CC BY
34
(N
КОРРЕКЦИЯ ЦИТОКИНОВОГО ДИСБАЛАНСА И СТИМУЛЯЦИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ДЛИТЕЛЬНО НЕЗАЖИВАЮЩИХ АУТОИММУННЫХ ЯЗВ ЖЕЛУДКА С ПОМОЩЬЮ ПЕРИУЛЬЦЕРОЗНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА
0
1 Аскаров М. Б.1, Воробьева Н. Н.2, Трубицына И. Е.2, Онищенко Н. А.1
1 ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий;
2 ЦНИИГ ДЗ г. Москва
РЕЗЮМЕ
На модели длительно незаживающей язвы желудка у крыс изучали влияние культивированной моно-нуклеарной фракции клеток (МНФ) костного мозга (КМ) на иммунный (цитокиновый) статус и регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка (ДНЯЖ) у крыс. Показано, что МНФ КМ способствуют восстановлению иммунного (цитокинового) баланса и ускоряют регенерацию ДНЯЖ.
SUMMARY
The efficiency of correction of cytokine dysbalans and peptic ulcer regeneration has been studied using the model of chronic peptic ulcer at use based on mononuclear fraction cells (MFC) of autologous bone marrow (BM). MFCs are shown to remove cytokine dysbalance, reduce systemic inflammation reaction and accelerate peptic ulcer regeneration.
Развитие язвенной болезни (ЯБ) сопровождается иммунным и цитокиновым дисбалансом, который лежит в основе формирования длительно незаживающих язв желудка и двенадцатиперстной кишки [1 - 6; 8].
Известно, что гемопоэтические клетки костного мозга обладают иммунорегуляторной активностью, обусловленной их свойством вырабатывать различные факторы (N0, TGF-в, 1Ь-10 и др.) [7; 9]. Это дало нам основание полагать, что трансплантация мононуклеарной фракции клеток (МНФ) костного мозга (КМ) в периуль-церозную зону будет способствовать регуляции и восстановлению иммунного и цитокинового баланса на местном и системном уровнях, а также окажет позитивное влияние на регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка (ДНЯЖ).
Целью настоящего исследования явилось изучение целесообразности и эффективности применения МНФ КМ для коррекции цитокинового дисбаланса в организме и стимуляции регенерации ДНЯЖ.
О!
о
о
ГЧ
¥
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводили на 30 крысах-самцах Ш1з1аг массой тела 250-300 г, у которых моделировали аутоиммунную ДНЯЖ. Для моделирования таких язв под эфирным наркозом крысам вводили 1,5 г гомогенизированной слизистой оболочки желудка аллогенного животного в объеме 1,5-2 мл физиологического раствора с добавлением к этой смеси 1,5 мл полного адъюванта Фрейнда. Полученный гомогенат вводили в подкожную клетчатку лапок животного трижды с промежутками в 7 дней. Через 35-40 дней у крыс развивалась хроническая язва желудка диаметром до 5-7 мм с изрытыми неровными краями, вокруг которых отмечались выраженный отек, гиперемия и точечные эрозии без тенденции к заживлению в течение 2,5 мес и более. Все экспериментальные животные были разделены на две группы: 1) крысы с хронической ДНЯЖ и трансплантацией МНФ КМ (15 крыс — опытная группа); 2) крысы с хронической ДНЯЖ и введением физиологического раствора (15 крыс — контрольная
Площадь язвенного дефекта, мм2
Б > а
So L Q OÆ
О i р
Щ а
HI
n Е 2 s
h ч
U
га
L
Б
га
X
л
<
га
I-
х
ш
2
s
а
ш
с
У
m
Рис. 1. Динамика заживления язвы желудка: 1 — после трансплантации МНФ КМ; 2 — после введения физиологического раствора (контроль); х — р < 0,05 по сравнению с контролем при том же сроке исследования
группа). Забор клеток КМ проводили на 30-35-е сутки после моделирования ДНЯЖ под эфирным наркозом из бедренных костей с промыванием полости кости забуференным физиологическим раствором объемом 0,5 мл. Клетки предварительно культивировали in vitro в среде IMDM (Gibco, USA), содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки (HyClone, USA) на чашках Петри при 37 °С в инкубаторе в атмосфере с 5%-ным СО2 и с 95%-ной влажностью. МНФ КМ культивировали в течение 4 суток.
Культивирование клеток КМ проводили с целью восстановления исходного уровня иммунорегуля-торной функциональной активности этих клеток и устранения дизрегуляторного влияния на них аутоиммунного процесса.
На 40-е сутки после моделирования ДНЯЖ производили лапаротомию, гастротомию и в 1-й группе — трансплантацию прекультивированной МНФ КМ в виде суспензии в количестве 6 млн клеток в 0,5 мл физиологического раствора путем обкалывания язвенного дефекта в 4 равноудаленные точки от язвы, а во 2-й группе — обкалывания язвенного дефекта 0,5 мл 0,9%-ного NaCl.
Контроль эффективности клеточной терапии оценивали визуально, планиметрическим и морфологическим методами на 10, 20, 30-е сутки после трансплантации клеток. Для морфологического исследования кусочки из язвы желудка фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине и заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Для подтверждения связи процессов регенерации с восстановлением иммунного баланса в организме, маркерами которого являются им-муноцитокины, нами производилось определение
содержания в сыворотке крови животных TNFa, 1Ь1р, 1Ь-4 до моделирования
ДНЯЖ и в динамике лечения язв. Исследование ци-токинов проводилось иммуноферментным методом с использованием тест-систем В1ашей (Швейцария), предназначенных для крыс.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате динамического планиметрического контроля состояния язвенного дефекта в двух группах животных нами были выявлены существенные различия в состоянии язв и темпах их заживления. Было установлено, что уже на 10-е сутки после трансплантации МНФ КМ отмечается достоверное уменьшение площади язвенного дефекта (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой, где язвы к 10-м суткам наблюдения остаются таких же размеров.
По-прежнему отчетливой эта разница в двух группах опытов оставалась на 20-е и 30-е сутки наблюдения. Важно отметить, что к 30-м суткам в группе животных с трансплантацией МНФ КМ наступало практически полное заживление язвенного дефекта (р < 0,05), тогда как у животных 2-й группы площадь язвенного дефекта все еще оставалась больших размеров (рис. 1) и даже к 6-му месяцу наблюдения за этими животными в контрольной группе оставались язвы размерами 0,2-0,4 мм в диаметре.
Гистологическая картина язвы желудка также претерпевала соответствующие изменения (рис. 2). В контрольной группе лейкоцитарно-некротичес-
И-4
пг/мл ТМР а
ПГ /мі 80 - 1 їй р
60 - □= 1
20 -0 - X X —*—
&
№
*
сутки
наблюдения
Рис. 3. Динамика изменения продукции про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови крыс с хронической
язвой желудка: 1 — после периульцерозного применения МНФ КМ; 2 — после периульцерозного введения физиологического раствора (контроль); х — р < 0,05 по сравнению с контролем при том же сроке исследования. Ось абсцисс — количество цитокинов (в пг/мл). Ось ординат — сроки наблюдения (сутки)
а\
о
кий слой и зона фибриноидного некроза в дне язвы были более широкими. В подлежащем слое выявлялась грануляционная ткань с умеренным количеством тонкостенных кровеносных сосудов и преобладанием фибробластов. В более глубоких отделах грануляционная ткань имела частично упорядоченный ход коллагеновых волокон и небольшое количество сосудов. В подлежащем к зоне некроза и более глубоких слоях грануляционной ткани отмечается выраженная диффузная воспалительная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов (рис. 2 а) *.
Уже на 10-е сутки в группе животных с трансплантацией МНФ КМ по сравнению с контрольной группой отмечалась более ранняя смена деструктивно-воспалительной фазы раневого процесса на пролиферативно-регенераторную фазу. Это выражалось более быстрым отторжением некротических масс, что свидетельствовало о начале репаративного процесса. В грануляционной ткани наблюдались большое количество сосудов и умеренно выраженная диффузная воспалительная инфильтрация сегментоядерными нейтрофилами, лимфоцитами с примесью гистиоцитов. В зоне краев язвенного дефекта определялись кистозно-расширенные железы с пролиферирующим эпителием (рис. 2 г).
У животных контрольной группы на 20-е сутки размеры язвы несколько уменьшились, а при гистологическом исследовании выраженных различий по сравнению с предыдущим сроком не отмечалось (рис. 2 б). Гистологическая картина ДНЯЖ, леченных МНФ, характеризовалась начальными признаками
* Рис. 2 см. на цветной вклейке в журнал.
эпителизации. Отмечалось наползание уплощенного эпителия с краев на периферию дна язвенного дефекта, представленную грануляционной тканью. В центре дна сохранялся тонкий слой фибриноида. По сравнению с предыдущим сроком в грануляционной ткани отмечалось увеличение количества кровеносных сосудов, ход коллагеновых волокон был более упорядоченным, воспалительная инфильтрация была слабо выраженная, преимущественно лимфоидно-гистиоцитарная (рис. 2 д).
На 30-е сутки у животных контрольной группы язвенные дефекты сохранялись. Дно язвы было покрыто тонким некротическим слоем и диффузно инфильтрировано лейкоцитами. В подлежащем слое созревающая грануляционная ткань имела частично упорядоченный ход коллагеновых волокон и умеренно выраженную лимфо-плазмоцитарную инфильтрацию. В краях язвы выявлялись кистозно-расширенные железы, выстланные пролиферирующим эпителием (рис. 2 в). В группе животных с трансплантацией МНФ КМ к 30-м суткам макроскопически язва не выявлялась, на ее месте отмечались рубцовые тяжи, конвергирующие к центру. Микроскопически отмечалась эпителизация язвенного дефекта. В слизистой оболочке определялись кистозно-расширенные псевдопилорические железы. В подлежащей ткани выявлялась фиброзная ткань с упорядоченным ходом коллагеновых волокон и слабо выраженной воспалительной лимфоид-но-гистиоцитарной инфильтрацией (рис. 2 е).
Положительную динамику регенераторных процессов в зоне язвенного дефекта под влиянием МНФ КМ мы связываем с позитивным иммуноре-
гуляторным действием этих клеток, которое мы контролировали по динамике изменения цито-кинового профиля в двух исследуемых группах животных (рис. 3).
Мы установили, что через 24 часа после моделирования ДНЯЖ в сыворотке крови крыс резко повысилось содержание провоспалительных (1Ь-1в, ТОТ-а, №N-7) цитокинов и резко снизилось содержание противовоспалительного (1Ь-4) цитокина. Указанные сдвиги в контрольной группе (на фоне применения физиологического раствора) продолжали сохраняться в течение всего последующего срока наблюдения. На фоне трансплантации МНФ КМ наступало отчетливое по сравнению с контролем снижение ТОТ-а (достоверное на 20-е сутки наблюдения), а также выраженное снижение 1Ь-1в, достоверное на 10, 20 и 30-е сутки, и выраженное снижение №N-7, которое по сравнению с контролем было достоверным на 20-е сутки наблюдения. Динамическое исследование 1Ъ-4 в сыворотке крови позволило установить его достоверное увеличение по сравнению с контролем на 10-е и 30-е сутки после лечения.
Полученные данные свидетельствуют о наступающем снижении системной воспалительной реакции в организме под влиянием МНФ КМ, которое создает благоприятные условия для развития балан-
са про- и противовоспалительных цитокинов и активизации морфогенетической функции иммуноцитов. Отражением этих процессов являются достоверно более высокий темп и качественное заживление ДНЯЖ.
ВЫВОДЫ
1. Моделирование ДНЯЖ характеризуется ингибированием процессов репаративной регенерации слизистой оболочки желудка, которое развивается на фоне цитокинового дисбаланса в организме, характеризующегося повышением провоспалительных (ТОТ-а,
№N-7, 1Ь-1Р) и снижением противовоспалительного (1Ь-4) цитокинов.
2. Ускорение процессов репаративной регенерации длительно незаживающих язв желудка под влиянием трансплантированных МНФ КМ происходит на фоне восстановления нарушенного цитокинового баланса.
3. Устранение цитокинового дисбаланса в организме крыс после трансплантации МНФ КМ способствует снижению системной воспалительной реакции, ингибирует иммунное воспаление на местном уровне и тем самым ускоряет заживление аутоиммунных язв.
Б > а
So L о
<а
О £ р
Щ а
HI
a.
Н ч
U
га
L
Б
га
X
л
<
га
I-
х
ш
2
s
а
ш
с
У
m
ЛИТЕРАТУРА
1. Ковальчук Л. В., Мудров В. П., Нелюбин В. Н. и др. Роль цитокинов в иммунопатогенезе заболеваний гастродуоденальной области при Helicobacter pylori-инфекции//Иммунология. — 2003. — № 3. — С. 311-314.
2. Кондрашина Э.А., Калинина Н. М., Давыдова Н. И. и др. Особенности цитокинового профиля у пациентов с хроническим H. pylori-ассоциированным гастритом и язвенной болезнью//Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 4. — С. 3-11.
3. Маев И. В., Гаджиева М. Г., Овчинникова И. М. Иммунные нарушения при эрозивно-язвенных поражениях слизистой оболочки гастродуоденальной зоны// Клин. мед. — 2004. — № 12. — С. 4-9.
4. Малов Ю. С., Дударенко С. В., Оникиенко С. Б. Язвенная болезнь. — СПб., 1994.
5. Пальцев А. И., Черных Е. Р., Лебедев А. Г. Нарушения иммунорегуляции при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной киш-ки//Эксперим. и клин. гастроэнтерол. — 2005. — № 5. — С. 34-38.
6. Циммерман Я. С., Михалева Е. Н. Язвенная болезнь и иммунная система организма//Клин. мед. — 2000. — № 7. — С. 15-21.
7. BanaiS., JaklitschM. T., ShouM. etal. Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs//Circulation. — 1994. — Vol. 89, № 5. — P. 2183-2189.
8. Borody T., Ren Z., Pang G. et al. Impaired host immunity contributes to Helicobacter pylori eradication failure.//Am. J. Gastroenterol. 2002. — Vol.
97, № 12. — P. 3032-3037.
9. Hess D., Li L., Martin M. et al. Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration//Nat. Biotechnol. — 2003. — Vol. 21, № 7. — P. 763-770.
