CC BY
44
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ НАЛИЧИЕ ИММУНОГЕННОГО АНТИГЕНА... 23
УДК 616-006-097:611.018.83:576.385.5 1'2 13 1' 2 1'2 1 2 Т.В. Ахлынина ' , А.В. Мисюрин - , Н.А. Лыжко ' , Ю.П. Финашутина ' , В.А. Мисюрин , Е.В. Аксенова , И.Н. Солдатова1'2, А.П. Шпакова3, Б.Б. Хасигова , Т.И. Булычева3, О.С. Бурова1 НАЛИЧИЕ ИММУНОГЕННОГО АНТИГЕНА В ОПУХОЛЕВОЙ КЛЕТКЕ СПОСОБСТВУЕТ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОМУ ДЕЙСТВИЮ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК 1ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва 2ООО «ГеноТехнология», Москва 3ФГБУ Гематологический Научный Центр МЗ РФ, Москва Контактная информация Мисюрин Всеволод Андреевич, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной химиотерапии НИИ ЭДиТО адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(985)436-30-19 e-mail: vsevolod.misvurin@gmail.com Статья поступила 08.10.2014, принята к печати 24.11.2014. Резюме Недавно был обнаружен цитотоксический ответ ДК, направленный против ОК. В качестве условий для проявления этого эффекта указывали на необходимость мембранного контакта ме^ду ДК и ОК и предварительную неспецифическую стимуляцию ДК. Однако эти условия оказались недостаточными. Мы установили, что уровень антипролиферативного действия ДК напрямую связан с наличием опухолевого антигена в ОК. Нам удалось показать, что ещё одним необходимым условием является как нагрузка ДК специфическим опухолевым антигеном, так и наличие данного антигена в опухолевой клетке. Мы показали преимущества использования очищенного антигена для нагрузки ДК над стратегией использования лизата ОК в качестве смеси антигенов. Ключевые слова: дендритные клетки, антипролиферативное действие, PRAME, опухолевые клетки.
T.V. Ahlynina1'2, A.V. Misyurin1-3, N.A. Lyzhko1'2, Yu.P. Finashutina1'2, V.A. Misyurin1, E.V. Aksenova2, I.N. Soldatova1'2, A.P. Shpakova3, B.B. Hasigova , T.I. Bulycheva3, O.S. Burova1 PRESENCE OF IMMUNOGENIC ANTIGEN IN TUMOR CELLS PROMOTES ANTIPROLIFERATIVE EFFECT OF DENDRITIC CELLS 1FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Institute», Moscow 2«GeneTechniology», Moscow 3FSBI «Hematology Research Center», Moscow Abstract A special cytotoxic response of DC against TC has been discovered recently. There are two conditions critically need for the manifestation of this effect. First, it is a membrane contact between DC and the OC. Second, nonspecific pre-stimulation of DC is required. However, these conditions have not been sufficient. We have shown that additional necessary condition is the loading of DC with specific tumor antigen. Furthermore, the antigen should be exist in a tumor cell. We have shown the advantages of using purified antigen for activation of DC. Activated DC have inhibited the growth of antigen-positive TC successfully. We suppose that is better to use a pure antigen than a mixture of antigen for this effect. We found that the level of anti-proliferative effect directly depends on the presence of tumor antigen in OK. Key words: dendritic cells, cytotoxic action, PRAME, tumor cells. Введение нов, способны сами оказывать антипролиферативное действие на опухолевые клетки [30; 36; 40]. ДК В последние годы активно разрабатываются захватывают антигены из живых, апоптозных или новые методы терапии опухолевых заболеваний, в некрозных клеток [36]. После взаимодействия ДК с частности, методы иммунотерапии [2-7]. Основа- живыми опухолевыми клетками, опухолевые клет-нием для развития этих методов является то, что ки погибают, а их антигены захватываются ДК и некоторые опухоли являются иммуногенными. Из- представляются Т-лимфоцитам [28; 38], так же, как вестно, например, что клетки меланомы экспресси- и после захвата антигенов из апоптозных и некроз-руют на поверхности иммуногенные маркеры [35]. ных клеток. В ряде работ было показано, что липо-Эти маркеры способствуют развитию собственного полисахарид (ЛПС), который вызывает созревание иммунного ответа и регрессии опухоли. Частичная ДК, стимулировал ДК и приводил к усилению по-регрессия первичного очага наблюдается примерно давления роста опухолевых клеток [32; 34]. Но в в трети случаев, а в 1 - 2 % случаев может про- тоже время было показано, что в зависимости от изойти полная регрессия [17]. дозы ЛПС действие ДК на опухоли может быть ДК как АПК постоянно захватывают, пере- различным, как подавляющим, так и стимулирую-рабатывают и представляют антигены Т- и В- щим рост опухоли [37]. лимфоцитам. Распознав антиген, T- и Б-клетки ак- Таким образом, очевидно, что ДК могут кон-тивируются и осуществляют антиген-специфи- тролировать рост опухолей in vivo. Было показано, ческий ответ. что только при прямом контакте ДК с опухолевыми В то же время, в ряде работ было показано, клетками осуществляется подавление роста почто ДК, помимо презентации опухолевых антиге- следних [30; 32; 33].
№ 4/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Показано, что ЛПС не действует специфически, а только усиливает имеющуюся способность ДК секретировать факторы, угнетающие рост опухолевых клеток [30]. Таким образом, существует неизвестный фактор, который определяет возможность специфического взаимодействия ме^ду ДК и клетками опухоли, выраженного в антипролифера-тивном воздействии ДК против клеток-мишеней.
Мы предположили, что ДК осуществляют свою способность угнетать рост опухоли только в том случае, если они захватывают такой же антиген, которым обладает и опухолевая клетка. Согласно этому предположению, можно целенаправленно нагрузить ДК специфическим опухолевым антигеном для подавления роста опухоли, позитивной по данному антигену.
Очень важным является выбор опухолевого антигена для нагрузки ДК в условиях ex vivo [4-7; 21-26]. С этой целью используют лизаты опухолевых клеток, положительных по определённому маркеру [2; 9; 15; 27-29] или очищенные рекомби-нантные антигены.
Но нужно учесть, что такой лизат содержит не только полезные антигенные детерминанты, но и значительное число примесей, которые в лучшем случае окажутся неэффективными в процессе нагрузки антигеном.
Необходимо уточнить, что профиль экспрессии антигенов всегда отличается в разных клеточных линиях. Иммуногенные белки, кодируемые опухоль-ассоциированными генами GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1, SPANXA1 и PRAME, и могут стать теми антигенами, которыми будет опосредован дендритноклеточный антипро-лиферативный ответ [10]. Однако если эти антигены не будут экспрессироваться клетками-мишенями, цитотоксическогий эффект нагруженных ДК против клеток опухоли может и не проявиться. Мы считаем, что для наиболее активного воздействия нужно использовать единственный антигенный белок, очищенный от примесей. Нами был выбран белок PRAME, который гиперэкспрес-сируется в клетках меланомы [1; 14; 16; 39]. Белок PRAME кодируется одноимённым РТГ и отличается высокой иммуногенностью. Его экспрессия распространена при многих онкологических заболеваниях [1; 8; 9-13].
Целью данной работы явилось сравнение антипролиферативного действия ДК, нагруженных и не нагруженных рекомбинантным белком PRAME, на рост культивируемых PRAME+ опухолевых и нормальных клеток.
Материалы и методы
Культуры клеток
В работе использовали линии клеток: K562, происшедшие из эритробластного лейкоза, моно-бластные U937, моноцитарные THP-1, промоноци-тарные NOMO-1 и нормальные фибробласты WI-38. Культуры клеток росли в среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ глютамина, 10 мМ HEPES, 10 % ТЭС ("MP Biomedical", США), 40 мкг/мл гентами-цинсульфата ("RKA", Словения).
Для оценки возможного антипролиферативного действия белка PRAME на клетки К562, белок PRAME в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис, 0,1 %-ный N-лауроилсаркозин, инкубировали с клетками К562. Белок PRAME в концентрациях 8 мкг/мл не оказывал антипролиферативного эффекта на клетки.
Выделение РНК и ПЦР в реальном времени
Выделение РНК проводилось гуанидин тио-ционат хлороформ-фенольным методом из периферической крови, костного мозга и клеточных линий [31]. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора случайных нуклеотидных гексамеров в качестве праймеров и обратной транскриптазы M-MLV ("Promega", США).
Количественное определение экспрессии генов GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1, SPANXA1 и PRAME проводилось методом ПЦР в реальном времени по технологии TaqMan с использованием приборов IQ Cycler ("BioRad", США) и Applied Biosystems 7500. Системы специфических праймеров и зондов разработаны на основе данных по нуклеотидным последовательностям, предоставленных ресурсом http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Флуоресцентный сигнал определяли при 60 °С с использованием фильтров для FAM. В качестве контрольного гена использовали ABL. В качестве положительных контролей (стандартов) использовали разведения плазмид с известным числом копий, с вставкой участка соответствующего гена. Количество копий гена в образцах определялось по калибровочной кривой, построенной по 10-кратным разведениям стандартов. Экспрессия гена вычислялась как относительная:
число копий изучаемого гена / число копий контрольного гена ><100%.
Получение дендритных клеток
Методика получения ДК была нами взята из работы Чкадуа и соавт. [27] с некоторыми модификациями. Для получения ДК кровь донора или КМ больного ОММЛ брали в пробирки с гепарином (30 ед/мл), наслаивали на Lympho separation medium (1,077, "MP Biomedicals") для получения фракции мононуклеаров, центрифугировали при 1500 об/мин 40 мин.
Полученные мононуклеары суспендировали в концентрации 107/мл в среде RPMI-1640 с 2 мМ глютамина, 10 мМ HEPES, 40 мкг/мл гентамицина, c 10 % сыворотки крови донора или 10 % ТЭС и помещали в лунки 24-луночной платы по 1 мл в лунку. Через 2 часа культивирования при 37 °С с 5 % С02 из лунок отбирали неприкрепившиеся лимфоциты и 2 раза промывали лунки той же средой для полного удаления лимфоцитов, которые собирали в отдельный флакон. К части лимфоцитов добавляли интерлейкин-2 (ИЛ-2; 10 ед/мл;" Sigma", США) до совместной инкубации с ДК.
Для получения зрелых ДК к прикрепившимся клеткам добавляли полную среду для культивирования, содержащую цитокины: по 80 нг/мл (ГМ-КСФ; "Sigma") и 10 нг/мл интерлейкина-4 (ИЛ-4; "Sigma"). На 2; 4 и 6 сутки культивирования к клеткам добавляли по 0,1 мл смеси ГМ-КСФ (800 нг/мл) и ИЛ-4 (100 нг/мл). Для получения незрелых ДК выделенные клетки инкубировали без добавления цитокинов.
Зрелость дендритных клеток определяли в реакции иммунофлуоресценции методом двойного окрашивания. Собранные клетки из культуральных флаконов трижды отмывали, суспендировали в PBS pH=7,5, и центрифугировали для получения осадка, затем ресуспендировали и отмывали клетки в PB S до конечной плотности 1*105 (для каждого образца). В пробирки, содержащие клетки, добавляли по 10 мкл моноклональных антител, конъюгирован-ных с FITC, и 10 мкл антител конъюгированных с PE, инкубировали 30 минут при 4 °С; после чего
клетки дважды отмывали в 1 мл PBS (центрифугированием) и ресуспендировали в 300 мкл PBS, содержащем 1 %-ный формалин. В качестве контроля использовали IgG2b, конъюгированных с FITC, и МКА CD20 PE. Экспрессию антигенов на клеточной поверхности оценивали на проточном цитоф-луориметре BD FACSCantoTMII (США). Анализируемый гейт устанавливали на основании комбинации светорассеивания и размера клеток. В работе использовались антитела фирмы "Beckman Coulter" (Франция).
«Нагрузка» ДК
ДК нагружали либо лизатом [29] клеток К562, либо белком PRAME (8 мкг/мл). Для получения лизата клетки помещали в PBS, 4 раза быстро замораживали в жидком азоте и оттаивали, затем центрифугировали при 12000 об/мин и супернатант использовали для нагрузки. Соотношение ДК к клеткам К562 - 1 : 3. ДК инкубировали с антигеном 1 сутки.
Терминальная дифференцировка ДК
Клетки после «нагрузки» отмывали от среды и помещали в среду с фактором некроза опухоли-а(20 нг/мл, ФНО- а, "Sigma") и простагландином Е2 (250 нг/мл, ПГЕ2; "Sigma") на 2 дня.
Совместная инкубация ДК с опухолевыми или нормальными клетками. После окончания инкубации со всеми цитокинами, ДК собирали, центрифугировали, ресуспендировали в исходной среде роста, помещали в 96-луночную плату отдельно или в смеси с клетками линий K562, U937, NOMO-1, THP-1 или с нормальными фибробластами линии WI-38. Клетки в лунках перемешивали и оставляли инкубироваться на несколько суток. За сутки до окончания инкубации в лунки добавляли по 1 мкКи (40 кБк) [3Н]-тимидина, затем определяли включение [3Н]-тимидина [30]. В лунках без [3Н]-тимидина подсчитывали число клеток, окрашенных трипановым синим.
Результаты
Клеточные линии различались по скорости роста: медленно растущие культуры NOMO-1 и THP-1 (уровень экспрессии гена PRAME в этих клетках составил 0,713 и 44,3 % соответственно) и быстрорастущие К562 и U937 (в этих клетках уровень экспрессии PRAME составил 541 и 3,4 % соответственно). Наблюдались различия и в самом профиле экспрессии РТГ. Кроме PRAME, в клетках линии К562 наблюдалась экспрессия генов GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1 и SPANXA1. Мы не обнаружили мРНК GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1 и SPANXA1 в линиях NOMO-1 THP-1 и U937, что означает и отсутствие в клетках белков, кодируемых данными генами.
В ДК, выделенных из мононуклеарной фракции крови донора, после инкубации с факторами, вызывающими их полное созревание, присутствовало 39,4 % CD83+ ДК и 55,9 % CD86+ ДК.
Зрелые ДК донора, нагруженные и ненагру-женные белком PRAME, подавляли включение [3Н]-тимидина в медленно растущие клетки NOMO-1 и THP-1 при их соотношении 1 : 1 (по 5>103 в лунке каждого вида клеток) по сравнению с интактными клетками и клетками, растущими с незрелыми ДК (рис. 1). Зрелые ДК также подавляли рост нормальных фибробластов WI-38, видимо, определяя их как чужеродные клетки.
Рис. 1. Влияние дендритных клеток донора на рост клеток к 7 суткам инкубации, соотношение клеток
при посеве 1:1 (по 5> вида клеток):
10 клеток в лунке каждого
Зрелые ДК не оказывали токсического воздействия на аутологичные фибробласты (данные не представлены).
Предполагалось, что ДК, нагруженные белком РЯЛЫБ, будут значительно подавлять рост быстрорастущих клеток К562, имеющих высокий уровень экспрессии гена РЯАМЕ.
Однако ДК, нагруженные белком РЯЛМБ, при совместной инкубации с быстрорастущими лейкозными клетками К562 или и937 практически не проявили ожидаемого эффекта. В присутствии незрелых ДК отмечено увеличение скорости роста клеток (рис. 1).
Одновременное увеличение в два раза плотности зрелых ДК и клеток-мишеней при их совместной инкубации усиливало антипролиферативный эффект ДК на все клетки (рис. 2).
Мы определяли процент клеток перевиваемых линий, культивируемых совместно с ДК, и сравнили с количеством интактных клеток. Зрелые ненагруженные ДК, выделенные из крови донора, при культивировании в соотношении ДК : клетки-мишени 1 : 1 (по 104 в лунке каждого вида клеток) полностью подавили рост клеток МОМО-1, а рост остальных клеток был подавлен на 40-60 %. Нагрузка ДК лизатом клеток К562 вызвала усиление действия ДК против клеток К562.
26 | ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ НАЛИЧИЕ ИММУНОГЕННОГО АНТИГЕНА...
Рис. 2. Влияние дендритных клеток донора на линии клеток на 5 сутки инкубации при соотношении 104:104:
При этом рост клеток других линий подавлялся слабее, чем при культивировании со зрелыми ненагруженными ДК. ДК, нагруженные белком РКЛМБ, подавили рост клеток ТНР-1 и К562 на 60%, максимальное подавление наблюдали на клетках ШМО-1 и и937 (рис. 2).
Таким образом, при увеличении плотности клеток нагрузка ДК специфическим опухолевым антигеном - белком РЯЛМБ, приводила к более сильному подавлению роста всех клеток по сравнению с ДК, не нагруженными РЯЛМБ, или нагруженных лизатом клеток линии К562. ДК, нагруженные лизатом клеток К562, подавляли рост клеток К562, но слабее по сравнению с ДК, нагруженными рекомбинантым РЙАМЕ. Нагрузка ДК лизатом клеток К562 вызывала также более слабое подавление роста других линий клеток по сравнению с ДК без нагрузки и нагруженных белком РЯЛМБ. На микрофотографиях клеток, сделанных в конце инкубации (рис. 3), видно, что там, где воздействие ДК оценивалось как сильное, меняется плотность клеточных культур, заметно изменяется вид клеток.
При увеличении соотношения ДК:К562=5 : 1 (2,5*104 : 5*103) антипролиферативное действие ДК было значительным. Незрелые ДК, нагруженные белком РЯЛМБ, слабее подавляли рост клеток по сравнению с ненагруженными ДК (рис. 4, а). Напротив, зрелые ДК, нагруженные белком РЯЛМБ, и затем инкубированные с ФНО-альфа и ПГЕ2, оказывали более сильное антипролиферативного действие (рис. 4, б). Если после нагрузки белком РЯЛМБ ДК не подвергались терминальной диффе-ренцировке, то их действие на клетки К562 было слабым. Вероятно, после того, как ДК вступают в контакт с опухолевыми клетками, перерабатывая опухолевые антигены, опухолевые клетки, остав-
шиеся живыми, подавляют их дальнейшее созревание и тем самым ослабляют способность выполнять функции АПК активировать Т-лимфоциты и оказывать полноценный антипролиферативный эффект.
Ещё большее антипролиферативное действие ДК на клетки опухолей проявлялось после добавления лимфоцитов донора к смеси клеток ДК+К562. При этом действие лимфоцитов, предварительно активированных ИЛ-2, в данном случае не отличалось от неактивированных лимфоцитов (рис. 4).
Клетки костного мозга больного ОММЛ получили через 2 мес после установления диагноза и проведения 3 курсов химиотерапии. Уровень экспрессии гена PRAME в дебюте заболевания составлял 3,3 %, а в день взятия КМ для выделения ДК экспрессия гена PRAME была существенно ниже -около 4,32*10-3%. Созревание ДК индуцировали согласно протоколу получения ДК из мононуклеа-ров периферической крови здорового донора. Сравнивали влияние плотности и соотношения ДК к клеткам К562 на рост клеток К562 (рис. 5). Для оценки антипролиферативного эффекта подсчитывали число клеток К562 в лунке.
При совместной инкубации в соотношении 1 : 1 число клеток К562 уменьшалось в 2,5 раза по сравнению с контролем. Увеличение концентрации зрелых ДК до соотношения 3 : 1 в лунке относительно исходной концентрации клеток К562 (5*103 в лунке) приводило к снижению числа клеток К562 к 7 суткам инкубации почти в 7 раз. При повышении исходной концентрации ДК и клеток К562 до 104 или 1,5 *104 в лунке влияние ДК было слабее. Нагрузка ДК белком PRAME не дала никакого преимущества по сравнению со зрелыми ДК, ненагру-женных антигеном (рис. 5).
Обсуждение
Как видно из результатов первого эксперимента (рис. 1), антипролиферативное действие не-нагруженных ДК зависит от степени их зрелости. Зрелые ДК по сравнению с незрелыми сильнее подавляли рост опухолевых клеток.
Кроме того, антипролиферативное действие ДК на опухолевые клетки зависело от скорости роста клеток.
Согласно результатам, быстрорастущие опухолевые клетки оказались намного более устойчивы к антипролиферативному воздействию ДК. Зрелые ДК также вызывают гибель нормальных фиб-робластов линии WI-38, возможно, признавая их чужеродными.
Согласно нашим наблюдениям, для подавления роста опухоли было необходимо, чтобы число ДК значительно превышало количество опухолевых клеток. Вероятно, при активно пролифери-рующей опухоли немногочисленные ДК просто не успевают войти в контакт со всеми клетками. Особенно если учесть, что ДК не делятся в культуре, то по истечении некоторого времени опухолевые клетки становились столь многочисленными, что на их фоне не ощущалось антипролиферативного действия редких ДК.
В нашем случае число клеток К562, увеличивается с 5*103 в 9 и 30 раз за 3 и 7 суток соответственно (рис. 5). Этот результат согласуется с наблюдениями другой группы учёных. Согласно Pan et al., для значительного антипролиферативного эффекта соотношение числа ДК к клеткам разных опухолей должно быть 10 и выше [36].
U937 1ДК + U937 1ДК (лн1яггК562) ?ДК (PRAME)
+ U937 + U937
А L А Ü А IL А
NOMO-1 ?ДК+ NOMO-1 Ьь. ' V > . А 1ДК(лнитгК562) +NOMO-1 k А Г 1 зДК (PRAME) + NOMO-1 к: л
ТНР-1 к.. & а зДК + ТНР-1 t J 1ДК (лн1яггК562' + ТНР-1 L А ?ДК (PRAME) + ТНР-1 L А
К562
зДК + К562
Л.
зДК (лн1яггК562) + К562
зДК (FRAME) + K5Ö2
Рис. 3. Микрофотография клеток на 5 сутки инкубации, соотношение при посеве 10 :10 . Обозначения, как на рис. 2.
Рис. 4а-б. Рост клеток К562 при совместной инкубации с незрелыми и зрелыми дендритными клетками и лимфоцитами. Соотношение клеток при посеве 2,5*104 ДК : 5*103 К562, 5*Ш4 Лф. Лф - лимфоциты, инкубированные в среде без ИЛ-2; Лф (ИЛ-2) - лимфоциты, инкубированные с 10 ед/мл ИЛ-2 до инкубации с ДК.
а. нДК - инкубированные с 80 нг/мл ГМ-КСФ и 10 нг/мл ИЛ-4; нДК (РКЛМБ) - инкубированные с ГМ-КСФ и ИЛ-4, затем нагружались белком РКЛМБ;
б. зДК - (РКЛМБ) - зрелые клетки, нагруженные белком РКЛМБ.
Рис. 5. Влияние дендритных клеток, полученных из костного мозга больного ОММЛ, на рост клеток К562 на 3 и 7 сутки совместной инкубации при разной плотности и соотношении клеток. Обозначения, как на рис. 1.
Другой важный вопрос, разрешённый нами, заключался в выборе формы антигена для стимуляции антипролиферативного эффекта ДК против чужеродных клеток. В качестве альтернативы нагрузки лизатом клеток линии K562 мы предложили использовать очищенный рекомбинантный белок PRAME. Из результатов видно, что ДК, нагруженные очищенным белком, всегда осуществляли больший антипролиферативный эффект против клеток-мишений, чем ДК, ненагруженные, или нагруженные лизатом клеток K562. Согласно основным представлениям о функциях ДК, данные клетки могут презентировать в качестве антигенов практически любые пептиды, имеющие экзогенное происхождение. K562 содержат не только антигены белка PRAME, но и множество других из группы раково-тестикулярных антигенов, не говоря о наличии белков, кодируемых генами домашнего хозяйства. Из рассмотренных нами антигенов общим среди линий U937, THP-1, NOMO-1 и K562 оказался только PRAME, геномная РНК которого экс-прессировалась во всех линиях. Согласно профилю экспрессии, лизат клеток K562 может содержать пептиды белков GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1, SPANXA1 и PRAME. Данные антигены не могут находиться в клетках линий U937, THP-1 и NOMO-1, так как в них не происходит син-
теза мРНК генов.
Таким образом, ДК, захватив множество антигенов из смеси, полученной после лизиса K562, презентируют как эпитопы белка PRAME, так и эпитопы множества других белков. Концентрация белка PRAME не является преобладающей в лиза-те, а сам белок никогда не сравнится по чистоте с выделенным рекомбинантным белком. Однозначно, что ДК будут захватывать и презентировать большинство белков, среди которых PRAME будет составлять незначительную долю. Не исключено, что лизат целых клеток содержит активные протеоли-тические ферменты, присутствие которых может стать губительным для ДК.
Мы видели, что антипролиферативный эффект, проявляемый ДК, нагруженными лизатом или очищенным белком, был сопоставимым при культивировании с K562 (рис 2). Эпитопы антигенов GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1 и SPANXA1 так же, как эпитопы PRAME, захватываются и расщепляются ДК.
Поскольку клетки линии K562 имеют набор этих антигенов, то в данном случае не могло наблюдаться каких-либо серьёзных различий в интенсивности антипролиферативного ответа.
Однако наличие этих антигенов в лизате не способствовало развитию более интенсивного, ли-
бо хотя бы сопоставимого антипролиферативного эффекта ДК против линий U937, THP-1 и NOMO-1, в клетках которых, как мы показали, антигенов GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1 и SPANXA1 быть не может.
Сила антипролиферативного ответа определялась только примесью белка PRAME, который содержится в лизате.
С другой стороны, антипролиферативный эффект ДК, обработанных чистым белком PRAME был более выражен против клеток U937, THP-1 и NOMO-1 (рис 2). В этих линиях происходит экспрессия гена PRAME, и наличие этого белка позволило ДК, нагруженным PRAME, проявить направленное антипролиферативное действие.
Таким образом, нагруженные белком PRAME ДК приобретают способность к антипро-лиферативному эффекту, который проявляется против PRAME+ клеток.
Вероятнее всего, именно по этой причине создание дендритноклеточной вакцины, где в качестве белка-мишени был выбран PRAME, завершилось неудачей при работе с клетками больного, имеющими низкий уровень экспрессии PRAME.
Литература
Выводы
Несмотря на недостаток фактов, которые помогли бы нам раскрыть механизм антипролиферативного действия ДК, у нас есть все основания для подтверждения того, что ключевым звеном в этом эффекте является наличие антигена, связывающего как ДК, так и клетку-мишень. Антиген должен экспрессироваться клеткой-мишенью, и в то же время им должны быть нагружены ДК. Наибольший эффект наблюдался при антипролиферативном действии ДК, нагруженных специально очищенным от нежелательных примесей белком РЯЛМЕ, активно экспрессирующих этот ген. И наибольший антипролиферативный эффект наблюдается при нагрузке целевым антигеном зрелых ДК.
Мы полагаем, что при создании дендритнокле-точных вакцин оптимальным решением является нагрузка целевым антигеном в форме очищенного белка зрелых ДК, и использование их против опухолей, чьи клетки позитивны по антигену, выбранному в качестве целевого. Оптимальным временем применения дендритноклеточной вакцины является состояние, когда различными способами достигается минимальный размер опухолевой массы.
1. Абраменко И.В., Белоус Н.И., Крячок И.А. и др. Экспрессия гена PRAME при множественной миело-ме // Терапевтический архив. - 2004. - Т. 76, № 7. - С. 77-81.
2. Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Соколова З.А., Косорукое B.C. Разработка липосомальной конструкции, содержащей лизат опухолевых клеток // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. -Т.12, №2. - С. 5.
3. Барышников А.Ю. Взаимодействие опухоли и иммунной системы организма // Практическая онкология. - 2003. - Т. 4, №3. - С. 127-30.
4. Барышников А.Ю. Биотерапия опухолей: неудачи и перспективы // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2007. - № 1. - С. 13-6.
5. Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2004. - № 2. - С. 59-63.
6. Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. -Т. 1, № 2. - С. 12.
7. Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник Московского онкологического общества. - 2008. - № 1. - С. 6-10.
8. Гапонова Т.В., Менделеева Л.П., Мисюрин A.B. и др. Экспрессия опухолеассоциированных генов PRAME, WT1 и XIAP у больных множественной миеломой // Онкогематология. - 2009. - № 2. - С. 52-7.
9. Голубцова Н.В., Степанова Е.В., Бармашов А.Е. и др. Определение специфических противоопухолевых антител у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 3. - С. 25-8.
10. Мисюрин В.А. Аутосомные раково-тестикулярные гены // Российский биотерапевтический журнал. -2014. - Т. 13, № 3. - С. 67-72.
11. Мисюрин В.А. Х-хромосомные раково-тестикулярные гены // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 2. - С. 3-9.
12. Мисюрин В.А., Лукина А.Е., Мисюрин A.B. и др. Особенности соотношения уровней экспрессии генов PRAME и PML/RARA в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 9-16.
13. Мисюрин В.А., Мисюрин A.B., Кесаева Л.А. и др. Новые маркеры прогрессирования хронического миелолейкоза. Клиническая онкогематология // Фундаментальные исследования и клиническая практика. - 2014. - Т. 7, № 2. - С. 206-12.
14. Мисюрин В.А., Мисюрин A.B., Лукина А.Е. и др. Профили экспрессии раково-тестикулярных генов в клеточных линиях меланомы // Биологические мембраны. - 2014. - Т. 31, № 2. - С. 104-9.
15. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланоиы - основа для создания противоопухолевых вакцинУ/Вестник РАМН. - 2005. - № 7. - С. 37-40.
16. Михайлова И.Н., Петенко H.H., Чкадуа Г.З. и др. Вакцинотерапия метастатической меланомы с использованием дендритных клеток: клиническое исследование I/II фазы // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, №. 2. - С. 39-43.
17. Михайлова И.Н., Петенко H.H., Демидов Л.В. Вакцинотерапия меланомы дендритными клетками // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, №. 2. - С. 8-18.
18. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Клименко О.В. и др. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т .10, № 4. - С. 62-6.
19. Михайлова Т.В., БарышниковаМ.А., Багирова Н.С. и др. Стерилизация многослойных протеолипосом // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т 11, № 1. - С. 13-7.
20. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Бурова О.С. и др. Сравнение уровня экспрессии HSP70 на клеточных линиях меланомы //Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 1. - С. 43-8.
21. Никитин К.Д., Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины на основе белков теплового шока // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, № 2. - С. 3-12.
22. Новиков В.В., Барышников А.Ю., Караулов В.А. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы // Иммунология. - 2007. - № 4. - С. 249-54.
23. Новиков В.В., Гостюжова Е.А., Караулов А.В. и др. Состояние пула растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при острых лейкозах // Российский иммунологический журнал.
- 2009. - Т. 3(12), № 2. - С. 164-70.
24. Новиков В.В., Евсегнеева И.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы при социально значимых инфекциях // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 100-5.
25. Новиков В.В., Евсегнеева И.В., Караулов В.А., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы при социально значимых инфекциях. Исследование их роли при вирусных инфекциях // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т. 4,№ 3. - С. 131-45.
26. Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. и др. Особенности структурного пула растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы //Молекулярная медицина. - 2009. - № 4. -С. 27-33.
27. Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н., Буркова А.А. и др. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. - Т. 1, № 3. - С. 56-62.
28. Anguille S., Lion E., Tel J. et al. Interleukin-15-induced CD56(+) myeloid dendritic cells combine potent tumor antigen presentation with direct tumoricidal potential // PLoS One. - 2012. - 7. - e51851-1-e51851-13.
29. Asavaroengchai W., Kotera Y., Mule J.J. Tumor lysate-pulsed dendritic cells can elicit an effective antitumor immune response during early lymphoid recovery // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2002. - 99. - P. 931-6.
30. Chapoval A.I., Tamada K., Chen L. In vitro growth inhibition of a broad spectrum of tumor cell lines by activated human dendritic cells // Blood. - 2000. - 95. - P. 2346-51.
31. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. - 1987. - 162. - P. 156-9.
32. Fraszczak J., TradM., Janikashvili N. et al. Peroxynitrite-Dependent Killing of Cancer Cells and Presentation of Released Tumor Antigens by Activated Dendritic Cells // J. Immunol. - 2010. - 184. - P. 1876-84.
33. Lakomy D., Janikashvili N., Fraszczak J. et al. Cytotoxic Dendritic Cells Generated from Cancer Patients // J. Immunol. - 2011. - 187. - P. 2775-82.
34. Matheoud D., Perie L., Hoeffel G. et al. Cross-presentation by dendritic cells from live cells induces protective immune responses in vivo // Blood. - 2007. - 115. - P. 4412-20.
35. Michailova I.N., Morozova L.Ph., Golubeva V.A. et al. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines // Melanoma Research. - 2008. - № 5. - P. 303-13.
36. Pan K., Zhao J.J., Wang H. et al. Comparative Analysis of Cytotoxic T Lymphocyte Response Induced by Dendritic Cells Loaded with Hepatocellular Carcinoma-Derived RNA or Cell Lysate // Int. J. Biol. Sci. -2010. - 6. - P. 639-48.
37. Rega A., Terlizzi M., Luciano A. et al. Plasmacytoid Dendritic Cells Play a Key Role in Tumor Progression in Lipopolysaccharide-Stimulated Lung Tumor-Bearing Mice // The Journal of Immunology. - 2013. - 190.
- P. 2391-402.
38. Roothans D., Smits E., Lion E., Tel J., Anguille S. CD56 marks human dendritic cell subsets with cytotoxic potential // Oncoimmunology. - 2013. - 2. - e23037-1-e23037-3.
39. van Baren N., Chambost H., Ferrant A. et al. PRAME, a gene encoding an antigen recognized on a human melanoma by cytolytic T cells, is expressed in acute leukaemia cells // Br J Haematol. - 1998. - 102(5). - P. 1376-9.
40. Wesa A.K., Storkus W.J. Killer dendritic cells: mechanisms of action and therapeutic implications for cancer // Cell Death Differ. - 2008. - 15. - P. 51-7.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АПК - антиген-презентирующие клетки
ЛПС - липополисахарид
РТГ - раково-тестикулярный ген
ИЛ-2 - интерлейкин-2
ИЛ-4 - интерлейкин-4
ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор КМ - костный мозг
ОММЛ - острый миеломоноцитарный лейкоз ОК - опухолевые клетки ДК - дендритные клетки (DC - dendritic cells) зДК - зрелые дендритные клетки;
зДК - зрелые дендритные клетки, нагруженные белком PRAME (по 8 мкг/мл среды); нДК - незрелые дендритные клетки, инкубировались в среде без цитокинов.
