CC BY
47
УДК 576.851.132:615.33.
МУТАНТЫ BURKHOLDERIA CEPACIA С МНОЖЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ
Е.В. Калинкина, И.К. Сеимова, О.А. Меринова, Д.В. Викторов, Л.К. Меринова
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Burkholderia cepacia, микроорганизм, изначально известный как фитопатоген, в последние годы все больше привлекает внимание как вид, способный вызывать инфекционные процессы у человека [8]. Он не только осложняет заболевания у пациентов с иммунодефицитными состояниями, но вызывает послеоперационные раневые инфекции, септицемии, инфицирование мочевыводящих путей, возникающие при использовании растворов для внутривенного введения, инструментов и оборудования для интенсивной терапии и контаминированных дезин-фектантов [3]. Серас/а-синдром характеризуется некротизирующей пневмонией с лихорадкой, бактериемией и быстро приводит к летальному исходу [6]. Генетическая гетерогенность бактерий комплекса B.cepacia, обусловленная сложным строением генома [1], рассматривается в качестве отличительного свойства этого микроорганизма, позволяющего ему существовать в разных экологических нишах и быть патогеном растений и животных. B.cepacia обладает высокой природной резистентностью ко многим антибиотикам, при этом первично чувствительные штаммы, выделенные от больных, легко формируют устойчивость в процессе лечения [3, 6]. В связи с этим особое значение приобретает изучение резистентности B.cepacia к ингибиторам как явления препятствующего проведению эффективной антибактериальной терапии. Очевидно также, что раскрытие механизмов устойчивости создает необходимые предпосылки к разработке путей ее преодоления.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Получить мутанты B.cepacia с фенотипом множественной лекарственной резистентности и исследовать механизмы ее формирования.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы штаммы дикого типа B.cepacia АТСС 25416 и 8235, а также их резистентные мутанты (см. табл.). Питательные среды -Z-arap и Z-бульон ("Difco", США).
Минимальные подавляющие концентрации (МПК) пефлоксацина, цефтазидима и других антибиотиков определяли методом стандартных разведений на плотных питательных средах.
Для выделения резистентных клонов использовали метод направленной селекции культур на плотных средах с антибиотиками в повышающихся концентрациях (начиная от МПК). Культуры инкубиро-
вали при температуре 32 °С от двух до четырех суток.
Для оценки динамики ингибирования роста антибиотиками исследуемых штаммов, суспензии 24-часовых агаровых культур бактерий в 0,15 М №С1, содержащие 1*104 м.к. в 1мл, высевали на £-агар с добавлением пефлоксацина и цефтазидима. Гибель клеток микроорганизма определяли по соотношению количества колоний, выросших на среде с антибиотиком, к количеству колоний, выросших в контроле, принятому за 100 %.
Продукцию внеклеточных ферментов (протеаз, липазы, лецитиназы) определяли на плотных питательных средах, содержащих необходимые субстраты [4]. Для выявления способности клеток микроорганизма сорбировать липофильный краситель, двухсуточные, инкубированные при 32 °С колонии штаммов заливали раствором судана черного "В" и через 10 минут учитывали изменение цвета колоний [11].
Таблица 1
Перечень штаммов Б.еерааа, использованных в работе
Штаммы Характеристика Источник получения
ATCC 25416 дикий тип коллекционный центр ВолгоградНИПЧИ
8235 !! !!
25416 SMR1 CfzR Pfx* получены в данной работе
25416 SMR2 Pfx* Cfz* !!
8235 SMR1 CfzR Pfx* !!
8235 SMR2 PfxR Cfz* !!
25416 SMR3 Cfz* !!
8235 SMR11 KanR !!
25416 SMR11 KanR !!
8235 SMR12 ChP !!
25416 SMR12 ChlR !!
25416 SMR13 KanR ChP !!
8235 SMR13 KanR ChlR !!
Примечание. CfzR — резистентность к цефтазидиму, PfxR — пефлоксацину, KanR — канамицину, ChlR - хлорамфениколу.
Выделение белков наружной мембраны проводили методом Hancock [7], экспрессию белков исследовали методами электрофореза в полиакрила-
мидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и иммуноблоттинга [9, 13].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изначально штаммы B.cepacia АТСС 25416 и 8235 исследовали на исходную резистентность к антибиотикам различных классов. Клоны, с некоторыми отличиями, характеризовались резистентностью к большинству из них, при этом, максимальную устойчивость они проявляли к полимиксину, ампициллину и стрептомицину (10000 мкг/мл, 7500 мкг/мл и 5000 мкг/мл соответственно). Штаммы были чувствительны к цефтазидиму, пефлоксацину и, в меньшей степени к хлорамфениколу и канамицину (10 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл и 200 мкг/мл соответственно).
Для получения мутантных штаммов мы использовали препараты, отличающиеся по механизму действия на бактериальную клетку, к которым B.cepacia проявляла наибольшую чувствительность.
После ряда пассажей на средах поочередно с одним, затем - с другим ингибитором мы получили два набора штаммов, в одном из которых селектируемыми маркерами были PfX и Cfz? (резистентные к пефлоксацину и цефтазидиму), во втором - KanR и ChlR (резистентные к канамицину и хлорамфениколу).
Определение МПК препаратов для данных штаммов показало, что их устойчивость, по сравнению с дикими штаммами, увеличилась по каждому маркеру в несколько раз, при этом максимальных значений достигла резистентность к цефтазидиму (МПК 1500 мкг/мл) и к канамицину (МПК 8000 мкг/мл).
Штаммы B.cepacia ATCC 25416 и 8235 с маркерами PfxRCfzR приобрели дополнительную (перекрестную) устойчивость высокого уровня к ампициллину, хлорамфениколу, тетрациклину (рис. 1), и в меньшей степени - резистентность к антибиотикам ряда ами-ногликозидов.
Анализ полученных результатов показал, что у штаммов резистентных к канамицину возросла устойчивость к другим препаратам этого ряда - стрептомицину и гентамицину, тогда как у штаммов с маркером Chf* резистентность к ним осталась на прежнем уровне или снизилась. В отличие от этого, появление устойчивости к тетрациклину и ампициллину не зависело от приобретенных изначально маркеров резистентности к хлорамфениколу или кана-мицину. МПК пефлоксацина возросла у мутантов Chf* и осталась практически на прежнем уровне у штаммов KanR. Фенотип устойчивости к цефтазиди-му, напротив, выявлялся у штаммов с маркером KanR. Исходя из этого, можно было предположить, что существует тенденция взаимосвязи развития этих типов устойчивости друг от друга в направлении: ChlR - Pf^ и Kan - CZ, повышение резистентности к одному препарату ведет к возрастанию МПК второго (рис. 2).
У штаммов резистентных к пефлоксацину и
цефтазидиму определяли динамику ингибирования роста (рис. 3).
Amp
■ 8235 W.t □ 8235 SM Pfx Cfz
Tet
□ 25416 W.t
□ 25416 SMR Pfx Cfz
Рис.1 Множественная лекарственная резистентность штаммов B.cepacia:
Обозначения: W.t. - дикий тип; SMR2 - штаммы резистентные к пефлоксацину, цефтазидиму; Amp - ампициллин; Chl - хлорам-феникол; Tet - тетрациклин
Рис. 2. Перекрестная резистентность штаммов Б.серасга в
зависимости от селектируемого маркера: Обозначения: W.t. - дикий тип; SMR11 - штамм резистентный к канамицину; SMR12 - штамм резистентный к хлорамфениколу; Р£х - пефлоксацин; Cfz - цефтазидим
120
ш 100
80
60
40
20
8235 W.t 25416 SM Cfz
<*>" к^ к^
25416 W.t мкг/мл
8235 SM Cfz Pfx
Рис. 3. Динамика подавления цефтазидимом роста исходных и резистентных штаммов Б.сврааа: Обозначения: как на рис. 1
Как видно из рисунка, динамика гибели клеток под действием ингибиторов имеет характер плавно
Chl
нисходящих кривых. При этом кривые гибели резистентных штаммов не изменили своей структуры, в сравнении с исходными, а лишь сдвинулись вправо, демонстрируя значительно более высокие уровни подавляющих концентраций, чем аналогичные показатели для исходных штаммов. Так, резистентность штамма Б.серасга 8235 БМК1 возросла в 100, а штамма Б.серасга 25416 8МЯ3 в 20 раз по сравнению с дикими штаммами. Концентрация данного антибиотика, вызывавшая гибель 70-80% клеток, составляла для мутантного штамма Б.серасга 8235 1000 мкг/мл; для резистентного штамма Б.серасга 25416 300 - 400 мкг/мл.
Показано, что множественная лекарственная устойчивость бактерий обусловлена функционированием различных молекулярных механизмов, в том числе - активного выброса из клетки антимикробных соединений и снижения общей проницаемости клеточной оболочки в результате изменения экспрессии поринов наружной мембраны (5, 10, 12). В связи с этим штаммы Б.серааа, резистентные и исходные, исследовали на способность к продукции некоторых внеклеточных ферментов (лецитиназы, протеазы, липазы), используя этот тест для косвенной оценки возможных изменений в проницаемости их клеточных стенок. При этом мы выявили у резистентных клонов изменение лецитиназной, твин-эстеразной и протеолитической активностей. В наибольшей степени у них изменялась активность протеолитических ферментов, снизившаяся у большинства мутантов штамма Б.серасга 8235, всех устойчивых клонов штамма Б.серасга 25416, один из которых полностью ее утратил. Способность сорбировать краситель судан черный "В'', была обнаружена у штамма Б.серааа 8235 БМК2. По этому признаку он отличался от остальных как диких, так и резистентных, что позволяет предполагать у него снижение продукции экзополисахарида клеточной стенки [11].
Был проведен анализ экспрессии белков клеточных мембран исходного штамма Б.серааа 25416 и его производных Б.серааа 25416 БМК3, Б.серааа 25416 БМК2. Белковый состав клеточных мембран и изменение уровня экспрессии отдельных мембранных белков оценивали методом иммуноблоттинга с применением иммуноферментного конъюгата на основе поликло-нальных иммуноглобулинов, специфически взаимодействующих с консервативными поверхностными белками различных видов БыгШоМепа. Антигенные профили мембранных белков исходных и антибиотикорези-стентных штаммов представлены на рис. 4.
По данным иммунохимического анализа, резистентные штаммы Б.серааа с фенотипом Р/^С/^ отчетливо отличались от исходных по составу белков наружных клеточных мембран. У них отмечено значительное снижение экспрессии отдельных мембранных протеинов с молекулярными массами 18, 21, 27, 29 кЪа и некоторое возрастание уровня продукции порина 3 9 кЭа.
Рис. 4. Иммуноблоттинг белков наружной мембраны исходного и резистентных штаммов B.cepacia:
1 - 25416 W.t; 2 - 25416 SM Cfz; 5 - 25416 SM Pfx Cfz
Обозначения: как на рис. 1
При этом снижение уровня экспрессии отдельных мембранных белков более выраженным было у штамма, несущего маркеры множественной резистентности.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, штаммы B.cepacia способны формировать множественную лекарственную устойчивость к широкому набору антимикробных препаратов с различными механизмами действия. В развитии резистентности множественного типа у этого микроорганизма принимают участие отдельные мажорные белки наружной мембраны, с которыми, по-видимому, связано изменение проницаемости клеточной оболочки для ряда ингибиторов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. // Мол. генет. микро-биол. вирусол. - 2002. - № 2. - C. 7-11.
2. Burns J.L., Wadsworth CD., Barry J.J., et al. // Antibicrob. Agents Chemother. - 1996. - Vol. 40. - P. 307-313.
3. Ciss M.F., Dian YD, Sow A.I., et al. // Dakar Med. -1998. - Vol. 43. - P. 144-146.
4. Difco manual. Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Tenth edition. Difco laboratories, Detroit, Michigan 48232, USA. - 1984. - 1155 p.
5. Gayet S., Chollet R, Molle G., et al. // Antimicrob Agents Chemother. - 2003. - Vol. 47. - P. 155-159.
6. Govan J.R W., Hughes J. E., Vandame P. // J. Med. Microbiol. - 1996. - Vol. 45. - P. 395-407.
7. Hancock R., Nikaido H. // J. Bacteriol. - 1978. - Vol. 136. - P. 381-390.
8. Holmes A.Z., Govan J., Goldstein R. // J. Infect. Dis. -1998. - Vol.4. - P. 221-227.
9. Laemmli U. K. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
10.Li X.Z., Nikaido H. // Drugs. - 2004. - Vol. 64. - P. 159-204.
11.Liu M., Gonzalez J.E., et al. // Appl. Env. Microbiol. -1998. - Vol. 64. - P. 4600-4602.
12.Poole K. // Clin. Microbiol. Infect. - 2004. - Vol. 10. -P. 12-26.
13.Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.
© Коллектив авторов, 2006
