CC BY
54
УДК 616.23
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ
© В. В. Гайнитдинова1, Л. А. Шарафутдинова2*, Ю. С. Замула2, М. В. Мавлетов2
1 Башкирский государственный медицинский университет Минздрава России Россия, Республика Башкортостан, 450000 г. Уфа, ул. Ленина.
2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
*Email: sharafla@yandex.ru
С помощью атомно-силовой микроскопии исследованы структурно-функциональные особенности нейтрофилов больных хронической обструктивной болезнью легких. Показано, что у больных ХОБЛ нейтрофилы отличаются меньшими размерами и большей высотой гранул цитоплазмы.
Ключевые слова: нейтрофилы, морфометрия, хроническая обструктивная болезнь лег-
ких, атомно-силовая микроскопия.
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является одним из наиболее быстро распространяющихся в мире заболеваний и по прогнозам экспертов будет третьей по значимости причиной смертности во всем мире в течение следующих 10 лет [1]. ХОБЛ характеризуется необратимым ограничением потока воздуха, в котором важную роль играет хроническое воспаление дыхательных путей [2, 3]. Так как воспалительный процесс локализуется не только в легких, ХОБЛ сегодня общепризнанно является системным заболеванием. Согласно результатам многочисленных исследований у больных ХОБЛ имеют место изменения структуры и активация нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови [4]. При этом наблюдается нарушение функционирования циркулирующих нейтрофилов, повышение их хемотаксической реакции и экспрессии поверхностных клеточных адгезивных молекул, что способствует развитию системного воспалительного ответа [5, 6].
Актуальность изучения патогенеза ХОБЛ требует совершенствования методов диагностики данного вида патологии. Для решения подобной задачи важно уметь оценить глубину патологических изменений и наметить пути коррекции этих нарушений. Современный уровень развития науки позволяет рассматривать морфологические структурные изменения отдельных клеток и иногда изменение только морфологии является достаточно информативным критерием, позволяющим диагностировать целый ряд заболеваний: серповидно-клеточную анемию, злокачественные новообразования и т.д. В практическом здравоохранении одним из преимущественных методов является мор-фометрическая оценка клеток крови [7]. В настоящее время изменение морфологических параметров клеток крови человека проецируют на физиологические свойства, что наряду с функциональной характеристикой дает полноценную информацию об их участии в развитии разнообразных патологических состояний. В последнее время предложены
автоматизированные методы для оценки морфо-функционального статуса нейтрофилов, однако, в подавляющем большинстве случаев исследуются фиксированные и окрашенные объекты.
Комплексное рассмотрение морфофункцио-нальных особенностей нейтрофилов позволяет выполнить атомно-силовая микроскопия (АСМ), позволяющая отказаться от использования жестких методов фиксации и тем самым минимально травмировать клетки. В настоящее время исследованию с применением АСМ подвергаются все клетки периферической крови [8-11]. Однако широкое применение АСМ для диагностики в клинической практике ограничено, что обусловлено отчасти отсутствием широкого распространения атомно-силовых микроскопов. Отсутствуют данные относительно морфофункциональных особенностей нейтрофилов больных ХОБЛ. В связи с вышесказанным, целью работы явилась оценка морфомет-рических параметров нейтрофилов периферической крови у больных ХОБЛ с помощью атомно-силовой микроскопии.
Методы исследования
Проведено местное, открытое, сравнительное исследование по изучению структурно-функциональных свойств нейтрофилов периферической крови у 15 больных с тяжелой степенью ХОБЛ методом атомно-силовой микроскопии. Диагноз ХОБЛ установлен согласно рекомендаций GOLD 2010г. Средний возраст больных в исследуемых группах составил 53.3±5.2 лет. Средняя продолжительность заболевания составила 8.90 ± 3.9 лет. Индекс курения (ИК) и индекс массы тела (ИМТ) в среднем составляли 26.17±3.74 и 23.89±4.04. В контрольную группу вошли 14 практически здоровых некурящих лиц без патологии органов дыхания в возрасте 40-55 лет. Группы исследования и контроля не различались по возрасту, половой принадлежности. Критериями исключения из исследования были острые формы других ин-
фекционно-воспалительных, нагноительных заболеваний, лихорадка, злокачественные новообразования, сахарный диабет. В комплекс обязательного обследования входил общий анализ крови в 1-е сутки поступлении пациентов в стационар. ИК и ИМТ высчитывали по общепринятым формулам. Насыщение крови кислородом (Sa02) определялось с помощью напалечного пульсоксиметра MD300C. Спирометрия (ОФВ1, ФЖЕЛ, отношение ОФВ1/ФЖЕЛ) проводилась на оборудовании Master Screen Body (Erich Jaeger, Германия). Эхокардио-графическое исследование сердца проводилось на аппарате Fillips INVVISER CHD.
Специальные методы: Объектом исследования послужили нейтрофилы периферической крови больных ХОБЛ. Забор крови проводился в 1-е сутки поступлении пациентов в стационар до назначения антибактериальной терапии, системных глюко-кортикостероидов (СГКС). Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной (20 ед./мл) венозной крови доноров на двойном градиенте фиколл-урографина по методике И. В. Подосинникова и соавт. [12]. Клетки дважды отмывали забуференным изотоническим раствором натрия хлорида и взвешивали в растворе Хенкса. Для измерения морфологических параметров нейтрофилы фиксировали на твердой подложке с использованием фиксирующего агента глутарового альдегида (1.5%). АСМ-исследования фиксированных клеток проводили по методике Плесковой с соавт. [13]. Сканирование поверхности 10—12 клеток каждого образца крови проводили в полуконтактном режиме на воздухе, используя кремниевые зонды PPP-CONTPt (Nanosensors) с жесткостью 43 Н/м и резонансной частотой 185 кГц. Для визуализации сканируемых объектов использовали программу PicoView 1.10. Получив ска-ны поверхности нейтрофилов, в режиме 3D были сформированы трехмерные изображения нейтро-филов, на которых четко выявляются контуры ядра и цитоплазмы. Для оценки морфометрических параметров нейтрофилов и структурных неоднород-ностей клеточной поверхности строили кривые профиля бокового сечения, на которых подсчитывали высоту клетки относительно подложки (нм), максимальную высоту гранул цитоплазмы (нм). Используя программное обеспечение Pico Image Basic 5.1, вычисляли также площадь ядра (нм2) и клетки (нм2).
Математико-статистическую обработку данных производили в пакете прикладных программ STATISTICA V.7.0 («StatsoftInc», США). Для всех выборок проводили анализ соответствия вида распределения количественных признаков закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку распределение признаков в группах не являлось нормальным, сравнительный анализ групп проводился с помощью непараметрических методов. Для сравнения трех групп использовался ранговый анализ вариаций по
Краскеллу—Уоллису. В случае если нулевая гипотеза об отсутствии различий отклонялась, проводили парное сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна-Уитни. Количественные данные представлены в виде М ± т, где М — выборочное среднее, т — стандартная ошибка средней. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05.
Результаты и их обсуждение
Спирометрические показатели у исследуемых больных соответствовали тяжелой степени ХОБЛ: форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ) составила 69.47±3.19% от должных величин; объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) — 38.72±3.63%. Уровень насыщения крови кислородом в среднем составил 96.33±0.88%. В периферической крови у пациентов был выявлен умеренный нейтрофильный лейкоцитоз до (9.2±0.33)*109/л.
Нейтрофилы играют одну из ведущих ролей в воспалении при ХОБЛ. Результаты ранее проведенных исследований свидетельствуют об их активации и увеличении их цитотоксических эффектов. В формирование воспаления при ХОБЛ также вносят свой вклад макрофаги, Т-лимфоциты, эозино-филы и эпителиальные клетки. Макрофаги скапливаются в местах повреждения межальвеолярных перегородок, участвуют в регуляции воспаления путем секреции медиаторов (фактор некроза опухоли а — ФНО-а, интерлейкин — ИЛ-8, ЛТ — В4), усиливающих нейтрофильное воспаление [2].
Сканирование нейтрофилов с использованием АСМ позволило получить изображения отдельно лежащих нейтрофилов. На рис. 1 представлены сканы нейтрофилов периферической крови лиц контрольной группы и больных ХОБЛ. В образце (фиксированная суспензия нейтрофилов), полученном из периферической крови здоровых лиц, были обнаружены нейтрофилы с правильной округлой формой и четко определяющимся сегментированным ядром (рис 1а). Наглядно наличие сегментов можно увидеть и на боковом сечении профиля клетки (рис. 1в), где выступы соответствуют сегментам, расположенным вдоль одной длинной оси клетки. В режиме 3D были получены трехмерные изображения нейтрофилов, на которых отчетливо выявлялись контуры ядра и многочисленные гранулы, находящиеся в цитоплазме (рис. 1б).
В крови больных ХОБЛ в отличие от группы контроля на площади сканирования выявлено больше нейтрофилов с меньшим количеством сегментов ядра. Характерной особенностью сегменто-ядерных нейтрофилов пациентов с ХОБЛ является увеличение фазовой высоты клетки, которая в группе здоровых лиц составила 0.91±0.05 нм, а у больных ХОБЛ выше в среднем в 1.3 раза по сравнению с контролем (р < 0.05). Изучение топографических особенностей нейтрофилов на 3D изображениях показало, что поверхность клеток у боль-
Рис. 1. Результаты сканирования нейтрофилов контрольной группы (а, б) и кривая бокового профиля клетки (в).
ных ХОБЛ по сравнению с контрольной группой имеет более шероховатый рельеф. Высота гранул у больных ХОБЛ по сравнению с контролем (1.01±0.05 нм) увеличена в 1.3 раза (р < 0.05) и составила в среднем 1.34±0.05 нм. Известно, что проявлением высокой реактивности лейкоцитов является изменение топографии поверхности и общей морфологии клеток [15]. Повышенная активность нейтрофилов при сканировании с помощью АСМ выявляется в виде гранул, которые группируются в различных участках цитоплазмы
Величина площади сегментоядерных нейтро-филов группы больных ХОБЛ несколько снижена относительно контроля и составила в среднем 122.48±4.65 нм2 и 124.78±3.05 нм2 соответственно (р < 0.05). Существует мнение, что уменьшение размеров нейтрофилов при воспалении можно объяснить тем, что нейтрофилы больших размеров первыми уходят в ткани (очаги воспаления), а в крови остаются клетки меньших размеров [7].
Площадь ядра нейтрофилов при ХОБЛ значительно уменьшается относительно контрольной группы (р < 0.05), что по всей видимости является следствием уменьшения среднего числа сегментов у популяции циркулирующих нейтрофилов в крови больных ХОБЛ.
Таблица
Морфометрические показатели нейтрофилов _у больных ХОБЛ
Показатели
Контрольная группа (п 14)
ХОБЛ (П 15)
Высота клетки, нм Максимальная высота гранул, нм Площадь ядра, нм2 Площадь клетки, нм2
0.91±0.05
1.01±0.05
39.16±1.67 124.78±10.73
1. 16±0.05*
1.34±0.05*
31.82±2.80* 122.48±4.65
Примечание: * Статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой (р < 0.05).
Заключение
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что для нейтрофилов больных ХОБЛ свойственны структурные изменения, характерные для воспалительного процесса (уменьшение площади ядра и клетки, увеличение ее фазовой высоты, гранулированности цитоплазмы). Использование информативного диагностического метода — атомно-силовой микроскопии позволяет более комплексно и адекватно оценить характер морфофунк-циональных изменений нейтрофилов, выявить их роль в системном воспалении при ХОБЛ.
в
Исследование поддержано грантом Министерства образования РФ 11.G.34.31.0040.
ЛИТЕРАТУРА
10
1. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD). Global strategy for diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO workshop report. www.goldcopd.
2. Черняев А. Л., Самсонова М. В. Воспаление при хрониче- 11 ской обструктивной болезни легких: молекулярные основы патогенеза // ConciliummedicumUkraina. 2011. №1. С. 9-14.
3. Лещенко И. В., Баранова И. И. Биомаркеры воспаления при хронической обструктивной болезни легких // Пульмонология. 2012. №2. С. 108-117. 12
4. Emiel F. M. Wouters Local and Systemic Inflammation in Chronic Obstructive Pulmonary Disease // Proc. Am. Thorac. 2005. Vol. 2. Pp. 26-33.
5. Blidberg K., Palmberg L., Jameet A. Adhesion molecule sin 13 subjects with COPD and healthynon-smokers: a cross sectional parallel group study // Respir. Res. 2013. No. 14. Pp. 47.
6. Noguera A., Batle S., Miralles C. Enhanced neutrophil re- 14 sponse in chronic obstructive pulmonary disease // Thorax. 2001. Vol. 56. No. 6. Pp. 432-437.
7. Козинец Г. И. Клетки крови - современные технологии их анализа. Москва: Триада-Фарм. 2002. C. 4-27.
8. Иванов К. П., Левкович Ю. И., Московская С. В. Измене- 15 ние микроциркуляции при лейкоцитозе // Физиологический журнал им. Сеченова. 1992. №6. С. 89-91.
Сладкова Е. А., Скоркина, М. Ю. Структурно-функциональные особенности лимфоцитов больных лим-фобластным лейкозом // Цитология. 2013. Т. 55. №6. С. 388-393.
Бондарь Т. П., Ишкова Н. М., Эльканова А. Б., Мельченко Е. А. Использование атомно-силовой микроскопии для изучения морфо-функционального состояния эозинофи-лов у больных токсокарозом // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2010. Вып. 20. №»4. Бондарь Т. П., Мельченко Е. А., Солдатов А. А. Биофизические механизмы нарушения структурной организации биологических мембран эритроцитов при сахарном диабете // Клиническая лабораторная диагностика. 2010. №10. С. 186.
Павлова Т. В., Лысов А. Е. Морфофункциональные особенности нейтрофилов при остром аппендиците // Фундаментальные исследования. 2013. №9. http://www.rae.ru/ fs/pdf/2013/9-1/32189.pdf
Подосинников И. В., Нилова Л. Г. Бабичев И. В. Метод определения хемотаксической активности лейкоцитов // Лаб. Дело. 1981. №8. С. 68-70.
Плескова С. Н., Гущина Ю. Ю., Звонкова М. Б. Исследование различий морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии // Поверхность. Рентгеновские, синхронные и нейтронные исследования. 2005. №1. С. 48-53. Дроздов А. А. Кинетика эозинофилов. Заболевания крови. Полный справочник. М.: ЭКСМО, 2008. 608 с.
Поступила в редакцию 05.12.2014 г.
MORPHOMETRIC CHARACTERISTICS OF BLOOD NEUTROPHILS OF PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE
© V. V. Gainitdinova1, L. A. Sharafutdinova2*, Yu. S. Zamula2, M. V. Mavletov2
1 Bashkir State Medical University 3 Lenin St., 450000 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
2Bashkir State University 32 Zaki Validi St., 450076 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
*Email: sharafla@yandex.ru
Results of study by atomic microscopy of structurally functional properties of peripheral blood neutrophils of patients with a chronic obstructive pulmonary disease are presented in article. For an assessment of morphometric parameters of neutrophils and structural not uniformity of cellular surface, neutrophils were extracted from blood. Having received surface scans of neutrophils, three-dimensional images of neutrophils were created in the 3D mode. Curves of a profile of side section, on which the cage height concerning a substrate (nanometer) and the maximum height of granules of cytoplasm (nanometer) were counted, were built. Using the software of Pico Image Basic 5.1, the nucleus and cells area (nm2) were calculated as well. Results of the conducted research showed that neutrophils are characterized by reduction of the nucleus and cells area and increase in their phase height; there are many granules in cytoplasm. The use of an informative diagnostic method of atomic-force microscopy allowed the authors to make precise estimation of complex structural and functional changes of neutrophils, to reveal their role in a system inflammation at chronic obstructive pulmonary disease.
Keywords: neutrophils, morphometry, chronic obstructive pulmonary disease, atomic microscopy.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD). Global strategy for diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO workshop report. www.goldcopd.
2. Chernyaev A. L., Samsonova M. V ConciliummedicumUkraina. 2011. No. 1. Pp. 9-14.
3. Leshchenko I. V., Baranova I. I. Pul'monologiya. 2012. No. 2. Pp. 108-117.
4. Emiel F. M. Proc. Am. Thorac. 2005. Vol. 2. Pp. 26-33.
5. Blidberg K., Palmberg L., Jameet A. Respir. Res. 2013. No. 14. Rp. 47.
6. Noguera A., Batle S., Miralles C. Thorax. 2001. Vol. 56. No. 6. Pp. 432-437.
7. Kozinets G. I. Kletki krovi - sovremennye tekhnologii ikh analiza [Blood cells - modern technologies for their analysis]. Moscow: Tri-ada-Farm. 2002. Pp. 4-27.
8. Ivanov K. P., Levkovich Yu. I., Moskovskaya S. V. Fiziologicheskii zhurnal im. Sechenova. 1992. No. 6. Pp. 89-91.
9. Sladkova E. A., Skorkina, M. Yu. Tsitologiya. 2013. Vol. 55. No. 6. Pp. 388-393.
10. Bondar' T. P., Ishkova N. M., El'kanova A. B., Mel'chenko E. A. Meditsinskii vestnik Severnogo Kavkaza. 2010. No. 20. No. 4.
11. Bondar' T. P., Mel'chenko E. A., Soldatov A. A. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2010. No. 10. Pp. 186.
12. Pavlova T. V, Lysov A. E. Fundamental'nye issledovaniya. 2013. No. 9. http://www.rae.ru/fs/pdf/2013/9-1/32189.pdf
13. Podosinnikov I. V, Nilova L. G. Babichev I. V Lab. Delo. 1981. No. 8. Pp. 68-70.
14. Pleskova S. N., Gushchina Yu. Yu., Zvonkova M. B. Poverkhnost'. Rentgenovskie, sinkhronnye i neitronnye issledovaniya. 2005. No. 1. Pp. 48-53.
15. Drozdov A. A. Kinetika eozinofilov. Zabolevaniya krovi. Polnyi spravochnik [Kinetics of eosinophils. Diseases of the blood. Complete guide]. Moscow: EKSMO, 2008.
Received 05.12.2014.
