CC BY
12Ветеринарный врач. 2023. № 2. С. 55 - 59. The Veterinarian. 2023; (2): 55 - 59
Научная статья
УДК 544.542;579.23
DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_2_55
Морфометрическая оценка ультраструктурной организации бактерий Escherichia coli после воздействия гамма-излучения
Марина Юрьевна Галлямова, Константин Николаевич Вагин, Айдар Фаритович Махмутов, Глеб Сергеевич Кашеваров, Вадим Расимович Саитов
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Россия Автор, ответственный за переписку: Марина Юрьевна Галлямова, marina_rb@inbox.ru
Аннотация. Изучение ответной реакции микроорганизмов на влияние различных факторов окружающей среды представляет собой объект постоянного внимания ученых. Бактерии подвержены воздействиям агентов, вызывающим изменения химико-физических и биохимических процессах, а в последующем в морфологии и структурной организации клеток. Цель работы состояла в общей морфометрической оценке влияния радиационного фактора на субмикроскопическую организацию Escherichia coli. Эксперимент выполнен на культуре клеток производственного штамма E. coli «ПЛ-6», радиационное воздействие было проведено с использованием стационарной гамма-установки «Исследователь» (60Co). Фиксацию культуры осуществляли 1 % раствором глутарового альдегида на фосфатном буфере. Далее образцы подвергали постфиксации тетраоксидом осмия, дегидратации (этиловые спирты восходящей концентрации - 30; 50; 70; 80; 96 %, абсолютные спирты, ацетон) и импрегнации. Материал в виде ультратонких срезов просматривали на электронном микроскопе Jeol JEM-1011 (Япония), полученные методом случайных бесповторных полей микрофотографии подвергали морфометрическому анализу в программе ImageJ (сборка FIJI). Статистическую обработку данных осуществляли в программах Statistica 6.0 и MS Excel. Выявлено, что влияние ионизирующего излучения внешне проявляется присутствием большего количества клеток E. coli с увеличенным периплазматическим пространством, а также меньшим количеством вытянутых форм. Общая морфологическая картина бактерий контрольной группы представлена разнообразными формами в большей степени, в том числе вытянутыми (полиморфность); преимущественно клетками с увеличенным периплазматическим пространством; придатков клеточной стенки (таких, как пили) не отмечено; везикулообразование почти не наблюдается. У бактерий опытной группы полиморфность менее выражена; удлиненные бактерии почти не встречаются; придатки клеточной стенки (такие, как пили) не отмечаются и везикулообразование крайне незначительно.
Ключевые слова: бактерии, ионизирующее излучение, кишечная палочка, морфометрия, ультраструктура
Morphometric assessment of ultrastructural organization Escherichia coli bacteria after exposure to gamma radiation
Marina Yu. Gallyamova, Konstantin N. Vagin, Aidar F. Makhmutov, Gleb S. Kashevarov, Vadim R. Saitov
Federal State Budgetary Scientific Institution «Federal Center for toxicological, radiation, and biological safety», Kazan, Russia
Corresponding author: Marina Yu. Gallyamova, marina rb@inbox.ru
Abstract. The study of the response of microorganisms to the influence of various environmental factors is an object of constant attention of scientists. Bacteria are exposed to agents that cause changes in the chemical-physical and biochemical processes, and subsequently in the morphology and structural organization of cells. The aim of the work was to assess the overall effect of the radiation factor on the submicroscopic organization of Escherichia coli. The experiment was performed on a cell culture of the production strain of E. coli «PL-6», radiation exposure was carried out using a stationary gamma installation «Researcher» (60Co).
The culture was fixed with a 1 % solution of glutaraldehyde in phosphate buffer. Further, the samples were subjected to post-fixation with osmium tetroxide, dehydration (ethyl alcohols of increasing concentration - 30; 50; 70; 80; 96 %, absolute alcohols, acetone) and impregnation. The material in the form of ultrathin sections was examined on a Jeol JEM-1011 electron microscope (Japan); Statistical data processing was carried out using the Statistica 6.0 and MS Excel programs. It was revealed that the influence of ionizing radiation is externally manifested by the presence of a larger number of E. coli cells with an increased periplasmic space, as well as a smaller number of elongated forms. The general morphological picture of bacteria in the control group is represented by various forms to a greater extent, including elongated ones (polymorphism); predominantly cells with increased periplasmic space; cell wall appendages (such as pili) were not noted; vesicle formation is almost not observed. In bacteria of the experimental group, polymorphism is less pronounced; elongated bacteria are almost never found; cell wall appendages (such as pili) are not seen and vesicle formation is extremely low.
Keywords: bacteria, ionizing radiation, Escherichia coli, morphometry, ultrastructure
Введение. Ионизирующее излучение (ИИ) представляет собой вид энергии, освобождаемой атомами в виде электромагнитных волн (гамма- или рентгеновское излучение) либо частиц (нейтроны, бета или альфа). Поглощение энергии излучения живыми организмами приводит к сложным биофизическим и биохимическим процессам. Так как основную часть массы тела у млекопитающих (и человека, в том числе) составляет вода, то действие ИИ, прежде всего, распространяется на воду и водные растворы [1].
Электронная микроскопия представляет собой высокотехнологичный метод изучения структур на наноуровне. Разрешающая способность указанного метода позволяет рассматривать и анализировать морфологию бактериальных клеток, поверхностных структур и образований [2].
Широко известно, что микроорганизмы являются самыми адаптивными из всех представителей живого мира. Смена условий окружающей среды способствует мобилизации всех возможностей микробных популяций для развития клеточной адаптивной реакции. В литературе имеется большое количество различных исследований, посвященных изучению влияния разнообразных стресс-факторов на микроорганизмы [3-10].
В связи с вышеизложенным, целью работы явилось проведение общей морфометрической оценки влияния радиационного фактора на субмикроскопическую организацию штамма, выбранного в качестве объекта исследований.
Материалы и методы. Работа выполнена в лаборатории радиационного контроля и техники, лаборатории бактериальных патологий животных и секторе ультраструктурных исследований ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В качестве объекта исследований в проведенном эксперименте был выбран производственный штамм E. coli «ПЛ-6». Радиационное воздействие на культуру клеток осуществляли при помощи стационарной гамма-установки «Исследователь» (источник излучения 60Co) с суммарной мощностью экспозиционной дозы 36,7 Гр/мин в дозах от 3,5 до 10 кГр с шагом в 0,5 кГр (13 циклов облучения), от дозы 10 до 30 кГр с шагом в 5 кГр (5 циклов облучения). По итогу было проведено 18 серий облучения культуры. После облучения производили посев на питательную среду Эндо, культивировали 18 ч в условиях термостата при температуре 37 °С. Также параллельно выполняли посев и культивирование контроля с каждым циклом облучения. После культивирования посева получали бактериальную массу методом смыва стерильным физиологическим раствором с поверхности плотной питательной среды. Для изучения ультраструктуры был выбран крайний вариант радиомодифицированных бактерий, сохраняющий свою жизнеспособность при облучении в дозе 30 кГр. Сравнение осуществляли с контрольной (без облучения) культурой. Смыв центрифугировали при 8 тыс. оборотов в минуту. Промытый и отцентрифугированный осадок культуры фиксировали по классической методике подготовки материала: в эппендорфах с 1 % раствором глутарового альдегида на фосфатном буфере. Далее проводили постфиксацию тетраоксидом осмия, дегидратацию (этиловые спирты восходящей концентрации - 30; 50; 70; 80; 96 %, абсолютные спирты, ацетон) и импрегнацию (пропитка образцов смесью эпоновых смол с последующей полимеризацией). Образцы были подготовлены для ультраструктурного анализа по методике ультратонких срезов. Срезы с эпоновых блоков готовили с использованием микротома LKB-III, после чего монтировали на блендах с полимерной подложкой и контрастировали солями тяжёлых металлов (уранилацетат, цитрат свинца).
Материал просматривали на электронном микроскопе Jeol JEM-1011, полученные методом случайных бесповторных полей микрофотографии подвергали морфометрическому анализу в программе ImageJ (сборка FIJI). Статистическую обработку данных осуществляли в программах Statistica 6.0 и MS Excel. Попарное сравнение выборок проводилось с использованием теста Манна-
Уитни с исходным уровнем значимости а = 0,05 и последующей коррекцией уровня значимости по методу Бенджамини-Хохберга (контроль частоты ложноположительных результатов).
Результаты и обсуждение. Форма бактериальных клеток E. coli на ультратонких срезах округлая, овальная и палочковидная (в связи с различным положением клеток относительно плоскости прохождения среза). Электронограммы демонстрируют извилистую многослойную клеточную стенку, которая является характерной для грамотрицательных бактериальных клеток. Ультраструктура цитоплазмы нативных бактерий характеризуется высокой электронной плотностью с заполнением гранулярным компонентом - рибосомами, полирибосомами. Область нуклеоида не всегда визуализируется.
Воздействие ионизирующего излучения внешне проявляется присутствием большего количества клеток E. coli с увеличенным периплазматическим пространством, а также меньшим количеством вытянутых форм. Общая морфологическая картина бактерий контрольной группы представлена разнообразными формами в большей степени, в том числе вытянутыми (полиморфность); преимущественно клетками с увеличенным периплазматическим пространством; придатков клеточной стенки (таких, как пили) не отмечено; везикулообразование почти не наблюдается. У бактерий опытной группы полиморфность менее выражена; удлиненные бактерии почти не встречаются; придатки клеточной стенки (такие, как пили) не отмечаются и везикулообразование крайне незначительно. Морфометрические показали клеток E. coli до и после облучения представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Морфометрические показали клеток E. coli до и после облучения
Группа бактерий Площадь Периметр Длина Ширина
Контроль 0,72(0,46) цм2 3,31(1,47) цм2 1,33(0,74) цм 0,67(0,1) цм
Опыт 0,58(0,26) цм2 2,87(0,8), цм2 1,11(0,39) цм 0,66(0,11) цм
Бактерии контрольной группы представлены разнообразными: округлыми, овальными и вытянутыми (в том числе с перетяжками) формами (полиморфность). У большинства бактерий клеточная стенка имеет структуру, характерную для грамотрицательных форм, внешне без повреждений; ультраструктура цитоплазмы многих клеток характеризуется высокой электронной плотностью с заполнением гранулярным компонентом - рибосомами, полирибосомами. Вместе с тем встречаются клетки с увеличенным периплазматическим пространством, электронно-светлой цитоплазмой и фрагментами нитей нуклеоида. У незначительного количества клеток отмечается разрушение клеточной стенки (рисунок 1).
КС - клеточная стенка; ЦП - цитоплазма; I II I - периплазматическое пространство; Н - нуклеоид. Короткими стрелками указана перемычка места деления клетки
Рисунок 1 - Фрагмент среза культуры E. coli контрольной группы
У бактерий опытной группы главным образом присутствуют округлые и овальные формы, палочковидных форм мало, удлиненные почти не встречаются. У большинства бактерий клеточная стенка имеет структуру, характерную для грамотрицательных форм, внешне без повреждений.
Ультраструктура цитоплазмы многих бактерий имеет достаточно высокую электронную плотность. На этом фоне в незначительном количестве все же встречаются клетки с цитоплазмой, имеющей электронно-светлые участки, с видимыми нитями нуклеоида и увеличенным периплазматическим пространством. Иногда встречаются клетки с поврежденной клеточной стенкой (рисунок 2).
КС - клеточная стенка; ЦП - цитоплазма; I II I - периплазматическое пространство; Н - нуклеоид
Рисунок 2 - Фрагмент среза культуры E. coli опытной группы
Проведенный морфометрический анализ показывает, что в данном эксперименте воздействие ионизирующего излучения характеризуется изменением размеров бактериальных клеток в направлении их уменьшения.
Заключение. Проведенным исследованием воздействия ионизирующего излучения на ультраструктурную организацию E. coli выявлено, что бактериальные клетки на ультратонких срезах округлой, овальной и палочковидной формы (в связи с различным положением клеток относительно плоскости прохождения среза). Электронограммы демонстрируют извилистую многослойную клеточную стенку, характерную для грамотрицательных бактериальных клеток. Ультраструктура цитоплазмы нативных бактерий характеризуется высокой электронной плотностью с заполнением гранулярным компонентом - рибосомами, полирибосомами. Область нуклеоида не всегда визуализируется. Воздействие ионизирующего излучения внешне проявляется присутствием большего количества клеток E. coli с увеличенным периплазматическим пространством, а также меньшим количеством вытянутых форм.
Благодарности: авторы выражают благодарность доктору ветеринарных наук, профессору Низамову Рамзи Низамовичу, доктору биологических наук Спиридонову Геннадию Николаевичу и кандидату биологических наук Яруллину Айнуру Ильнуровичу за оказанную методическую помощь в проведении работы.
Литература
1. Lagoda, P. J. L. Effects of radiation on living cells and plants // Plant mutation breeding and biotechnology. - Wallingford UK : CABI, 2012. - Р. 123-134.
2. Морфофункциональные особенности высокочувствительных к дезинфицирующим средствам бактерий Escherichia coli K-12 при воздействии дезинфицирующего средства «Тотус» / В. Н. Герасимов, А. Е. Конев, Н. Б. Роганова [и др.] // Бактериология. - 2017. - Т. 2, № 2. - С. 59-65. - DOI 10.20953/2500-1027-2017-2-59-65.
3. Воздействие хитозана на ультраструктуру клеток патогенных и условно-патогенных микроорганизмов / В. М. Бондаренко, О. В. Рыбальченко, Н. Б. Вербицкая, С. Ф. Антонов. - URI: http://hdl.handle.net/123456789/2451 (дата обращения: 23.01.2023).
4. Фенотипическая изменчивость E. coli, индуцированная у-лучами 60Co / М. Ю. Галлямова, К. Н. Вагин, Р. Н. Низамов [и др.] // Ветеринарный врач. - 2021. - № 3. - С. 19-23. - DOI 10.33632/1998-698X.2021-3-19-23.
5. Анализ изменчивости генома облученной E. coli / М. Ю. Галлямова, Н. И. Хаммадов, К. Н. Вагин, Г. И. Рахматуллина // Генетические и радиационные технологии в сельском хозяйстве : сборник докладов I Международной молодежной конференции, 18-21 октября 2022 г. - Обнинск : ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии», 2022. - С. 122-125.
6. Еспембетов, Б. А. Электронная микроскопия микобактериофагов / Б. А. Еспембетов, Н. С. Сырым, В. Л. Зайцев [и др.] // 1здешстер, нэтижелер. - 2018. - №. 1 (77). - С. 380-387.
7. Изучение изменения ультрамикроструктуры клеток Escherichia coli под влиянием Cry-белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis с помощью электронной микроскопии / Е. Г. Климентова, Т. Г. Юдина, Л. К. Каменек [и др.] // Ульяновский медико-биологический журнал. - 2015. - №. 3. - С. 90-94.
8. Особенности ультраструктурной организации бактерий Brucella melitensis при воздействии гамма-лучей: морфометрический аспект / М. А. Косарев, М. М. Сальникова, Г. С. Кашеваров [и др.] // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2022. - № 9(215). - С. 76-83. - DOI 10.53083/1996-4277-2022-215-9-76-83.
9. Муртазина, Г. Х. Электронно-микроскопические исследования антибактериального эффекта селимакцида в отношении сальмонелл и эшерихий / Г. Х. Муртазина, М. М. Сальникова // Казанский медицинский журнал. - 2016. - Т. 97, №. 1. - С. 77-83.
10. Морфометрическая оценка особенностей влияния селимакцида на ультраструктурную организацию клеток Escherichia coli и Salmonella enteritidis / М. М. Сальникова, Р. М. Потехина, В. Р. Саитов [и др.] // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. - 2022. - №. 11 (188). - С. 84-91.
References:
1. Lagoda, P. J. L. Effects of radiation on living cells and plants // Plant mutation breeding and biotechnology. - Wallingford UK : CABI, 2012. - Р. 123-134.
2. Morphofunctional features of Escherichia coli K-12 bacteria highly sensitive to disinfectants under the influence of the disinfectant "Totus" / V. N. Gerasimov, A. E. Konev, N. B. Roganova [et al.] // Bacteriology. - 2017. - V. 2, No 2. - P. 59-65. - DOI 10.20953/2500-1027-2017-2-59-65.
3. Effect of chitosan on the cell ultrastructure of pathogenic and opportunistic microorganisms / V. M. Bondarenko, O. V. Rybalchenko, N. B. Verbitskaya, S. F. Antonov. - URI: http://hdl.handle.net/123456789/2451 (date of access: 01/23/2023).
4. Phenotypic variability of E. coli induced by 60Co y-rays / M. Yu. Galliamova, K. N. Vagin, R. N. Nizamov [et al.] // Veterinarian. - 2021. - No 3. - P. 19-23. - DOI 10.33632/1998-698X.2021-3-19-23.
5. Analysis of variability of the genome of irradiated E. coli / M. Yu. Galliamova, N. I. Hammadov, K. N. Vagin, G. I. Rakhmatullina // Genetic and radiation technologies in agriculture: collection of reports of the I International Youth Conference, October 18-21, 2022 - Obninsk: All-Russian Research Institute of Radiology and Agroecology, 2022. - P. 122-125.
6. Espembetov, B. A. Electron microscopy of mycobacteriophages / B. A. Espembetov, N. S. Syrym, V. L. Zaitsev [et al.] // Izdenister, netizheler. - 2018. - No 1 (77). - P. 380-387.
7. Study of changes in the ultramicrostructure of Escherichia coli cells under the influence of Cry-proteins of parasporal crystals of Bacillus thuringiensis using electron microscopy / E. G. Klimentova, T. G. Yudina, L. K. Kamenek [et al.] // Ulyanovsk Biomedical magazine. - 2015. - No. 3. - P. 90-94.
8. Features of the ultrastructural organization of bacteria Brucella melitensis under the influence of gamma rays: morphometric aspect / M. A. Kosarev, M. M. Salnikova, G. S. Kashevarov [et al.] // Bulletin of the Altai State Agrarian University. - 2022. - No 9 (215). - P. 76-83. - DOI 10.53083/1996-4277-2022-2159-76-83.
9. Murtazina, G. Kh. Electron microscopic studies of the antibacterial effect of selimaccid against Salmonella and Escherichia / G. Kh. Murtazina, M. M. Salnikova // Kazan Medical Journal. - 2016. - T. 97, No 1. - P. 77-83.
10. Morphometric evaluation of the features of the effect of selimaccid on the ultrastructural organization of Escherichia coli and Salmonella enteritidis cells / M. M. Salnikova, R. M. Potekhina, V. R. Saitov [et al.] // Bulletin of the Krasnoyarsk State Agrarian University. - 2022. - No 11 (188). - P. 84-91.
© Галлямова М. Ю., Вагин К. Н., Махмутов А. Ф., Кашеваров Г. С., Саитов В. Р. 2023
