CC BY
99
УДК 619:616.981.42:615.371:615.372:576.007.4
ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАТОНКОГО СТРОЕНИЯ ЖИВЫХ И ИНАКТИВИРОВАННЫХ КУЛЬТУР BRUCELLA MELITENSIS И BRUCELLA ABORTUS
М.М. САЛЬНИКОВА, ведущий инженер В.Р. САИТОВ, кандидат ветеринарных наук, зав. сектором
Г.М. САФИНА, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
И.Ф. РАХМАТУЛЛИН, ведущий инженер М.А. КОСАРЕВ, кандидат биологических наук, научный сотрудник
А.М. ФОМИН, доктор ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник
ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
E-mail: [email protected]
Резюме. Для электронно-микроскопических исследований использовали культуры Brucella melitensis штамм Rev-1 и Brucella abortus штаммы 82, R-1096, какживые, так и термо- или Y-инактивированные вакцины. Отмечена палочковидная форма клеток. Клеточная стенка имеет план строения идентичный всем грамотрицательным бактериям. На внешней поверхности живых и инактивированных клеток имеются мембраноподобные образования длиной до 0,9 мкм. Гамма-облученные микроорганизмы отличаются увеличенным периплазматическим пространством, просветленной цитоплазмой, отсутствием рибосом в области нуклеоида, наличием плотных включений в цитоплазме и пери-плазматическом пространстве. В культуре отмечаются сферо-пласты и протопласты. Клетки бруцелл после тепловой обработки характеризуются нарушением структуры цитоплазмы. Показано конденсирование содержимого гиалоплазмы, нарушение белок-синтезинтезирующего комплекса клетки и фрагментирование структур ДНК. Гамма-облучение можно отнести кболее щадящим режимам инактивации клеток, по сравнению с термообработкой. В живых и инактивированных культурах отмечены электроннопрозрачные мембраноограниченные везикулы.
Ключевые слова: электронная микроскопия, бруцеллы, живые противобруцеллезные вакцины, инактивированные вакцины.
Бруцеллез, как антропозоонозное заболевание, до сих пор остается одной из важнейших проблем современной медицины и ветеринарии [1, 2]. Более того, установлено [3], что эпизоотолого-эпидемиологическая обстановка по бруцеллезу, сложившаяся в ряде Федеральных округов России, дает основание прогнозировать увеличение заболеваемости этой инфекцией среди сельскохозяйственных животных и населения.
Поэтому, несмотря на достигнутые успехи в борьбе с этим заболеванием, научно-практический поиск наиболее эффективных путей оздоровления от бруцеллеза, как отдельных хозяйств, так и целых регионов по-прежнему остается одной из приоритетных задач ветеринарной отрасли.
В системе противоэпизоотических мероприятий при бруцеллезе животных решающую роль всегда играла специфическая профилактика [4]. В связи с чем разработка у-инактивированных вакцин и изучение их иммунологической эффективности, по сравнению с живыми вакцинами штаммов B. abortus 82 и B. melitensis Rev-1, на морских свинках и овцах - перспективное научное направление.
Возбудитель заболевания Brucella относится к грамо-трицательным, неспорообразующим аэробным бактериям с неясным систематическим положением [5].
Цель наших исследований - изучение влияния термо-и у-инактивации на ультратонкую структуру бруцелл.
Условия, материалы и методы. Для электронномикроскопических исследований использовали культуры Brucella abortus штаммов 82 (SR форма колоний), R-1096 (R-колонии) и Brucella melitensis штамм Rev-1 (S-колонии). Инактивацию проводили на штаммах B. abortus 82 и B. melitensis Rev-1. Гамма-инактивированную культуру получали облучением на гаммаустановке «Исследователь», Со60 с мощностью экспозиции 14 кГр/час в дозе 60 кГр. Тепловую обработку проводили при t 80°С, 30 мин. Культуру выращивали в течение 3 суток на печеночном агаре. Концентрат бактериальной суспензии, полученный центрифугированием (8 тыс. об.), промывали и заключали в агар Дифко. Кусочки, заключенной в агар культуры, фиксировали 1 %-ным раствором глутарово-го альдегида (SERVA, Германия) на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 в течение12 часов в холодильнике с последующей фиксацией в 2 %-ной четырехокиси осмия (Московский химзавод) на том же буфере 2 часа при комнатной температуре. После дегидратации и пропитки заливочной средой образцы заключали в эпо-новые смолы (SERVA, Германия). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-3 и просматривали на электронном микроскопе JEM 100СХ-2. Полученные
Рис. 1. Клетки живой культуры: а) Brucella abortus штамм 82; б) Brucella abortus штамм R-1Q96; в) Brucella melitensis штамм Rev-1; КС - клеточная стенка, ПП - периплазматическое пространство, ЦП - цитоплазма, ПМ - плазматическая мембрана, ВК - включения.
Рис. 2. Участок клетки живой культуры Brucella melitensis штамма Rev-1: а) на внешней поверхности клеток просматривается мембраноподобные образования (указано стрелками); б) рядом с клеточной мембраной просматриваются мембраноограниченные сферические везикулы (указаны стрелками); КС - клеточная стенка, ПП - периплазматическое пространство.
негативы сканировали на сканере EPSON PERFECTION 4990 FHOTO с разрешением 600 dpi.
Результаты и обсуждение. На ультратонких срезах клетки живых культур имеют шаровидную или палочковидную форму, размеры 0,3...0,6 х 0,8...2,5 мкм. Все исследованные штаммы на субмикроскопическом уровне практически не отличаются.
На микрофотографиях хорошо просматривается извилистая многослойная клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана, которые окружают бактериальные клетки, характерные для грамотрицательных микроорганизмов [6]. Наружная мембрана клеточной стенки представляет собой волнообразную трехслойную структуру сходную с цитоплазматической мембраной (рис. 1). С внешней стороны наружной мембраны клеточной стенки отмечается наличие электронноплотного материала мелко-глыбчатой или фибриллярной структуры, вероятно состоящего из олигосахаридных детерминантных групп липополисахаридов. Кроме того, на внешней поверхности клеток просматриваются мембраноподобные образования (рис. 2) длиной до 20.90 нм и шириной 7,5 нм. При анализе литературы мы не обнаружили упоминаний о наличии подобных образований у бруцелл. Под наружной мембраной просматривается пластинчатый мембраноподобный внутренний ригидный слой клеточной стенки, образованный пептидогликанами. Общая толщина слоев клеточной стенки составляет 21.24 нм.
Под клеточной стенкой располагается относительно ровная цитоплазматическая мембрана (7,5...8,5 нм), контуры ее не повторяют извилистости наружной мембраны. У некоторых клеток наблюдается примыкание цитоплазматической мембраны к клеточной стенке.
Между цитоплазматической мембраной и клеточной стенкой имеется периплаз-матическое пространство, характерное для грамотрицательных бактерий. У некоторых клеток (возможно, во время LOG-фазы роста) оно располагается ровной полосой шириной 32.45 нм с гомогенным веществом средней электронной плотности. У штамма 82 отмечается более светлое периплазматическое пространство. Иногда наблюдается увеличение площади перипласта с электроннопрозрачным содержимым в дистальных участках бруцелл (на стационарной фазе роста) до 150 нм.
Ультраструктура цитоплазмы бактерий Brucella обладает высокой электронной плотностью и заполнена рибосомами и полирибосомами. Включений мало, встречаются округлые мелкие плотные осмиофиль-ные гранулы размером 20. 50 нм, а также округлые внутрицитоплазматические мембранные структуры в непосредственной близости к плазматической мембране.
В области нуклеоида некоторых клеток просматриваются нити ДНК (см. рис. 1) на фоне темной цитоплазмы. Они не всегда видны из-за плотности цитоплазмы или плоскости прошедшего среза.
Вокруг клеток или в непосредственной близости с наружной мембраной клеточной стенки были видны ограниченные мембраной сферические везикулы (см. рис. 2) размером 85.250 нм с электронносветлым содержимым, которые, вероятно, отшнуровываются от поверхности клеточной стенки. Подобные образования отмечены у бруцелл и другими авторами [7]. Деление клеток проходило путем перетяжки, что типично для грамотрицательных бактерий.
Размер бактериальных клеток после инактивации гамма-излучением не меняется. Клеточная стенка выравнивается, с внешней и внутренней сторон наружной мембраны наблюдается меньшее количество или полное отсутствие электронноплотного материала. На наружной мембране клеточной стенки выявлены мембраноподобные структуры (рис. 3). При инактивирова-нии культуры происходит неравномерное увеличение и просветление периплазматического пространства. Одновременно отмечается конденсирование глобулярных компонентов и появление осмиофильных гранул в отдельных участках перипласта, особенно много их со стороны цитоплазматической мембраны. На некоторых участках можно наблюдать утрату целостности клеточной стенки. В инактивированной культуре встречаются протопласты и сферопласты. Цитоплазма гамма-облученных клеток просветляется и уменьша-
Рис. 3. Клетки Brucella melitensis культуры штамма Rev-1 после гамма-облучения: а) просматриваются клетка с ДКС, на внешней поверхности клеток просматривается мембраноподобные образования (указано стрелками); б) на дистальных участках наблюдается увеличение периплазматического пространства; КС - клеточная стенка, ПП - периплазматическое пространство, ЦП - цитоплазма; ПМ - плазматическая мембрана, ВК - включения, ДКС - дефект клеточной стенки
81
Рис. 4. Клетки после тепловой обработки: а) Brucella melitensis штамм Rev-1. На внешней поверхности клеток просматривается мембрано-подобные образования (указано стрелками); б) Brucella abortus штамма 82; КС - клеточная стенка, ПП - периплазматическое пространство, ЦП - цитоплазма; ВЗ - везикулы.
ется количество свободных рибосом. В клетках четко просматриваются нити ДНК. В структуре цитоплазмы определяются плотные осмиофильные включения размером 40.50 нм в отдельных участках клетки. На микрофотографиях среди клеток наблюдаются мембраноограниченные сферические везикулы.
Размер клеток бруцелл после тепловой обработки практически не меняется, клеточная стенка теряет извилистость, ее структура повторяет строение клеточной стенки гамма-облученных клеток. Отмечаются мембраноподобные структуры на внешней стороне клеточной стенки (рис. 4). Периплазматическое пространство просветляется и уменьшается. Это приводит к тому, что не всегда можно рассмотреть границу между клеточной стенкой и плазматической мембраной. Обнаруживаются сферопласты. В бактериальных клетках после теплового шока нарушается структура цитоплазмы. Ее конденсированное содержимое в виде гомогенных электронноплотных участков распределено неравномерно. В цитоплазме просматриваются редкие фибриллярные структуры ДНК, полирибосомы и рибосомы не обнаруживаются. Также отмечается накопление осмиофильных
включений размером 40.50 нм. Между клетками и в непосредственной близости с клеточной стенкой на микрофотографиях наблюдаются мембраноограниченные сферические везикулы.
В среде, окружающей бактериальные клетки после облучения и теплового воздействия, обнаруживаются фрагменты клеточных мембран, которые не наблюдались в живых культурах.
Выводы. Таким образом, на внешней поверхности клеток бруцелл имеются мембраноподобные образования длиной до 0,9 мкм, которые сохраняются после инактивации. Гамма-облученные микроорганизмы характеризуются увеличенным пе-риплазматическим пространством из-за уменьшения объема цитоплазмы, меньшим количеством рибосом, наличием плотных включений в цитоплазме и пери-плазматическом пространстве. В культуре отмечается появление сферопластов и протопластов.
Клетки бруцелл после тепловой обработки отличаются от живых нарушением структуры цитоплазмы: конденсирование содержимого гиалоплазмы, фрагментирование структур ДНК. Вероятно, это связано с разрушением белок-синтезинтезирующего комплекса клетки.
Гамма-облучение можно отнести к более щадящим режимам инактивации, по сравнению с термообработкой. В живых и инактивированных культурах отмечаются электронно-прозрачные мембраноограниченные везикулы.
Авторы выражают благодарность доктору медицинских наук Диденко Любови Васильевне заведующей лабораторией анатомии микроорганизмов института эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН за полезные консультации.
Литература.
1. Желудков М.М., Цирельсон Л.Е. и др. Состояние заболеваемости бруцеллёзом на территории РФ. // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Материалы научно- практической конференции, 21-22марта 2007г., г. Ставрополь. 2.1. - Ставрополь, 2007. - С 142-145.
2. Цирельсон Л.Е. Бруцеллёз в России: профессиональные заболевания и трудовой прогноз. //Эпидемиология и инфекционные болезни. - № 5. - 2011. - С. 43-47.
3. Эпизотолого-эпидемиологическая обстановка по бруцеллёзу в Российской Федерации в 2010 г. и прогноз на 2011 г. /Г.И. Лямкин, Н.И. Тихонко, Е.А. Манин, С.В. Виленская, С.И. Головыева, Д.В. Русанова, А.Н. Куличенко//Проблемы особо опасных инфекции. - № 1. - 2011. - С. 20-23.
4. Аракелян П.К., Димов С.К., Ощепков В.Г., Донченко А.С. Система контроля эпизоотологического процесса бруцеллёза мелкого рогатого скота. //Ветеринария - № 2. - 2008. - С. 20-22.
5. Золотарев А.Г., Дармов И.В., Пименов Е.В. Возбудители особо опасных инфекционных заболеваний бактериальной природы: Морфология и ультраструктура. - М.: «Медицина», 2006. - 272 с.
6. Авакян А.А., Кац Л.Н., Павлова И.Б. Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных. - М.: «Медицина», 1972. - 182 с.
7. Petris S., Karlsbad G., Kessel R.W. Ultrastructure of S and R Variants of Brucella abortus Grown on a Lifeless Medium.// J. gen. Microbiol. - № 35. - 1963. - P. 373-382.
STUDY OF LIVE AND INACTIVATED BRUCELLA MELITENSIS И BRUCELLA ABORTUS CELL
CULTURES ULTRASTUCTURE M.M. Salnikova, V.R. Saitov, G.M. Safina, I.F. Rahmatullin, M.A. Kosarev, A.M. Fomin
Summary. Farm animal brucellosis still remains one of the crucial challenges in modern Medicine and Animal Health. Rev-1 Brucella melitensis and 82, R-1096 Brucella abortus live, thermo- and y-inactivated vaccine strain cultures were studied under electron microscopy. The cells had a rod-like shape. The cellular walls had the structure peculiar to all the gram-negative bacteria. The outer surface of both live and inactivated cells has membrane-like formations with length up to 0,9 mkm. The y-irradiated microorganisms had a higher periplasmic space, cleared cytoplasm, with no ribosome in nucleoid, but firm inclusions in cytoplasm and periplasmic space. The cultures had spheroplasts and protoplasts. Heating destroyed brucella cytoplasm structure. The hyaloplasm condensation, the protein producing apparatus was damaged, and the DNA structure fragmentation was observed. The inactivation involving y-irradiation is sparer than heating. The live and inactivated cultures had electronically transparent membrane-confined vesicles.
Key words: electron microscopy, brucella, live vaccine, inactivated vaccine.
