аурум, аргентум, контактное взаимодействие, лиофи-лизация/регидратация, долговременное хранение.
AURUM AND ARGENTUM NANOPARTICLES AS POTENTIAL CRYOPROTECTORS IN THE LONG-TERM STORAGE OF MICROORGANISMS PRODUCTION STRAINS
M. Ye. Roman’ko1, L. S. Rieznichenko2
1National Scientific Center «Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine», Kharkiv 2Ovcharenko Institute of Biocolloidal Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: marina_biochem@list.ru
The effect of argentum and aurum nanoparticles and proliferation parameters, respiratory activity and permeability of cell membranes, the activity of the membrane H+-ATPase and cata-lase, total antioxidant activity of the bacterial cell of Escherichia coli and Pasteurella multoci-da after lyophilization and long-term storage were studied. It was determined that as a result of processing aurum nanoparticles at a concentration of 1.93 mg / ml in metal and argentum — 8,64 mg / ml bacterial cells Escherichia and Pasteurella before freeze-drying step stimulation of biomass growth, modulation of enzyme activity of cellular energetic, the stabilization of cell membranes and activation of the antioxidant activity of the cells were observed. This is an evidence of marked activation of repair processes of bacterial cells during their rehydration under the influence of metal nanoparticles studied. These features influence the investigated nanoparticles aurum and argentum on cells of Escherichia and Pasteurella after lyophilization/rehydration, afford grounds for using of nanoparticles as a crioprotectors and/or modulators in the technology of long-term storage of industrial strains of microorganisms.
Key words: industrial strains of microorganisms, nanoparticles, aurum, argentum, contact interaction, lyophilization/rehydration, longterm storage.
