CC BY
18ISSN ÜS6S-5SS6
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2ÜÜ4, том 14, № 1, с. 3-9
ОБЗОРЫ =
УДК 54.063: 57.086.15 © Б. Г. Беленький
МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ МИКРОДИАГНОСТИКА НА ОСНОВЕ БИОУЗНАВАНИЯ: ЧЕТЫРЕ ПОКОЛЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМЫХ МИКРОФЛЮИДНЫХ СИСТЕМ
Статья посвящена проблемам микроминиатюризации в биоаналитике. Рассмотрены современные системы, реализующие микрометоды молекулярного биоузнавания. Особенное внимание уделено микрофлюидным чип-анализаторам (МФЧА). Проводится сравнительный анализ методов мультиплексной микродиагностики.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время интенсивно развиваются методы мультиплексной микродиагностики на основе биоузнавания (биосенсоры). В 2002 г. выпуск соответствующих приборов за рубежом достиг 1 млрд. долларов США. Эти приборы используются в генетическом анализе (геномика), анализе белков (протеомика), анализе метаболизма (ме-табономика). Микрометоды мультиплексного анализа объединяются в три формата, которые могут найти и уже находят широкое применение во многих отраслях современной науки и техники.
Помимо удешевления приборов их миниатюризация дает большие преимущества за счет:
• уменьшения стоимости анализа;
• сокращения времени анализа;
• снижения потребления реагентов и анализируемых веществ;
• уменьшения производства потенциально вредных побочных продуктов;
• повышения эффективности разделения;
• возможности проведения анализа в полевых условиях.
ТРИ ФОРМАТА МИКРОМЕТОДОВ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ БИОУЗНАВАНИЯ
Каналы в микроприборах по своим размерам и условиям течения (=100 мкм, 0.1 см/с) приближаются к кровеносным капиллярам в живом организме. Уменьшение геометрических размеров каналов приводит к увеличению разрешающей способности, однако узкие каналы предъявляют более высокие требования к системе детектирования, подвержены засорению и более чувствительны к адсорбции на их внутренней поверхности.
Реальные микролинейки биосенсоров (МЛБС) получают, пришивая биосенсоры-диагностикумы
к стеклянному или пластиковому планшету (матрице) или синтезируя на них сет олигонуклеотидов или олигопептидов с помощью автоматических методов нуклеотидного или пептидного синтеза, по заданной программе управляя процессом синхронного мультисинтеза с помощью сменяемых фотошаблонов (масок) — система "Affimetrix". Может быть использован и вариант предварительного синтеза лигандов и их программированной пришивки к планшету. Опознание (идентификация) лигандов, копулированных (прореагировавших) с размещенными на планшете биосенсорами, производится по их заранее известному положению на планшете (топологическое кодирование) с помощью планшетного флюориметра (система "Affimetrix").
Картирование на чипах, представляющих виртуальную микролинейку биосенсоров, реализуют, используя сет цветокодированных латексов (который получают путем пришивки биосенсоров к цветокодированным носителям), по соотношению в окраске латексов двух флюоресцентных красителей. Феномен взаимодействия (копуляция) латексов с диагностируемыми лигандами, маркируемыми третьим, сигнальным, красителем-флюорофором, производится в определенных температурно-временных условиях и выявляется с помощью трехцветного проточного цитофлюо-риметра — целл-сортера (система "FlowМetrix"). Причем два цветовых канала служат для опознания (цветокодирования) биосенсоров.
Идентификация лигандов может быть основана также на использовании микрофлюидных чип-анализаторов (МФЧА) — микроприборов высоко -эффективного капиллярного электрофореза, которые оснащены устройствами ввода проб и дерива-тизации, управляемыми микропроцессорным контроллером (lab-on-a-chip) .
Для МФЧА характерно огромное число химических операций, производимых на ограниченной площади. Эти аналитические системы предназначаются для автоматического биохимического,
иммунного и генетического (гибридизационного) микроанализов. МФЧА — это мультиплексный микроаналитический проточный прибор с высокочувствительным детектированием, предназначенный для скоростного и многоступенчатого анализа. Важнейшее требование к МФЧА — его компактность, т. е. размещение его компонентов (капилляра, детектора и т. д.) на малой площади.
ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИЙ МЛБС И МФЧА
Технология микрокартирования (на МЛБС):
1) изготовление полимерной матрицы в системе "Affimetrix", цветокодированных латексов в системе "FlowМеtrix";
2) изготовление аналитической матрицы биосенсоров (микролинейки биосенсоров) путем автоматической аппликации: пришивки диагности-кумов (очищенных аффинным или другим селективным методом) с топологическим кодированием ("Affimetrix") или с цветовым кодированием (в системе "FlowМetrix" — виртуальная линейка двухцветокодированных латексов);
3) введение в аналиты сигнальной флюоресцентной метки (для наблюдения копуляции ана-литов с реальной МЛБС или виртуальной линейкой ("FlowМetrix");
4) копуляция (взаимодействие) аналитов с реальной МЛБС или виртуальной линейкой ("FlowМetrix");
5) наблюдение (распознавание, биоузнавание) копуляции с помощью планшетного флюоримет-ра по топологическим признакам (в системе "А£-fimetrix") или с помощью трехцветового проточного цитофлюориметра (целл-сортера) по цветовым (в системе "FlowMetrix") признакам.
Технология МФЧА:
1) изготовление МФЧА, подготовка к анализу;
2) получение конъюгата аналита с биосенсором;
3) узнавание (диагностика) аналита по времени электромиграции конъюгата аналита с биосенсором или другим признакам (спектры, электрофоретическая диагностика связывания иммунокомпонентов).*)
Наиболее распространенным методом биоузнавания является иммуноанализ. Здесь критическую роль играет изготовление монофункциональных антител, требующее сложных биологических методов (моноклональных антител в гибридной технологии) или прецизионных методов аффинного фракционирования полифункционального набора
) Принципиальным шагом в развитии технологии МФЧА была бы инсталляция в МФЧА монолитных сорбентов — система МФЧА(М) для микрохромато-графического фракционирования проб.
антител (иммуноспецифической сыворотки).
Выбор метода микромультиплексной диагностики определяется в первую очередь конкретной аналитической задачей. Например, поиском кандидатов в лекарства на основе взаимодействия библиотеки лигандов с белком-мишенью (эта разновидность метабономики представляет одну из наиболее сложных, одновременно важных задач аналитической биотехнологии и является прототипом многих других биотехнологических исследований).
Поиск кандидатов в лекарства можно организовать следующим образом:
а) с использованием МЛБС, полученной путем автоматической аппликации лигандов-биосенсоров: после копуляции флюоресцентно-мечен-ного белка-мишени с библиотекой лигандов МЛБС ее промывают и исследуют флюоресцирующие конъюгаты биосенсоров с белком-мишенью, используя с этой целью масс-спектрометр MALDI-MS для определения их химической структуры ("новизны");
б) при использовании МФЧА получают флюоресцирующие потенциальные конъюгаты (кандидаты в лекарства) взаимодействием библиотеки лигандов с флюоресцентно-меченным белком-мишенью и сравнивают полученную с помощью МФЧА электрофореграмму конъюгатов с элек-трофореграммой нативной флюоресцентно-меченной библиотекой лигандов. Наличие на электрофореграмме конъюгатов флюоресцирующих зон помимо флюоресцентно-меченного белка-мишени рассматривается как указывающее на взаимодействие (копуляцию) лиганда с белком-мишенью. Далее эту флюоресцирующую зону исследуют с помощью масс-спектрометра.
Очевидно, что процедуру с изготовлением МЛБС целесообразно использовать для одновременной работы с несколькими белками-мишенями (с разными флюоресцентными метками).**-1
Таким образом, все три метода ("Affimetrix", "FlowMetrix" и МФЧА) мультиплексной микродиагностики могут с успехом использоваться для поиска кандидатов в лекарства на основе взаимодействия библиотеки лигандов с белком-мишенью (в формате метабономики), как и в других аналогичных задачах. При этом характерной особенностью МЛБС является возможность их использования для прецизионного off-line анализа 100 и более лигандов или биологических функций, в то время как МФЧА — это аналитические системы on-line анализа, которые целесообразно применять
**) Вместо флюоресцентных маркеров можно применять другие, например электроактивные (с использованием более дешевого АМД), однако электрохимическое детектирование белков требует доработки.
в качестве портативных (переносных, карманных) дешевых анализаторов физико-химических параметров и биологических функций (до 200).
Отметим, что главные затраты при использовании МЛБС связаны с аппликацией диагностику-мов (получение МЛБС) и изготовлением планшетного флюориметра (при использовании метода проточного целл-сортера ("FlowMetrix")), а в случае МФЧА — с изготовлением чип-анализаторов. Безусловно, при использовании МЛБС эти затраты выше, т. к. в "FlowMetrix" используется групповое изготовление биосенсоров. Понятно, что именно МФЧА следует отнести к числу критических технологий биомедицинского анализа.
ПРЕДАНАЛИЗНАЯ ПОДГОТОВКА В ТЕХНОЛОГИЯХ МЛБС И МФЧА
Важнейшим элементом мультиплексной микродиагностики является подготовка прибора к анализу. Для оценки этого параметра можно использовать время подготовки, связанное с числом необходимых операций. С этой целью:
• для МЛБС ("АШтейх") необходимо:
а) пришить лиганды к матрице, б) пришить сигнальный флюорофор к аналитам;
• для метода "FlowMetrix" необходимо:
а) пришить биосенсоры-диагностикумы к пулам
цветокодированных латексов, б) составить из них диагностическую панель, в) пришить сигнальный флюорофор к аналитам;
• для МФЧА необходимо только пришить
сигнальный флюорофор к аналитам.
При сравнении описанных трех методов мультиплексной микродиагностики следует учесть большее время подготовки прибора к анализу у МЛБС ("АШтейх"), высокую стоимость проточного цитофлюориметра (целл-сортера), используемого в методе "FlowMetrix". Эти факторы отдают предпочтение МФЧА.
В табл. 1 показаны особенности методов мультиплексной микродиагностики. Из таблицы видно, что как метод биоузнавания наиболее эффективен метод МФЧА. Он же имеет наилучшее отношение качество/цена и поэтому является предпочтительным.
СОВРЕМЕННАЯ МИКРОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА — ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ МИКРОФЛЮИДНЫЙ ЧИП-АНАЛИЗАТОР (МФЧА) НА ОСНОВЕ ПОЛИИМИДОВ С ИНТЕГРИРОВАННЫМ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТОРОМ
В основе этого анализатора лежит комплекс новаций в области высоких технологий, который должен обеспечить беспрецедентно высокий уровень МФЧА, превосходящий соответствующие
коммерческие зарубежные аналоги. Применение этого МФЧА в биомедицинском анализе в России будет способствовать его развитию в нашей стране при максимальной доступности и минимальной стоимости приборов. При этом следует отметить относительную легкость выполнения технологических операций при его изготовлении.
За границей в разработке и изготовлении мик-рофлюидных (МФ) приборов занят ряд зарубежных университетов (Политехническая школа, г. Лозанна, Швейцария; Стэнфордский, Мичиганский, Луисвилльский университеты, США). В России — Институт аналитического приборостроения РАН и ЗАО "Люмекс". Российские разработчики в значительной мере повторяют начальные этапы развития МФЧА за рубежом. Основным требованием к современным МФЧА является использование оптимальных технологий разработки и изготовления, обеспечивающих массовое производство с минимальными затратами и значительным сокращением времени между возникновением идеи конструкции МФЧА и ее практической реализацией. Под оптимальной технологией понимается скоростное изготовление каналов, создание микродетекторов, сборка чипов. Выбор оптимальных материалов и технологий изготовления МФЧА должен обеспечить получение микроприборов с инертной поверхностью (биосовместимых) для использования в биомедицинском анализе.
В основе МФЧА лежит микрофлюидика, под которой понимают физико-химическую гидродинамику ламинарных потоков. Современные полимерные МФЧА можно собирать (ламинировать открытые каналы) при комнатной температуре.
МФЧА включает аналитический процессор, представляющий канализированную пластину с устройством ввода пробы, детектор, потенцио-стат, систему обработки информации. Созданные МФ-системы развиваются с использованием различных материалов и технологий. Можно назвать четыре поколения биосовместимых МФЧА-сис-тем.
• Первое поколение — МФЧА на основе стеклянно-кремневой технологии микроэлектроники и детектора лазер-индуцируемой флюоресценции (ЛИФ) [1]. Используемые технологии: фотолитография (травление, сверление отверстий — микрососудов, нанесение контактов), сборка прибора (склейка, сварка). При этом используются хорошо полированные стеклянные заготовки (для минимизации растрава при травлении).
Коммерциализация — лабораторный прибор.
• Второе поколение — микрофлюидные системы на основе эластомерной (полидиметилсилок-сановой, ПДМС) технологии [2] и амперометрического детектора (АМД) [3] (ПДМС-технология
Табл. 1. Сравнение эффективности систем (методов) мультиплексной микродиагностики (биоузнавания)
№ Характеристики Методы мультиплексной микродиагностики
метода МЛБС ("ААйшеШх") "FlowMetrix" МФЧА
1 Аналитическая система О£Т-1іпе О£Т-Нпе, сет цветокодированных латексов с пришитыми лигандами Оп-1іпе
2 Изготовление чип-анализатора Стандартное Стандартное Индивидуальное, нестандартное
З Конструкция по- Биочип — планшет Групповое изготовле- Более сложная,
лимерной осно- с пришитыми ние цветокодирован- чем биочипа
вы биочипа лигандами, относительно проста ных латексов, относительно проста
4 Конструкция Планшетный Целл-сортер, Амперометриче-
анализатора флюориметр, относительно проста сложная ский детектор (АМД) интегрирован с биочипом; относительно проста
5 Время и надеж- Малое, надежное Надежное Малое, менее на-
ность детектиро- (кинетический кон- дежное, чем
вания троль) в МЛБС
б Преимуществен- Прецизионный ана- Прецизионный анализ Портативные ана-
ное применение, лиз известных био- известных биологиче- лизаторы физ.-хим.
число анализи- логических функ- ских функций, параметров, в т.ч.
руемых функций ций, 64 биолог. функций
(аналитов) 100 и более более100
7 Мультиплекс-ность — разнообразие аналитических сайтов (функций) Не ограничена Не ограничена Ограничена, ана-литы одного или близких классов веществ
S Возможность иммуноанализа, составления иммунных диагностических панелей Требует развития, не ограничена
9 Главные затраты Аппликация диаг- Изготовление цветоко- Изготовление чип-
ностикумов, изго- дированных латексов, анализаторов
товление планшет- целл-сортера
ного флюориметра
может использоваться для изготовления целл-сортера, линейки электродов, микросборников). Используемые технологии: быстрое макетирование, изготовление реплик, нанесение контактов, адгезионная сборка. Благодаря липкости ПДМС и простоте адгезионной сборки чипов не требуется чистых, обеспыленных комнат и специальной сборки-склейки.
Коммерциализация — биоаналитические технологии, карманный прибор.
• Третье поколение — микрофлюидные системы на основе полиимидов [4], для которых характерны: термо- и химическая стойкость, регулируемые адгезия и реология, использование АМД, возможность создания сложных многослойных МФЧА. Технологии: фотолитография с использованием полиимидных фоторезистов, анодное травление, перенос слоев, метод вспомогательного слоя, нанесение контактов, ламинирование.
Коммерциализация — карманный прибор.
Табл. 2. Перспективные области применения микрофлюидного чип-анализатора, МФЧА (по опыту использования высокоэффективного капиллярного электрофореза, ВЭКЭ)
Область применения Выполняемые функции
Защита от химического и биологического оружия Клинический анализ Высокопроизводительное обследование (скрининг) Контроль окружающей среды Фундаментальные исследования Исследование химических реакций Исследование малых количеств пробы (следовой анализ) Поиск кандидатов в лекарства Генетический микроанализ Раннее обнаружение и идентификация патогенов и токсинов, ранняя диагностика особо опасных инфекций Экспресс-анализ крови и биологических жидкостей; диагностика у постели больного на основе иммунологического и биохимического анализов (формирование диагностических панелей); анализ нейротрансмиттеров, аминокислот Токсикологический анализ, анализ наркотиков Оперативный анализ загрязнений окружающей среды Специальный микроаналитический анализ Изучение энзим-субстратного взаимодействия, комплексооб-разования, кинетики реакций в водных растворах Выполнение функций микросистемы пробоподготовки Исследования взаимодействия библиотек лигандов с белком-мишенью методами МФЧА, "А£йтеШх", "FlowMetrix" В порядке повышения сложности: — анализ ПЦР-фрагментов ДНК для диагностики онкологических, инфекционных (СПИД, гепатиты В и С, туберкулез) заболеваний; — генотипирование (в медицине — для диагностики заболеваний, в криминалистике — для идентификации личности, в сельском хозяйстве — для селекции ценных пород животных и сортов растений); — мониторинг экспрессии генов; — количественное определение ДНК-маркируемых патогенов; — определение нуклеотидной последовательности (секве-нирование) ДНК (в перспективе)
• Четвертое поколение — микрофлюидные системы на основе полиимидов. Используемые технологии: МФ-приборы третьего поколения
плюс оптронный ЛИФ-мультидетектор на основе полупроводниковых гетероструктур типа А3В5 (ОЛИФ [5]).
Коммерциализация — биоаналитические технологии, карманный прибор.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Размышляя о будущем развитии микрофлюид-ных приборов, можно высказать следующие соображения:
1) в МФЧА для подачи раствора можно применить не только электроосмос, но и микронасос.
2) необходимо развить амперометрическое детектирование в МФЧА для анализа белков (применительно к иммуноанализу).
3) помимо АМД в качестве детектора можно
использовать масс-спектрометр: микроэлектро-
спрей для МФЧА, МАЬБІ для МЛБС.
4) движение жидкости в каналах МФЧА может быть оптимизировано на основе микрофлюи-дики (физико-химической гидродинамики ламинарного потока).
В настоящее время отказываются от использования в МФЧА дорогостоящих громоздких оптических (ЛИФ) детекторов и переходят на электрохимический (амперометрический) детектор
(АМД), по чувствительности близкий флюоресцентному, но значительно более простой и дешевый.
Имеется принципиально новый, предложенный в прошлом году в Стэнфордском университете подход, основанный на применении для детектирования в микрочипах сверхминиатюрных интегрированных оптронных ЛИФ-мультидетекторов на основе полупроводниковых гетероструктур типа А3В5. Использование подобного детектора решает проблему изготовления сверхмалых (размером с наручные часы) МФЧА.
Таким образом, из приборов мультиплексного микроанализа по целому ряду характеристик выделяются как наиболее эффективные приборы МФЧА. А из них реальными для сегодняшней России являются МФЧА третьего поколения (по-лиимидные чип-анализаторы с монолитным сорбентом и микросхемными высокочувствительным АМД и высоковольтным потенциостатом с нано-секундным переключением).
Перспективные области применения МФЧА указаны в табл. 2.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Manz A., Harrison D.J., Verpoorte E., Wid-mer H.M. Planar chips technology for miniaturization of separation systems: A developing perspective in chemical monitoring // Adv. Chroma-togr. 1993. V. 33. P. 1-66.
2. Duffy D.C., McDonald J.C., Schueller O.J.A., Whitesides G.M. Rapid prototyping of microflu-idic systems in poly(dimethylsiloxane) // Anal. Chem. 1998. V. 70, N 23. P. 4974-4984.
3. Metz S., Holzer R. and Renaud Ph. Polyimide-based microfluidic devices // Lab on a Chip. Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, 2001. V. 1, N 1. P. 29-34.
4. Woolley A.T., Hadley D., Landre P. et al. Functional integration of PCR amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device // Anal. Chem. 1996. V. 68, N 23. P.4081-4086.
5. Locascio L.E., Perso C.E., Lee C.S. Measurement of electroosmotic flow in plastic imprinted microfluid devices and the effect of protein adsorption on flow rate // Journal of Chromatography A. 1999. V. 857, N 1-2. P. 275-284.
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург
Материал поступил в редакцию 1.12.2003.
MULTIPLEX MICRODIAGNOSTICS BASED ON BIORECOGNITION: FOUR GENERATIONS OF BIOCOMPATIBLE MICROFLUIDIC SYSTEMS
B. G. Belenkii
Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg
The paper is devoted to microminiaturization problems in bioanalytics. State-of-the-art systems that realize microtechniques of molecular biorecognition are considered. Particular attention is given to microfluidic chip analyzers (MFCA). A comparative analysis of multiplex microdiagnostic techniques is made.
