CC BY
155
2012 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 4. Вып. 2
ХИМИЯ
УДК 543.544
А. В. Николаев, Л. А. Карцова
МИКРОФЛЮИДНЫЕ СИСТЕМЫ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА С ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
Введение. Концепция микрофлюидных аналитических систем была впервые предложена группой А. Манца в 1990 г. [1] и с тех пор получила широкое развитие во многих странах мира. Суть её в том, что все стадии химического анализа (ввод пробы, разделение, детектирование) проводятся на одном и том же устройстве — микрофлюидном чип-анализаторе (МФЧА).
Такие преимущества микрофлюидных систем, как значительное уменьшение объёма пробы и расхода реагентов, портативность и простота изготовления, делают их крайне привлекательными для разработки и внедрения. В капиллярном электрофорезе (КЭ) на микрочипах используются различные варианты детектирования. Наиболее широко распространены оптические методы детектирования [2]. Активно используется лазерно-индуцированная флуоресценция (ЛИФ-детектирование). Однако большинство соединений не флуоресцируют, и необходима предварительная процедура дериватиза-ции. Имеются сообщения об МС-детектировании в микрофлюидных устройствах, но такие системы весьма дорогостоящи и не являются портативными [3].
Электрохимическое детектирование идеально подходит для миниатюрных аналитических систем. Чувствительность и селективность ЭХ-детектирования сопоставима с ЛИФ-детектированием. Многие аналиты могут быть обнаружены без проведения стадии дериватизации. Микроэлектроды изготавливаются непосредственно на самом микрочипе при помощи обычных фотолитографических методов, что позволяет получать полностью интегрированное устройство. Пределы обнаружения аналитов для микрочипового капиллярного электрофореза находятся в наномолярном диапазоне [3].
Материалы микрочипов. Изначально микрочипы в КЭ изготавливались из стекла и кремния с использованием стандартных методов фотолитографии и травления [4, 5]. Кремний обладает высокой теплопроводностью. Однако он не прозрачен в УФ-об-ласти, в которой осуществляется детектирование компонентов большинства биологических объектов [6]. Наиболее часто применяют стекло благодаря его хорошим оптическим свойствам, устойчивости к воздействию многих реагентов, особым свойствам поверхности, диэлектрическим характеристикам (возможность работать при высоких
© А.В.Николаев, Л. А. Карцова, 2012
напряжениях, использующихся в КЭ) и относительной простоте модификации поверхности. Другими преимуществами стекла являются его термостойкость и совместимость при работе с биологическими объектами (разделение ДНК, иммунологический анализ, клеточная биология и т. п.) [7].
В последние годы отмечен интерес к полимерным материалам. Для изготовления МФЧА применяют полидиметилсилоксан (ПДМС) [8, 9], полиметилметакрилат (ПММА) [10, 11], поликарбонат [3], полистирол [12] и полиэтилентерефталат [13], олефиновые полимеры Topas [14] или Zeonor [15]. Активное использование ПДМС обусловлено следующими свойствами: он оптически прозрачен, полимеризует-ся при низких температурах, способен закрепляться на гладких поверхностях путём обратимой адгезии при комнатной температуре. Следует отметить, что хотя ПДМС не даёт стабильного электроосмотического потока, обработка его поверхности плазмой кислорода или воздуха позволяет достичь значительного увеличения её гидрофильных свойств [16].
На рис. 1 представлены диаграммы, отражающие, какие материалы чаще всего применяются для изготовления микрофлюидных аналитических устройств.
Модификация поверхности микрокапилляров. При анализе в чип-формате возможность управлять химическими свойствами внутренней поверхности каналов крайне важна из-за присущих микроаналитическим системам высоких значений соотношения площадь—объём. Модификация поверхности каналов позволяет контролировать электроосмотический поток (ЭОП) и предотвращать взаимодействие молекул аналита со стенками каналов [17].
Существуют различные способы обработки поверхности. Ниже обсуждаются методы, используемые при обработке ПДМС.
Обработка плазмой. При обработке плазмой используются кислород, азот, водород. В настоящее время этот метод применяют наиболее часто [18]. Основная трудность при модификации поверхности канала связана с регенерацией поверхности ПДМС [19]. В [20] описан способ преодоления этой проблемы: перед обработкой полимера проводится последовательная обработка триэтиламином, этилацетатом и ацетоном для удаления олигомеров. В [18] авторы предлагают выдерживать поверхность в контакте с водой. При этом отмечается стабильность ЭОП в течение 2 недель.
УФ-обработка. Данный метод способствует более глубокой модификации поверхности, не вызывая при этом механических повреждений ПДМС, хотя и требует большего времени [21]. Более гидрофильную поверхность получают при облучении УФ в присутствии кислорода.
Химическое осаждение из газовой фазы. Суть этого подхода заключается в получении тонкой плёнки на поверхности субстрата за счёт осаждения из газовой фазы молекул [22]. Процесс, как правило, включает стадию сублимации, пиролиза и осаждения. В [23] ПДМС модифицировали поли(4-бензоил-п-ксилилена-ко-п-ксилиленом). Для улучшения связывания при формировании микроканалов в [24] использовали два комплементарных поли(п-ксилилена): поли(4-аминометил-п-ксилилена-ко-п-ксилилен)
20
16
н 12
о
0
1 8' у
4-
ПДМС
52% Полимеры 10% ПДМС/стекло 38% стекло
1
ПММА
ПДМС/ стекло
I I
34 Материал
ПЭТ
Topas
5
Рис. 1. Применение различных материалов в МФЧА в период с 2005 г. [16]
стекло
0
и поли(4-формил-п-ксилилена-ко-ксилилен) для образования кросс-связей оснований Шиффа.
Покрытие металлами и оксидами металлов. В [25] описана процедура нанесения TiO2 на ПДМС. Хотя после покрытия материал сохранял свою прозрачность, сильное растрескивание поверхности делает этот метод неэффективным. В работе [26] сообщается, что при модификации золотом (< 1 нм) этого не происходит. Металлические покрытия использовались для поддержания гидрофильности поверхности ПДМС после обработки плазмой. Активация ПДМС аргоновой плазмой с последующим напылением на поверхность алюминиевой плёнки (44 нм) обсуждается в [20]. При такой обработке гидрофильные свойства ПДМС могут сохраняться в течение 30 дней.
Послойное осаждение. Эта техника, как правило, описывается как адсорбция полианионов и поликатионов с образованием мультислоёв полиэлектролита [27]. К её достоинствам следует отнести простоту, эффективность и возможность контроля толщины. При этом структура, функциональность и стабильность поверхности зависят от многих факторов: ионной силы полиэлектролита и концентрации, типа растворителя, температуры и pH раствора. В качестве первого слоя при этом способе модификации ПДМС широко использовались поликатионы поли(диаллилдиметиламмонийхлорид) [28] и хи-тозан (Chit) [29].
Силанизация. Поверхностная силанизация может быть выполнена на различных подложках при условии, что они содержат поверхностные гидроксильные группы, которые будут реагировать с алкоксиланами с образованием силоксановой связи Si—O—Si. При применении алкоксисиланов с терминальными амино-, тио- или карбоксильной группами можно использовать различные варианты модификации поверхности [30].
Динамическая модификация поверхности. Этот метод предполагает использование поверхностно-активных веществ (ПАВ) или ионных жидкостей. Модификаторы поверхности ПДМС добавляются в буферный электролит. Для динамического покрытия используются многие ПАВ: додецилсульфат натрия [31], Brij35 [32], деоксихолат натрия [31], фосфатидная кислота [31], поливинилпирролидон [33], n-додецил-^-^-мальтозид [34], тритон Х-100 [35].
Комбинация газофазных и мокрых химических методов. В [36] энергия плазмы используется для окисления поверхности ПДМС с формированием силанольных групп, способных реагировать с алкокси- или хлорсиланами для получения требуемой функциональности.
Особую важность представляет модификация внутренних стенок канала при анализе биологических объектов, например, взаимодействие антител на гидрофобной поверхности может привести к денатурации протеинов [37].
Описаны различные методы, позволяющие получать стабильную гидрофильную поверхность в ПДМС канале. В [38] разработан простой и надёжный способ пассивации поверхности за счёт химической функционализации последовательной обработкой ами-нопропилтриэтоксисиланом, глутаровым альдегидом, поливиниловым спиртом.
Создание микроструктур на матрице чипа. Процессы обработки стеклянных матриц занимают много времени и предъявляют повышенные требования к чистоте аппаратуры и реагентов, вследствие чего получаемые микрочипы обычно слишком дороги, чтобы использоваться в качестве одноразовых устройств. Для получения глубоких каналов (> 50 мкм) применяют «сухое» травление, лазерную абляцию [39], травление плазмой [40], однако эти методы дорогостоящи и требуют сложного аппаратного оформления.
После создания микроканалов систему необходимо собрать, закрыв матрицу с каналами и резервуарами «крышкой», чтобы обеспечить движение жидкости внутри микрочипа. Для эффективного закрепления применяются анодное и термическое связывание, обжиг [41].
Для создания необходимых микроструктур (каналов, резервуаров) в стеклянных субстратах обычно применяют стандартную фотолитографию [1].
Обработка полимерных материалов. Существует два основных способа создания полимерных чипов: репликация с матрицы и непосредственная обработка слоя полимера [7]. Создание реплик подразумевает получение микроструктур формированием точной полимерной копии с образца. К таким методам относятся: эмбоссирование (горячее тиснение) [42], отливка [43], формование [44], прессование. Они характеризуются низкой стоимостью и высокой воспроизводимостью.
Формирование микроканалов и других структур с помощью отливки включает два основных этапа: создание маски и перенесение структур с образца на полимерный субстрат. Можно проводить непосредственное удаление небольшого количества полимера в областях, где будут расположены микроструктуры чипа. Такие процессы и называются лазерной абляцией (выжиганием) [45].
Горячее тиснение — процесс, при котором маску (форму) впечатывают в разогретый, размягчённый термопластик (полимер), затем охлаждают и таким образом получают зеркально отображённую реплику. Весь процесс занимает несколько минут и удобен для быстрого изготовления большого количества устройств [42].
Формование подразумевает применение химических процессов для затвердевания полимера [46]. В этом случае необходимо наличие двух компонентов: основы (жидкий полимер или мономер) и затвердителя. Сразу после их смешивания начинается процесс химического закрепления. Такая технология особенно часто используется при обработке эластомерных материалов, таких, как ПДМС, поскольку они способны герметично, но обратимо присоединяться к гладким поверхностям за счёт сил адгезии.
Обработка поверхности полимеров лазером — метод, основанный на удалении участков субстрата с помощью интенсивного УФ- или ИК-излучения. Суть процесса состоит в том, что коротковолновый лазерный импульс разрушает ковалентные связи между молекулами в цепях полимера, в результате чего происходит отторжение и выталкивание разрушенных фрагментов [45]. Таким способом можно обрабатывать большинство используемых в промышленности полимерных материалов, включая ПК, ПММА, нитроцеллюлозу и политетрафторэтилен [45]. Лазерная обработка позволяет достигать высокой точности при изготовлении каналов, но является слишком дорогостоящей для массового производства.
При детектировании в капиллярном электрофорезе на чипах строго фиксированное расположение детектора должно обеспечивать незатруднённый массоперенос, минимальное уширение зон аналитов и изоляцию электрохимической ячейки от разделительного напряжения (обычно 1-5 кВ). Предложены два основных подхода к определению оптимального расположения электродов детектора [47]. Первый — учитывает расположение рабочего электрода относительно разделительного канала, так называемое «end-channel»-, «in-channel»- и «off-channel »-детектирование (рис. 2).
В случае «end-channel»-конфигурации электрод расположен непосредственно на выходе из канала. В «in»- и «off-channel»-вариантах электрод находится внутри канала, но в последнем используется разъединительный электрод или иная заземляющая система для элиминирования высокого напряжения.
In-channel Off-channel End-channel
Рабочий электрод Потенциостат Рабочий электрод Рабочии электрод
Рис. 2. Различные конфигурации электродов электрохимического детектора [47]
Второй подход предполагает расположение электрода детектора относительно направления движения жидкости [3] в капилляре: поверхность электрода параллельна движению потока («flow by»), электрод располагается перпендикулярно потоку («flow onto»), электрод помещается прямо на выходе из канала и омывается выходящим потоком («flow through»).
«End-channel»-конфигурация является наиболее распространённой и подразумевает расположение электрода на некотором расстоянии от выхода из рабочего канала
десятки микрометров) [49, 50]. Главное преимущество этого варианта — отсутствие необходимости усложнения системы дополнительными компенсирующими высокое напряжение структурами. Но есть и ограничения: снижение эффективности из-за относительно небольшой длины рабочего канала и значительного расстояния между выходным концом капилляра и рабочим электродом. Не следует помещать рабочий электрод слишком близко к выходу разделительного канала, так как незначительные флуктуации разделяющего напряжения могут вызывать сильный шум детектора [51]. Пределы обнаружения для такой конфигурации могут составлять десятки наномоль на литр.
В [52] описан новый вариант «еnd-channel»-чипа с использованием импульсного ам-перометрического детектора. В качестве рабочего электрода применялась золотая проволока, вставленная в конце сепарационного канала.
В [53] описан чип-анализатор с полностью интегрированной электродной матрицей. Выход сепарационного канала имеет серповидную или радиальную форму. Аналогичную форму имеют и электроды. Это позволяет увеличить площадь контакта с аналитом и, соответственно, соотношение сигнал—шум.
В [54] описана система с заменяемыми микроэлектродами. Рабочий электрод (Au, Pt) крепится на выходе сепарационного канала через специальную трубку, что позволило обеспечить низкий шум и высокую воспроизводимость результатов. Основное же преимущество данной конфигурации заключается в возможности быстрой замены электродов.
«In-channeh-детектирование. В этом варианте рабочий электрод располагается внутри разделительного капилляра. Аналиты достигают поверхности электрода, ещё находясь в канале, тем самым устраняя проблему уширения зон, характерную для «end-channel»-конфигурации [47]. В [55] для защиты ячейки детектора от напряжения в канале предложено использовать миниатюрный (4 х 9 х 2 см3) потенциостат. «Inchannel »-конфигурация позволила достичь значительного увеличения эффективности по сравнению с предыдущим вариантом.
В [56] описывается система, в которой применен ион-селективный амперометриче-ский микрогелевый сенсор (ionode). Методология детектирования основана на измерении тока, вызванного реакциями ионного переноса, проходящими на границе жидкость—гель.
«Off-channeh-детектирование. Данная конфигурация также разрабатывалась с целью улучшения характеристик результатов детектирования по сравнению с «end-chan-
nel»-вариантом. Чувствительный электрод располагается внутри канала, как и при «in-channel»-детектировании, но разделительное напряжение изолируется от ячейки разъединительным электродом.
В ЭХ-ячейке создается область без электрического поля, через которую аналиты движутся за счёт образовавшегося в капилляре электроосмотического потока. В [3] рассмотрено только два возможных варианта применения «off-channel»-конфигурации на МФЧА для капиллярного электрофореза [57, 58]. В первом случае использовали микро-чип, составленный из двух разных полимеров, а высокое напряжение элиминировали отверстия в верхнем слое, что и позволило разместить рабочий электрод непосредственно в рабочем канале [57]. Во втором — перед ЭХ-ячейкой детектора в капилляре располагали разъединительный палладиевый электрод [58].
Существенной проблемой в условиях «off-channel»-детектирования в водных растворах является выделение водорода на разделяющем электроде. В качестве решения этой проблемы рассматривается удаление водорода непосредственно за счёт материала электрода [59].
В [60] описана технология изготовления МФЧА с трёхэлектродной системой детектирования и платиновым разъединительным электродом, закреплёнными на обработанном кислородной плазмой слое ПДМС. Разъединительный электрод располагается перед трёхэлектродной ячейкой и предотвращает взаимодействие разделительного потенциала с потенциалом детектирования. Имеются сообщения об использовании ацетата целлюлозы в качестве компенсатора напряжения в МФЧА для капиллярного электрофореза с ЭХ-детектированием [61].
В [62] описаны полностью интегрированный ЭХ-детектор с палладиевым разъединительным электродом на гибридном (стекло/ПДМС) МФЧА. Исследована зависимость способности Pd-электрода к адсорбции водорода от его размера. В качестве тестовых аналитов для проверки работоспособности устройства использовали дофамин и эпи-нефрин. Предел детектирования составил 500 нМ и 2,1 мкМ, соответственно.
Материал электродов. На показания детектора заметное влияние оказывает материал, из которого сделан рабочий электрод. Выбор материала зависит от окислительно-восстановительных свойств аналита и фонового тока в области приложенных потенциалов. Используются материалы на основе углерода (стержни, паста, углеродные на-нотрубки); металлы (Ag, Au, Pt, Pd); модифицированная целлюлоза (в зависимости от целей анализа к её поверхности прививаются различные функциональные группы); комбинированные материалы; стекло и кварц.
Чаще всего используют углерод, платину и золото [3]. Углеродные электроды нашли наиболее широкое применение благодаря низкой степени загрязнения поверхности, широкому интервалу рабочих потенциалов и низкому сигналу фона [3]. В [63] рассмотрен первый углеродный (углеродное волокно) двойной электрод в электрофоретиче-ском МФЧА с «end-channel»-расположением ячейки детектора. В [64] описан чип на основе ПДМС с жидкими углеродными электродами (углеродная паста). Главной особенностью углеродной пасты как материала для изготовления электродов детектора считается то, что каталитические добавки можно легко наносить непосредственно на их поверхность.
Платиновые электроды нашли применение для определения пероксидов, спиртов, альдегидов и гидразинов. Имеются сообщения об экспериментальном внедрении новых материалов электродов — углеродных нанотрубок [65] или борно-алмазных плёнок [66]. Углеродные нанотрубки (УНТ) обладают высокой электрокаталитической активностью и биосовместимостью [67].
Чувствительность амперометрического детектора можно повысить, модифицируя поверхность электродов. Так, для определения некоторых гидразинов в качестве электродов применяют углеродные плёнки с палладиевым напылением [68].
В работе по определению нейротрансмиттеров в гомогенатах мозга [65] описаны процедура подготовки и использование модифицированных углеродными нанотрубками золотых электродов. Имеются работы, посвящённые использованию наночастиц металлов (Аи, Р^ Ag), обладающих большой удельной поверхностью, инертностью, высокой адсорбционной способностью для модификации поверхности электродов [69].
Проблема прямого детектирования органических веществ на электродах из благородных металлов заключается в том, что поверхность электродов быстро загрязняется за счёт адсорбции аналитов, а интенсивность аналитического сигнала снижается [67]. Очистка поверхности электродов проводится при положительных значениях потенциала, а последующая регенерация — при отрицательных [52]. В [70] описано применение нескольких вариантов химических и электрохимических методик очистки и регенерации электродов: плазменная и окислительная очистка, использование растворов перок-сида водорода и серной кислоты.
Из трёх режимов ЭХ-детектирования — амперометрического, потенциометрическо-го и кондуктометрического — амперометрические методы нашли наиболее широкое применение в капиллярном электрофорезе на микрочипах. Описаны варианты анализа с использованием кондуктометрических детекторов [71, 72], в то время как потенцио-метрическое определение практически не используется в микроформате.
Амперометрическое детектирование основано на измерении тока как функции приложенного к рабочему электроду постоянного потенциала.
В системе также имеются вспомогательный и электрод сравнения, но в некоторых случаях возможно использование двухэлектродной системы: рабочий и вспомогательный электроды [73]. Ограничение заключается в том, что низкие пределы обнаружения свойственны исключительно электроактивным веществам — окисляющимся или восстанавливающимся в пределах рабочей области потенциалов для данного электрода. Этот метод характеризуется большим диапазоном линейности и высокой воспроизводимостью.
Описано применение импульсного амперометрического определения мальтозы, глюкозы и ксилозы на гибридном МФЧА (ПДМС/стекло) с платиновым рабочим электродом [74].
В таблице представлена сводка работ с применением амперометрического детектирования.
Работы, в которых применялось амперометрическое детектирование,
и объекты анализа
Вещество Тип электрода Конфигурация электродов Ссылка
Дофамин, катехол Р1 End-channel [53]
Дофамин, катехол Аи Off-channel [60]
Дофамин, гидрохинон Углеродное волокно Off-channel [61]
Дофамин, катехол Углеродный, модифицированный нанотрубками End-channel [75]
Дофамин, катехол Углеродная плёнка End-channel [10]
Дофамин, эпинефрин Р(1 Off-chanel [62]
Окончание таблицы
Вещество Тип электрода Конфигурация электродов Ссылка
Дофамин, катехол Аи Off-chanel [76]
Дофамин, эпинефрин Пиролизованная фоторезистивная плёнка In-channel [77]
Гистамин Стеклоуглерод In-channel [78]
Креатинин, креатин Модифицированная золотом углеродная плёнка End-channel [79]
Синусоидальная вольтамперометрия — электрохимическая техника детектирования, использующая синусоидальный сигнал большой амплитуды в качестве возбуждающей волны. В [77] разработана микрофлюидная система для определения нейро-трансмиттеров, реализованная в режиме «in-channel».
При кондуктометрическом детектировании измеряется удельная электропроводность анализируемого раствора.
Различают два варианта детектирования: гальванический (пара электродов располагается в разделительном канале для измерения сопротивления жидкости) [71] и бесконтактный (электроды детектора не соприкасаются с жидкостью в капилляре) [72]. Второй — считается более предпочтительным, так как ЭХ-ячейка не подвержена воздействию высокого разделительного напряжения.
Примеры использования микрофлюидных чип-анализаторов с ЭХ-детек-тированием. Микрочипы для капиллярного электрофореза с электрохимическим детектированием позволяют работать с широким спектром аналитов без проведения дери-ватизации, поэтому наиболее широкое применение подобные устройства находят в области клинических, биологических и экологических исследований [7, 47].
Анализ нейротрансмиттеров и их производных. Эти аналиты нашли широкое применение как модельные вещества для проверки работоспособности и надёжности новых конструкций микроаналитических систем. Катехол [55] и дофамин [80], молекулы которых содержат электроактивные группы, часто используются для выявления возможностей новых методик анализа. Еще одно важное нейроактивное соединение, для которого недавно были разработаны схемы анализа с помощью КЭ на чипах, — оксид азота(П) (NO). По его содержанию проводят диагностику очагов воспаления в организме. Проблема заключается в том, что время жизни этого соединения весьма мало, так как в присутствии кислорода оно быстро окисляется. Однако имеются сообщения об использовании непрямого определения NO по содержанию нитрат- и нитрит-ионов. Этот метод сочетает электрофоретическое разделение ионов на чип с переводом нитратов в нитриты путём химического восстановления (использование покрытых медью кадмиевых гранул) с последующим амперометрическим детектированием [81].
Биологический и клинический анализы. В биологическом и клиническом анализах на уникальные особенности МФЧА возлагаются особые надежды [82].
На рис. 3 представлены электрофореграммы, полученные с использованием схем анализа с пред- и постколоночной «on-line»-дериватизацией методом КЭ в чип-формате [82, 83].
Авторы [82] разработали стеклянные микрочипы, позволяющие проводить дерива-тизацию, разделение и амперометрическое детектирование на одном устройстве, работоспособность которого проверялась на модельных смесях аминокислот. Для получения
а
б
о =о
о
в
10 нA
I
JL_a1Lc --
Л_A
100
3 нЛ
b d
I
f g
200 300 Время, с
-Г-
100
-г-
200
-1—
300
2 нЛ
c d
400
100
Время, с
200 300 Время, с
I
400
500
Рис. 3. « Оп-йпе»-схемы и электрофореграммы для 1 • 10 3М растворов глюкозы (я), содержащих различные количества аскорбиновой (Ь) и мочевой (с) кислот 2 • 10~4М (В), 5 • 10~4М (С), 7 • 10~4М р) (а) [55]; предколоночная дериватизация — электрофореграмма смеси, содержащей 1 • 10~4М гистидина (Ь), валина (с), изолейцина лейцина (е)
и 2 • 10~4М глутаминовой (1) и аспарагиновой кислот, аргинина (Ь) и лизина (1) (б) [82]; постколоночная — разделение смеси 1,5 • 10~3М аргинина (а) и 3 • 10~4М изолейцина (Ь), аланина (с) и фенилаланина (в)
b
a
0
электроактивных производных проводилась предколоночная дериватизация аналитов о-фталевым альдегидом и 2-меркаптоэтанолом; используемая конфигурация детектора — «end-channel». Описанные МФЧА позволяют проводить быстрое (6 мин) и одновременное определение аминокислот с пределом обнаружения ~ 2,5 • 10~6M, линейным откликом детектора в диапазоне до 2 • 10~4M и хорошей воспроизводимостью (R = 2,2 ^ 2,7 %).
В [84] описано определение гомоцистеина методами традиционного и чипового вариантов капиллярного электрофореза с ЭХ-детектором. Условия разделения и детектирования, использованные в традиционном КЭ, были полностью реализованы в чип-формате. Время проведения анализа удалось сократить до 2 мин.
Сообщается о применении микрочипа на основе ПДМС и стекла с «off-channel»-кон-фигурацией рабочего электрода для быстрого (< 30 с) определения мочевой кислоты в образцах мочи [85].
Имеются публикации о применении микрочипов при анализе ДНК. В [86] использован гибридный (ПДМС/стекло) микрочип для обнаружения и анализа фрагментов ДНК. Канал заполняли 5 %-ным полиакриламидным гелем. Применялось амперомет-рическое детектирование в «in-channel»-конфигурации.
В [87] чип ПДМС/стекло использовался для анализа аддуктов реакции катехол эст-рагенов и ДНК. Применялась трёхэлектродная «in-channel»-схема амперометрического детектирования с палладиевым декаплером. Перед склеиванием микрочип обрабатывался плазмой. Использовались следующие буферные системы: 10 мМ MES (pH = 5,5)
и боратный буфер (рН = 9,5). В качестве добавки к буферу применяли додецилсульфат натрия (ДДСН).
Анализ объектов окружающей среды. В данной области разработка микрофлюидных систем также приобретает приоритетное значение, ибо это один из немногих существующих вариантов, отвечающих требованиям так называемой «зелёной аналитической химии» (невысокая стоимость, простота в обращении, минимальные объёмы отработанных реагентов).
На рис. 4 представлена схема, иллюстрирующая пригодность МФЧА с простейшим крестообразным расположением каналов для быстрого (1-4 мин) разделения семи основных хлорфенольных загрязнителей, концентрацией от 1 • 10~6 моль/л.
Хлорфенолы Психотропные средства
Рис. 4. Разделение и определение фенола и шести его хлорпроизводных методом капиллярного электрофореза в чип-формате с электрохимическим детектированием — 100 мкМ фенол (а), 100 мкМ 2-хлорфенол (Ь), 200 мкМ 2,4-дихлорфенол (с), 200 мкМ 2,3-дихлорфенол 200 мкМ 2,4,5-трихлорфенол (е),
200 мкМ 2,4,6-трихлорфенол (1), 200 мкМ 2,6-дихлорфенол психотропные средства — электрофореграммы образца речной воды до (А) и после (В) добавления 1,4 • 10~БМ параоксона (а), 1,5 • 10~БМ метил-паратиона (Ь) и 2,8 • 10~БМ фенитротиона (с) [88]; органические перекиси — электрофореграмма смеси, содержащей кислород (а), 1,71 мМ пероксид водорода (Ь), 4,8 мМ пероксигептановую (с), 0,25 мМ
пероксипропионовую (ф, 1,33 мМ надуксусную (е) кислоты [89]; взрывчатые вещества — анализ взрывоопасных компонентов в экстракте, полученном из образцов загрязнённых почвы (А) и грунтовых вод (В) [90]
В [48] авторы анализируют содержание формальдегида и ацетальдегида в пищевых продуктах. Дериватизацию аналитов проводили 2-тиобарбитуровой кислотой. Полученные аддукты хорошо разделяются, при этом удалось достигнуть низких (9,1 • 10~9 г/мл) пределов детектирования. Разделительный потенциал — 2,5 кВ. Рабочий буфер — бо-ратный (pH = 9), 80 мМ. Детектор — амперометрический, рабочий электрод — углеродный, электрод сравнения — каломельный, а вспомогательный — платиновый.
В [91] МФЧА применялся для определения следовых количеств формальдегида, ацетальдегида и пропеналя в атмосферном воздухе. Альдегиды, пропущенные через сорбционный патрон, взаимодействовали с 2,4-динитрофенилгидразином; образующиеся гидразоны подвергались анализу. Использовали боратный буфер (pH = 9,2) с добавлением 25 мМ ДДСН, 20 об. % аценафтена и 10 об. % пропанола-1. Материал рабочего электрода — стеклоуглерод.
Заключение. В настоящем обзоре описаны последние достижения в области изготовления микрофлюидных чип-анализаторов и способы интеграции ЭХ-детектора в микрочип. Эти системы нашли широкое применение, особенно в области медицины и экологии. Микрочипы с ЭХ-детектированием обладают широким спектром аналитических возможностей. Создание КЭ-ЭХ микрофлюидных систем на сегодняшний день — одно из быстроразвивающихся и востребованных направлений в аналитической химии.
Литература
1. ManzA., GraberN., WidmerH. M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sens. Actuators. 1990. Vol. 1. P. 244-248.
2. Vandaveer W. R., Pasas-Farmer S. A., Fischer D. J. et al. Recent developments in electrochemical detection for microchip capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2004. Vol. 25. P. 3528-3549.
3. Vandaveer W. R., Pasas S. A., MartinR. S., LunteS. M. Recent developments in amperomet-ric detection for microchip capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. P. 3667-3677.
4. Stjernstron M., Roeraade J. Method for fabrication of microfluidic systems in glass //J. Micromech. Microeng. 1998. Vol. 8. P. 33-38.
5. LinC.-H., LeeG.-B., LinY.-H., Chang G.-L. A fast prototyping process for fabrication of microfluidic systems on soda-lime glass // J. Micromech. Microeng. 2001. Vol. 11. P. 726-732.
6. Oosterbroek R. E, van der Berg A. Lab-on-a-Chip. Amsterdam: Elsevier, 2003.
7. DolnikV., LiuS., Jovanovich S. Capillary electrophoresis on microchip // Electrophoresis. 2000. Vol. 21. P. 41-54.
8. BaoN., Zhang Q., XuJ.-J, ChenH.-Y. Fabrication of poly(dimethylsiloxane) microfluidic system based on masters directly printed with an office laser prin //J. Chromatogr. 2005. Vol. 1089. P. 270-275.
9. Schoning M. J., Jacobs M., MuckA. et al. Amperometric PDMS/glass capillary electrophore-sis-based biosensor microchip for catechol and dopamine detection // Sens. Actuators. (B). 2005. Vol. 108. P. 688-694.
10. Muck Jr. A., Wang J., Jacobs M. et al. Fabrication of Poly(methyl methacrylate) Microfluidic Chips by Atmospheric Molding // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. P. 2290-2297.
11. Horng R.-H., HanP., ChenH.-Y. et al. PMMA-based capillary electrophoresis electrochemical detection microchip //J. Micromech. Microeng. 2005. Vol. 15. P. 6-10.
12. Coltro W. K. T., da Silva J. A. F., da SilvaH. D. T. et al. Electrophoresis microchip fabricated by direct-printing process with end-channel amperometric detection // Electrophoresis. 2004. Vol. 25. P. 3832-3839.
13. Barker S. L. R., Tarlov M. J., CanavanH. et al. Plastic microfluidic devices modified with polyelectrolyte multilayers // Anal. Chem. 2000. Vol. 72. P. 4899-4903.
14. BaiX., Roussel C., Jensen H., GiraultH. H. Polyelectrolyte-modified short microchannel for cation separation // Electrophoresis. 2004. Vol. 25. P. 931-935.
15. Castano-Alvarez M., Fernandez-Abedul M. T., Costa-Garcia A. Poly(methylmethacrylate) and topas capillary electrophoresis microchip performance with electrochemical detection // Elec-trophoresis. 2005. Vol. 26. P. 3160-3168.
16. Soper S. A., FordS.M., Qi S. et al. Polymeric microelectromechanical systems // Anal. Chem. 2000. Vol. 72. P. 643A-651A.
17. BelderD., LudwigM. Surface modification in microchip electrophoresis // Electrophoresis. 2003. Vol. 24. P. 3595-3606.
18. RenX., BachmanM., SimsC. et al. Electroosmotic properties of microfluidic channels composed of poly(dimethylsiloxane) // J. Chromatogr. (B). 2001. Vol. 762. P. 117-125.
19. BodasD., Khan-Malek C. Hydrophilization and hydrophobic recovery of PDMS by oxygen plasma and chemical treatment — An SEM investigation // Sens. Actuator (B). 2007. Vol. 123. P. 368-373.
20. Vickers J. A., Caulum M. M, Henry C. S. Generation of hydrophilic poly(dimethylsiloxane) for high-performance microchip electrophoresis // Anal. Chem. 2006. Vol. 78. P. 7446-7452.
21. Berdichevsky Y., Khandurina J., Guttman A., Lo Y. H. UV/ozone modification of poly(di-methylsiloxane) microfluidic channels // Sens. Actuator (B). 2004. Vol. 97. P. 402-408.
22. MakambaH., KimJ.H., Lim K. et al. Surface modification of poly(dimethylsiloxane) microchannels // Electrophoresis. 2003. Vol. 24. P. 3607-3619.
23. Chen H.-Y., Lahann J. Fabrication of discontinuous surface patterns within microfluidic channels using photodefinable vapor-based polymer coatings // J. Anal. Chem. 2005. Vol. 77. P. 6909-6914.
24. Chen H. Y., McClellandA. A., Chen Z., Lahann J. Solventless adhesive bonding using reactive polymer coatings // Anal. Chem. 2008. Vol. 80. P. 4119-4124.
25. Niu Z. Q., GaoF., JiaX. Y. et al. Synthesis studies of sputtering TiO2 films on po-ly(dimethylsiloxane) for surface modification // Colloid Surf. (A). 2006. Vol. 272. P. 170-175.
26. Feng J. T., Zhao Y. P. Influence of different amount of Au on the wetting behavior of PDMS membrane // Biomed. Microdevices. 2008. Vol. 10. P. 65-72.
27. Makamba H., Hsieh Y. Y., Sung W. C., Chen S. H. Stable permanently hydrophilic protein-resistant thin-film coatings on poly(dimethylsiloxane) substrates by electrostatic self-assembly and chemical cross-linking // Anal. Chem. 2005. Vol. 77. P. 3971-3978.
28. Wang A. J., XuJ. J., Zhang Q., ChenH. Y. The use of poly(dimethylsiloxane) surface modification with gold nanoparticles for the microchip electrophoresis // Talanta. 2006. Vol. 69. P. 210-215.
29. Liang R. P., Gan G. H., QiuJ. D. Surface modification of poly(dimethylsiloxane) microflu-idic devices and its application in simultaneous analysis of uric acid and ascorbic acid in human urine // J. Sep. Sci. 2008. Vol. 31. P. 2860-2867.
30. Slentz B. E, Penner N. A., LugowskaE., RegnierF. Nanoliter capillary electrochromatog-raphy columns based on collocated monolithic support structures molded in poly(dimethyl silox-ane) // Electrophoresis. 2001. Vol. 22. P. 3736-3743.
31. Garcia C. D., Dressen B. M., Henderson A., Henry C. S. Comparison of surfactants for dynamic surface modification of poly(dimethylsiloxane) microchips // Electrophoresis. 2005. Vol. 26. P. 703-709.
32. Dou Y. H., BaoN., XuJ. J. et al. Separation of proteins on surface-modified poly(dimethyl-siloxane) microfluidic devices // Electrophoresis. 2004. Vol. 25. P. 3024-3031.
33. Kim J. A., Lee J. Y., SeongS. et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip // Biochem. Eng. J. 2006. Vol. 29. P. 91-97.
34. Huang B., WuH. K., KimS., ZareR.N. Coating of poly(dimethylsiloxane) with n-dodecyl-|3-D-maltoside to minimize nonspecific protein adsorption // Lab Chip. 2005. Vol. 5. P. 1005-1007.
35. Kang J. Z., YanJ. L., Liu J. F. et al. Dynamic coating for resolving rhodamine B adsorption to poly(dimethylsiloxane)/glass hybrid chip with laser-induced fluorescence detection // Talanta. 2005. Vol. 66. P. 1018-1024.
36. WangB., Abdulali-Kanji Z., DodwellE. et al. Surface characterization using chemical force microscopy and the flow performance of modified polydimethylsiloxane for microfluidic device applications // Electrophoresis. 2003. Vol. 24. P. 1442-1450.
37. Henares T. G., MizutaniF., HisamotoH. Current development in microfluidic immunosens-ing chip // Analytica chimica acta. 2008. Vol. 611. P. 17-30
38. YuL., LiC.M., ZhouQ., LuongJ. H. T. Poly(vinyl alcohol) functionalized polydimethylsiloxane) solid surface for immunoassay // Bioconjug. Chem. 2007. Vol. 18. P. 281.
39. Gomez D., Goenaga I., Lizuainl., OzaitaM. Femtosecond laser ablation for microflu-idics // Opt. Eng. 2005. Vol. 44. P. 051105-1-051105-8.
40. Park J. H., LeeN.-E., Lee J. et al. Deep dry etching of borosilicate glass using SF6 and SF6/Ar inductively coupled plasmas // Microelectr. Eng. 2005. Vol. 82. P. 119-128.
41. Castano-Alvarez M, Pozo Ayuso D. F., Garcia Granda M. et al. Critical points in the fabrication of microfluidic devices on glass substrates. Sensors and Actuators. 2008. Vol. 130. P. 436-448.
42. MartynovaL., Locascio L. E, GaitanM. et al. Fabrication of Plastic Microfluid Channels by Imprinting Methods // Anal. Chem. 1997. Vol. 69. P. 4783-4789.
43. McCormick R. M., Nelson R. J., Alonso-Amigo M. G. et al. Microchannel Electrophoretic Separations of DNA in Injection-Molded Plastic Substrates // Anal. Chem. 1997. Vol. 69. P. 2626-2630.
44. Duffy D. C., McDonald J. C., Schueller O. J. A., Whitesides G. M. Rapid prototyping of mi-crofluidic systems in poly(dimethylsiloxane) // Anal. Chem. 1998. Vol. 70. P. 4974-4984.
45. Roberts M. A., Rossier J. S., Bercier P., GiraultH. UV laser machined polymer substrates for the development of microdiagnostic systems // Anal. Chem. 1997. Vol. 69. P. 2035-2042.
46. Fundamentals of Microfabrication (The Science of Miniaturization): ed. by M. J. Madou. Boca Raton: CRC Press, 2000.
47. Wang J. Electrochemical detection for microscale analytical systems: A review // Talanta. 2002. Vol. 56. P. 223-231.
48. Zhang D., Zhang J., LiM. et al. A novel miniaturised electrophoretic method for determining formaldehyde and acetaldehyde in food using 2-thiobarbituric acid derivatisation // Food Chemistry. 2011. Vol. 129. P. 206-212.
49. Feng J.-J., Wang A.-J., Fan J. et al. Hydrophilic biopolymer grafted on poly(dimethylsilox-ane) surface for microchip electrophoresis // Analytica Chimica Acta. 2010. Vol. 658. P. 75-80.
50. LunteS. M., Lunte C. E, Kissinger P. T. Laboratory Techniques in Electroanalytical Chemistry, 2nd ed. New York: Marcel Dekker, 1996.
51. Jacobson S. C., Hergenroder R., Moore A. W., Ramsey J. M. Precolumn Reactions with Elec-trophoretic Analysis Integrated on a Microchip // Anal. Chem. 1994. Vol. 66. P. 4127-4132.
52. Garcia C. D., Henry C. S. Direct Determination of Carbohydrates, Amino Acids, and Antibiotics by Microchip Electrophoresis with Pulsed Amperometric Detection // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 4778-4783.
53. KeyntonR. S., Roussel T. J., CrainM. M. et al. Design and development of microfabricated capillary electrophoresis devices with electrochemical detection // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 507. P. 95-105.
54. Zeng Y., ChenH., PangD.-W. et al. Microchip capillary electrophoresis with electrochemical detection // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. P. 2441-2445.
55. Martin R. S., Ratzlaff K. L., Huynh B. H., Lunte S. M. In-channel electrochemical detection for microchip capillary electrophoresis using an electrically isolated potentiostat // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. P. 1136-1143.
56. BianchiF., LeeH. J., GiraultH. H. Ionode detection and capillary electrophoresis integrated on a polymer micro-chip // J. Electroanal. Chem. 2002. Vol. 523. P. 40-48.
57. RossierJ. S., Ferrigno R., GiraultH. H. Electrophoresis with Electrochemical Detection in a Polymer Microdevice //J. Electroanal. Chem. 2000. Vol. 492. P. 15-22.
58. Chen D.-C., HsuF.-L., ZhanD.-Z., Chen C.-H. Palladium film decoupler for amperometric detection in electrophoresis chips // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. P. 758-762.
59. Kok W. T., Sahin Y. Solid-state field decoupler for off-column detection in capillary electrophoresis // Anal. Chem. 1993. Vol. 65. P. 2497-2501.
60. WuC.-C., WuR.-G., Huang J.-G. et al. Three-electrode electrochemical detector and platinum film decoupler integrated with capillary electrophoresis microchip for amperometric detection // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 947-952.
61. Osbourn D. M., Lunte C. E. On-Column Electrochemical Detection for Microchip Capillary Electrophoresis // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 2710-2714.
62. Lacher N. A., Lunte S. M., MartinR. S. Development of a Microfabricated Palladium Decoupler // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. P. 2482-2491.
63. GawronA.J., MartinR. S., Lunte S. M. Fabrication and evaluation of a carbon-based dual-electrode detector for poly(dimethylsiloxane)electrophoresis // Electrophoresis. 2001. Vol. 22. P. 242-248.
64. MartinR. S., GawronA. J., Fogarty B. A. et al. Carbon paste-based electrochemical detectors for microchip capillary electrophoresis/electrochemistry // Analyst. 2001. Vol. 126. P. 277-280.
65. Vlckova M., Schwarz M. A. Determination of cationic neurotransmitters and metabolites in brain homogenates by microchip electrophoresis and carbon nanotube-modified amperometry // J. Chromatogr. (A). 2007. Vol. 1142. P. 214-221.
66. Wang J., ChenG., Chatrathi M. P. et al. Microchip capillary electrophoresis coupled with a boron-doped diamond electrode-based electrochemical detector // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 935-939.
67. SerpP., Corrias M., KalckP. Carbon nanotubes and nanofibers in catalysis // Appl. Catal. (A). 2003. Vol. 253. P. 337-358.
68. Wang J., Chatrathi M. P., TianB., Polsky R. Capillary electrophoresis chips with thick-film amperometric detectors: Separation and detection of hydrazine compounds // Electroanalysis. 2000. Vol. 12. P. 691-694.
69. Song Y., Ma Y., Wang Y. et al. Electrochemical deposition of gold-platinum alloy nanoparti-cles on an indium tin oxide electrode and their electrocatalytic applications // Electrochimica Acta. 2010. Vol. 55. P. 4909-4914.
70. Bhalla V., Carrara S., Stagni C., SamoriB. Chip cleaning and regeneration for electrochemical sensor arrays // Thin Solid Films. 2010. Vol. 518. P. 3360-3366.
71. GuijtR. M., Baltussen E., van der Steen G. et al. New approaches for fabrication of microflu-idic capillary electrophoresis devices with on-chip conductivity detection // Electrophoresis. 2001. Vol. 22. P. 235-241.
72. Guijt R. M., Baltussen E., van der Steen G. et al. Capillary electrophoresis with on-chip four-electrode capacitively coupled conductivity detection for application in bioanalysis // Elec-trophoresis. 2001. Vol. 22. P. 2537-2541.
73. Pumera M, Wang J., Grushka E., Polsky R. Gold Nanoparticle-Enhanced Microchip Capillary Electrophoresis. // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. P. 5625-5628.
74. Fanguy J. C., Henry C. S. Pulsed amperometric detection of carbohydrates on an elec-trophoretic microchip // Analyst. 2002. Vol. 127. P. 1021-1023.
75. Wang J., Chen G., Chatrathi M. P., Musameh M. Capillary Electrophoresis. Microchip with a Carbon Nanotube-Modified Electrochemical Detector // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. P. 298-302.
76. Lai C.-C. J., Chen C.-H., KoF.-H. In-channel dual-electrode amperometric detection in electrophoretic chips with a palladium film decoupler // J. Chromatogr. (A). 2004. Vol. 1023. P. 143-150.
77. Hebert N. E, Snyder B., McCreery R. et al. Performance of pyrolyzed photoresist carbon films in a microchip capillary electrophoresis device with sinusoidal voltammetric detection // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 4265-4271.
78. Lim T.-K, OhtaH., Matsunaga T. Microfabricated on-chip-type electrochemical flow im-munoassay system for the detection of histamine released in whole blood samples // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 3316-3321.
79. Wang J., Chatrathi M. P. Microfabricated electrophoresis chip for bioassay of renal markers // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. P. 525-529.
80. Manica D. P., Ewing A. G. Prototyping disposable electrophoresis microchips with electrochemical detection using rapid marker masking and laminar flow etching // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. P. 3735-3743.
81. Kikura-Hanajiri R., Martin R. S., LunteS. M. Indirect measurement of nitric oxide production by monitoring nitrate and nitrite using microchip electrophoresis with electrochemical detection // Anal. Chem. 2002. Vol. 74. P. 6370-6377.
82. Wang J., Chatrathi M. P., TianB. Micromachined Separation Chips with a Precolumn Reactor and End-Column Electrochemical Detector // Anal. Chem. 2000. Vol. 72. P. 5774-5778.
83. Wang J., Chatrathi M. P., TianB. Microseparation chips for performing multienzymatic dehydrogenase/oxidase assays: simultaneous electrochemical measurement of ethanol and glucose // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. P. 1296-1300.
84. Pasas S. A., Lacher N. A., Davies M. I., LunteS. M. Detection of homocysteine by conventional and microchip capillary electrophoresis/electrochemistry // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. P. 759-766.
85. Fanguy J. C., Henry C. S. The analysis of uric acid in urine using microchip capillary elec-trophoresis with electrochemical detection // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. P. 767-773.
86. Joo G.-S., JhaS. K., Kim Y.-S. A capillary electrophoresis microchip for amperometric detection of DNA // Current Applied Physics. 2009. Vol. 9. P. 222-224.
87. Bani-Yaseen A. D., Kawaguchi T., Price A. K. et al. Integrated microfluidic device for the separation and electrochemical detection of catechol estrogen-derived DNA adducts // Anal. Bioanal. Chem. 2011. Vol. 399. P. 519-524.
88. Wang J., Chatrathi M. P., Mulchandani A., Chen W. Capillary electrophoresis microchips for separation and detection of organophosphate nerve agents // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. P. 1804-1808.
89. Wang J., EscarpaA., PumeraM, Feldman J. Capillary electrophoresis-electrochemistry mi-crofluidic system for the determination of organic peroxides // J. Chromatogr. (A). 2002. Vol. 952. P. 249-254.
90. HimliA., LuongJ. H. T. Micromachined electrophoresis chips with electrochemical detectors for analysis of explosive compounds in soil and ground-water // Environ. Sci. Technol. 2000. Vol. 34. P. 3046-3050.
91. DossiN., SusmelS., Toniolo R. et al. Application of microchip electrophoresis with electrochemical detection to environmental aldehyde monitoring // Electrophoresis. 2009. Vol. 30, N 19. P. 3465-3471.
Статья поступила в редакцию 15 ноября 2011 г.
