CC BY
22
ВОПРОСЫ ОБЩЕЙ И ЧАСТНОЙ ХИРУРГИИ
«Вестник хирургии»^2009
© Коллектив авторов, 2009
УДК 616.33-002.44-036.12-08:616.419
М.Б.Аскаров, В.И.Шумаков , Н.А.Онищенко
МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА УСКОРЯЮТ ЗАЖИВЛЕНИЕ ДЛИТЕЛЬНО НЕЗАЖИВАЮЩИХ ЯЗВ ЖЕЛУДКА
ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (и.о. дир. — чл.-кор. РАМН проф. Д.В.Шумаков), Москва
Ключевые слова: экспериментальная язва желудка, костный мозг, регенерация.
Введение. Существование хронических длительно незаживающих язв желудка является результатом нарушения местных регенерацион-ных процессов в слизистой оболочке желудка в условиях нарушения морфорегуляторных функций иммунной системы, которые приводят к ингибированию процессов восстановительной регенерации язвенных дефектов [2, 7, 8, 10, 11]. Дисрегуляция иммунной системы поддерживает деструктивно-воспалительные изменения в зоне язвенного дефекта и ингибирует пролифератив-ную фазу регенерационного процесса, что связано с нарушением не только синтеза структурных белков, но и синтеза молекул межклеточного взаимодействия (пептиды) [9]. Известно, что источником иммунорегуляторных пептидов (цитокинов, факторов роста) в организме выступают центральные органы иммуногенеза, которые, однако, при хронических заболеваниях (хроническом стрессе) начинают адаптационно перестраиваться [5], что в конце концов приводит к перераспределению иммунных клеток в организме, а также к нарушению их информационной и миграционной активности [3, 4]. Эти наблюдения послужили для нас основанием предложить использование клеток аутологичного костного мозга для регенерационной терапии после предварительного культивирования их in vitro с целью восстановления исходного уровня биорегулятор-ной активности, в частности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга (КМ) — основного индуктора и субстрата грануляционной ткани.
В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось изучение влияния культивированных ММСК КМ для целей стимуляции
регенерации и заживления длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка (ДНЯЖ).
Материал и методы. Опыты проводили на 30 крысах-самцах линии массой тела 250-300 г, у которых моделировали ДНЯЖ в условиях сопутствующего изменения состояния иммунной системы в организме. Для этого нами моделировалась аутоиммунная ДНЯЖ. Для ее создания под эфирным наркозом крысам вводили 1,5 г гомогенизированной слизистой оболочки желудка аллогенного животного в объеме 1,5-2 мл физиологического раствора с добавлением к этой смеси 1,5 мл адъюванта Фрейнда. Полученный гомогенат вводили в подкожную клетчатку лапок животного, трижды с промежутками в 7 дней. Через 35-40 дней у крыс развивалась хроническая язва желудка, диаметром до 5-7 мм с изрытыми неровными краями, вокруг которых отмечались выраженный отек, гиперемия и точечные эрозии без тенденции к заживлению в течение 2,5 мес. Этим изменениям сопутствовал резко выраженный цитокиновый дисбаланс в организме (нарастание провоспалительных и снижение противовоспалительных
Рис. 1. Уровень про- и противовоспалительных цитокинов в культуральной среде в динамике культивирования ММСК КМ.
По оси абсцисс — сроки наблюдения (сутки); по оси ординат — количество цитокинов (пг/мл).
Рис. 2. Динамика образования монослоя ММСК.
N — ММСК из костного мозга интактньх крыс; ЯБЖ — ММСК из костного мозга крыс с язвой желудка. По оси абсцисс — сроки наблюдения и образования монослоя (сутки); по оси ординат — процент образования монослоя ММСК КМ.
Площадь язвенногодефекта, мм:
10-е
20-е
30-е
60-е
Рис. 3. Динамика заживления язвы желудка. 1 — после трансплантации ММСК; 2 — после введения изотонического раствора натрия хлорида (контроль).
цитокинов) [1]. Все экспериментальные животные были разделены на 2 группы: 1-я — крысы с хронической ДНЯЖ и трансплантацией аутологичных ММСК (15 крыс — опытная группа); 2-я — крысы с хронической ДНЯЖ и введением изотонического раствора натрия хлорида (15 крыс — контрольная группа). Забор клеток КМ проводили на 30-35-е сутки после моделирования ДНЯЖ под эфирным наркозом из бедренных костей с промыванием полости кости забуфе-ренным изотоническим раствором натрия хлорида объемом 0,5 мл. Клетки КМ для получения ММСК предварительно культивировали in vitro в среде IMDM (Gibco, USA), содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки («HyClone», USA) на чашках Петри при 37 °С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО2 и с 95% влажностью. Для получения монослоя ММСК требовалось 9-12 сут. Культивирование клеток КМ проводили с целью увеличения клеточной массы, а также для восстановления исходного уровня иммунорегуляторной функциональной активности этих клеток. На 45-е сутки после моделирования ДНЯЖ производили лапаротомию, гастрото-мию и обкалывание язвенного дефекта в 4 равноудаленные точки: у животных 1-й группы — прекультивированными ММСК КМ в виде суспензии в количестве 4 млн клеток в
0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида; у животных 2-й группы — 0,5 мл 0,9% натрия хлорида.
Эффективность клеточной терапии оценивали с помощью визуального, планиметрического и морфологических методов на 10-, 20-, 30-е сутки после трансплантации ММСК. Для гистологического исследования желудок фиксировали в 10% нейтральном формалине, готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.
Для установления связи процессов заживления язв с присутствием в периульцерозной зоне жизнеспособных и функционально активных ММСК мы готовили криостатные срезы из биоптатов краевой зоны язвенного дефекта. Для выявления трансплантированных ММСК эти клетки на этапе культивирования метили, используя генетическую конструкцию — вирусный шатл-вектор, несущий Ьас2 ген Е.соИ, кодирующий р-галактозидазу. р-галактозидазу выявляли иммуно-гистохимически при добавлении субстрата Х-Оа1, по характерному сине-зеленому окрашиванию [6].
Для доказательства восстановления исходного уровня биорегуляторной активности ММСК КМ в процессе культивирования перед трансплантацией нами в культуральной среде измерялось содержание цитокинов (1Ь1р, 1ШГ Т№а, 1Ь-10, 1Ь-4, ТОБр) методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем Вектор-БЕСТ (Новосибирск), «Diamed» (Швейцария). Статистическую обработку результатов исследования проводили используя ^критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение.
Для обкалывания язв нами использовались прекультивированные ММСК, которые в течение 12 сут культивирования разнонаправленно изменяли свою способность продуцировать различные цитокины, в целом изменяя их профиль с провоспалительных на противовоспалительные (рис. 1).
Из этого рисунка видно, что в процессе культивирования происходило достоверное снижение Т№а и и достоверное повышение ТОБр и 1Ь-4 по сравнению с исходными данными в начале культивирования на 3-и сутки. Важно подчеркнуть, что процесс восстановления био-регуляторной активности клеток происходил не одномоментно, а был растянут во времени и требовал 12-14 сут культивирования. К этому времени формировался монослой культуры ММСК КМ (рис. 2).
При этом период формирования монослоя ММСК, полученных от животных с язвенной болезнью, был пролонгирован во времени по сравнению с периодом формирования монослоя ММСК у интактных крыс. Эти результаты свидетельствуют, что культивирование клеток костного мозга является важным этапом для устранения предсу-ществующих стрессорных изменений клеток и восстановления их функциональной активности.
М.Б.Аскаров, В.И.Шумаков, Н.А.Онищенко
«Вестник хирургии»*2009
Рис. 4. Микрофото гистологических препаратов язвы желудка.
а-в — на 10-, 20-, 30-е сутки соответственно после введения изотонического раствора натрия хлорида (контроль); г-е — на 10-, 20-, 30-е сутки соответственно после трансплантации ММСК. Окраска гематоксилином и эозином.
Ув. 200.
Прекультивированные клетки считались нами нормализованными и пригодными для стимуляции процессов регенерации при лечении ДНЯЖ.
При сравнительном исследовании динамики заживления ДНЯЖ в двух группах опытов нами были выявлены достоверные различия, выражающиеся в более высоком темпе регенерации ДНЯЖ при использовании ММСК КМ (рис. 3). Было установлено, что уже на 10-е сутки после трансплантации ММСК отмечается достоверное уменьшение площади язвенного дефекта (р<0,05) по сравнению с контрольной группой, где язвы остаются таких же размеров, что и до начала лечения.
Отчетливой эта разница оставалась на 20-е и 30-е сутки после трансплантации клеток. Важно отметить, что к 30-м суткам в группе животных с трансплантацией ММСК КМ наступало полное заживление язвенного дефекта (р<0,05), и слизистая оболочка желудка имела равномерно розовую окраску, тогда как у животных 2-й группы площадь язвенного дефекта все еще оставалась больших размеров (см. рис. 3), и даже к 6-му месяцу наблюдения за этими животными в контрольной группе оставались язвы размером 0,2-0,4 мм в диаметре.
В соответствии с результатами планиметрического исследования темпа регенерации язв находятся результаты их гистологического исследования на разных сроках наблюдения. Нами установлено, что в контрольной группе животных
на 10-е сутки лечения в дне язвы выявляется широкий лейкоцитарно-некротический слой. В подлежащем слое определяется грануляционная ткань с повышенным количеством тонкостенных кровеносных сосудов и преобладанием фибробластов. В более глубоких отделах грануляционной ткани выявляются коллагеновые волокна, с их частично упорядоченным ходом и небольшим количеством сосудов. В подлежащем к зоне некроза и более глубоких слоях грануляционной ткани отмечается выраженная диффузная воспалительная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов (рис. 4, а).
При гистологическом исследовании язвы желудка на 10-е сутки в группе животных с трансплантацией ММСК КМ лейкоцитарно-некро-тический слой был более тонким. Подлежащий слой был представлен созревающей грануляционной тканью с большим количеством сосудов и умеренно выраженной диффузной лейкоцитарной инфильтрацией преимущественно из гистиоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов. В зоне краев язвенного дефекта определялись кистозно-расши-ренные железы с пролиферирующим эпителием (рис. 4, г). На 20-е сутки у животных контрольной группы размеры язвы несколько уменьшились, но при гистологическом исследовании выраженных различий по сравнению с предыдущим сроком не отмечалось (рис. 4, б). В то же время, в группе с трансплантацией ММСК КМ при гистологическом исследовании была выявлена частичная
Рис. 5. Криостатные срезы биоптата язвенного дефекта с живыми трансплантированными ММСК КМ, трансфецированными рекомбинантным аденовирусом с геном LacZ E.coli. Гистохимическое выявление в-галактозидазной активности по сине-зеленому окрашиванию при добавлении субстрата \-Gal. а — выявление ММСК КМ в зоне язвенного дефекта через 20 дней после трансплантации клеток; б — выявление ММСК КМ в зоне язвенного дефекта через 30 дней после трансплантации клеток. Ув. 40.
эпителизация краев язвенного дефекта. В дне язвы выявлялся тонкий лейкоцитарно-некроти-ческий слой. По сравнению с предыдущим сроком отмечалось разрастание грануляционной ткани и увеличение количества кровеносных сосудов; ход коллагеновых волокон в грануляционной ткани был более упорядоченным, воспалительная инфильтрация была слабо выраженной, преимущественно лимфоидно-гистиоцитарная (рис. 4, д). На 30-е сутки у животных контрольной группы язвенные дефекты сохранялись. Дно язвы было покрыто тонким некротическим слоем и диффузно инфильтрировано лейкоцитами. В подлежащем слое созревающая грануляционная ткань имела частично упорядоченный ход коллагеновых волокон и умеренно выраженную воспалительную инфильтрацию гистиоцитами, лимфоцитами и нейтрофилами. В краях язвы выявлялись кистозно-расширенные железы, выстланные пролиферирующим эпителием (рис. 4, в). В группе с трансплантацией ММСК КМ микроскопически отмечается эпителизация язвенного дефекта. В слизистой оболочке язвенных дефектов не выявлено, обнаружены лишь зоны, где определялись железистые полости, выстланные пролиферирующим эпителием. В подлежащей строме слизистой оболочки определяется фиброзная ткань с упорядоченным ходом коллагеновых волокон и слабо выраженной воспалительной лимфоидно-гистиоцитарной инфильтрацией (рис. 4, е).
Таким образом, нами были получены не только планиметрические, но и микроскопические результаты, подтверждающие способность культивированных аутологичных ММСК обеспе-
чивать более высокий темп и более качественное заживление хронических аутоиммунных ДНЯЖ. Доказательством того, что более высокий и качественный темп регенерации аутоиммунных язв связан с сохранением жизнеспособности и функциональной активности ММСК, трансплантированных в периульцерозную зону, являются результаты иммуногистохимического выявления в ММСК генетической конструкции с Р-галак-тозидазной активностью, введенной в структуру гена LacZ E.coli (сине-зеленое окрашивание продуктов реакции X Gal) (рис. 5).
Продукты Р-галактозидазной активности были выявлены на 20-е и 30-е сутки наблюдения, и это дает нам основание считать, что, сохраняя свою жизнедеятельность и высокую функциональную активность, ММСК обеспечивали присущую им продукцию биорегуляторных пептидов, которые способствовали более быстрому восстановлению местного и системного гомеостаза, а также создавали адекватные условия для регенерации ДНЯЖ.
Выводы. 1. Модель хронической аутоиммунной ДНЯЖ показывает, что клетки костного мозга (ММСК), находясь в состоянии стрессор-ного ингибирования, не обладают оптимальной функциональной и регуляторной активностью
2. Культивирование ММСК КМ in vitro до трансплантации является важным этапом подготовки клеток, так как позволяет восстановить их биорегуляторную активность от ингибирующего влияния стресса и увеличить клеточную массу, пригодную для эффективного лечения ДНЯЖ.
М.Б.Аскаров, В.И.Шумаков, Н.А.Онищенко
«Вестник хирургии»^2009
3. Прекультивированные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки КМ ускоряют процессы регенерации ДНЯЖ за счет быстрой смены фаз язвенного процесса: сокращение сроков и выраженности деструктивно-воспалительной фазы и активизации пролиферативно-регенера-торной фазы язвенного процесса.
4. ММСК КМ реализуют свою биорегуля-торную активность в зоне язвенного дефекта не одномоментно, а за счет их длительного функционирования (в наших опытах не менее 30 сут), что подтверждается выявлением ММСК КМ, предварительно меченных рекомбинантным аденовирусом с геном LacZ Е.соИ.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Богатырев С.Р., Онищенко Н.А. Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении // Материалы ежегодной Всерос. и Межд. научн. конф.—М., 2007.—С. 55-56.
2. Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза.—М.: Медицина, 1985.—255 с.
3. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др. Участие мезен-химальных клеток-предшественников в заживлении ран на модели кожного лоскута // Клеточные технол. в биол. и мед.— 2006.—№ 3.—С. 132-134.
4. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др. Состояние пулов стволовых клеток при экспериментальном сахарном диабете // Там же.—С. 123-126.
5. Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови.—М.: Медицина, 1983.—239 с.
6. Долгих М.С., Григорьева А.Ю., Жигулин А.Ю. и др. Применение рекомбинантной аденовирусной конструкции AdSV40 —
bGal для мониторинга трансплантированных клеток // Клеточные технол. в биол. и мед.—2005.—№ 3.—С. 146-150.
7. Маев И.В., Гаджиев М.Г., Овчинникова И.М. Иммунные нарушения при эрозивно-язвенных поражениях слизистой оболочки гастродуоденальной зоны // Клин. мед.—2004.—№ 12.— С. 4-9.
8. Онищенко Н.А. Недостаточность функции жизненно важных органов как проявление иммунной дисрегуляции восстановительных процессов в них // Вестн. трансплант. и искусств. органов.—1999.—№ 4.—С. 44-48.
9. Потапова В.Б. Ультраструктура слизистой оболочки желудка и кишечника при хронических заболеваниях этих органов: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук.—М., 2000.—44 с.
10. Циммерман Я.С., Михалева Е.Н. Язвенная болезнь и иммунная система организма // Клин. мед.—2000.—№ 7.—С. 15-21.
11. Borody T., Ren Z., Pang G., Clancy R. Impaired host immunity contributes to Helicobacter pylori eradication failure // Am. J. Gastroenterol.—2002.—Vol. 97, № 12.—P. 3032-3037.
I Поступила в редакцию 03.04.2008 г.
M.B.Askarov, V.I.Shumakov , N.A.Onishchenko
MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS OF THE AUTOLOGOUS BONE MARROW ACCELERATE HEALING INDOLENT GASTRIC ULCERS
The influence of cultivated multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) of the autologous bone marrow on activity of wound healing processes was studied using the model of longindolent autoimmune gastric ulcer in rats. MMSC of the bone marrow when under the state of stress inhibition do not possess optimal and regulatory activity. Precultivated MMSC of the bone marrow accelerate the processes of regeneration of the gastric ulcer. MMSC of the bone marrow realize their bioregulatory
