CC BY
132
задачей анкеты был анализ удобства и простоты использования программ дифференциальной диагностики ушибов головного мозга. По мнению респондентов, программа достаточно удобна и проста в использовании (все респонденты отметили высший балл).
Анализ удобства использования программы вероятностной диагностики туберкулеза выполнен по результатам анкетирования 19 врачей-неврологов, различных клиник региона. Всеми респондентами отмечена простота использования программы, из замечаний указана сложность интерпретации некоторых критериев (что послужило причиной для создания справочного меню для данной программы).
Таким образом, предложенные три этапа оценки клинической эффективности программы, позволяют оценить удобство использования данного программного продукта в практическом здравоохранении, диагностическую эффективность (чувствительность и специфичность), а так же эффект от внедрения в практическое здравоохранение.
Полученные данные позволяют сравнительно высоко оценить диагностическую эффективность созданных программ.
Литература
1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. / С. Гланц.- М.: Практика, 1999.- 459 с.
2. Гречухин, И.В. Перспективы внедрения информационных технологий для профилактики травматизма / И.В. Гречухин, А.Б. Федоренко // Врач и информационные технологии.- 2010.— № 6.- С. 36^0.
3. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2010613749. Автоматизированная информационная система: Учет больных туберкулезом ЦНС / А.Г. Немков, Д.Б. Егоров, А.Г. Санников.- опубл. 08.06.10.
4. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2007611047. Экспертная система: Дифференциальная диагностика ушиба головного мозга /А.Г. Немков [и др.]. - заявл. 22.01.07; опубл. 09.03.07. // Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности патентам и товарным знакам.- 2007.- № 2 (59) (Ч. 2).- С. 243.
5. Скудных, А.С. Методика оценки клинической эффективности диагностической экспертной системы / А.С. Скудных, А.Г. Санников // Врач и информ. технологии.- 2007.- № 5.- С. 50-55.
6. Столбов, А.А. «В информатизации здравоохранения сегодня доминирует «хаос тактик» / А.А. Столбов.- 12.03.2009, http://www.cnews.ru/news
CLINICAL ASSESSMENT EOF THE DIAGNOSTIC INFORMATION EXPERT SYSTEMS IN URGENT NEUROSURGERY
A.G. NEMKOV, A.G. SANNIKOV, D.B. YEGOROV
Tyumen State Medical Academy
Nowadays high quality medical assistance is unthinkable without creating conditions for rapid access to information and reference materials. This is especially true in urgent cases. Optimum is the creation of information expert systems. An important task is to assess their diagnostic efficacy. The proposed three stages of examination programs can assess the convenience of the given software in practical public health, diagnostic efficacy (sensitivity and specificity) as well as the effect of the introduction into practical public health.
Key words: urgent neurosurgery, expert systems, performance examination.
УДК 616.831+612.82-073.582-092.9+591.481.1+576.5
МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ АВТОМАТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МОРФОЛОГИИ МИТОХОНДРИЙ КОРЫ БОЛЬШОГО МОЗГА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И В ПОСТИШЕМИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ
С.С. СТЕПАНОВ*, П.В. БЕЛИЧЕНКО**, А.В. МЫЦИК*, В.А.
АКУЛИНИН*
Рассмотрены особенности проблемы получения объективной информации о структурно-функциональном состоянии митохондрий
нейропиля различных слоев коры большого мозга эксперименталь-
* Кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО Омская госу-
дарственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ, Омск, Российская Федерация Департамент неврологии, Университет Калифорнии, Сан-Диего, США
ных животных (белые мыши, крысы) и человека в норме и пости-шемическом периоде. Предложен способ автоматизированного компьютерного анализа изображений, основанный на использовании программы 1ша§е1 1.46.
Ключевые слова: митохондрии, морфометрия, автоматический анализ изображений.
Необходимость исследования структурно-функционального состояния митохондрий на различных уровнях экранных образований головного мозга экспериментальных животных и человека обусловлена стремлением выявления особенностей их пространственной организации в крупных и мелких дендритах, аксонах, а также пре- и постсинаптических зонах синапсов в норме, в процессе онтогенетического развития и при различных патологических воздействиях. Существенное значение при этом имеет поиск средств регуляции деструктивных и компенсаторно-
восстановительных процессов в митохондриях, определяющих состояние биоэнергетики нейронов [6,7,10].
Однако, получение объективных данных при изучении митохондрий нейропия сопряжено с техническими проблемами и является очень трудоемким процессом [12]. Для оценки этих органелл, как правило, требуется определение численной плотности профилей срезов, площади среза митохондрии, ее большой и малой оси и периметра, а также площади всех митохондрий в поле зрения нейропиля.
Основные проблемы получения объективной информации о размерах и пространственной организации сложных клеточных структур коры большого мозга, гиппокампа и мозжечка животных и человека связаны с компромиссом между приемлемым уровнем ошибок первого и второго рода при проверке статистических гипотез [1,2]. Чем больше размеры групп, тем меньше вероятность ошибки второго рода и выше мощность статистических критериев. Зависимость эта как минимум квадратичная, то есть уменьшение объема выборки в два раза приведет к падению мощности минимум в четыре раза. Отсюда стремление к увеличению размера выборок. Кроме того, необходимо учитывать наличие систематических ошибок при проведении идентификации и измерений сложных структур, зависящих от уровня подготовки специалиста и способа измерения [1,2]. Для устранения такого рода субъективных ошибок требуется привлечения других специалистов и расчета индекса соответствия Каппа, что еще больше усложняет исследование и затрудняет принятие объективного решения [4,5].
Проведенный нами поиск литературных данных показал, что в настоящее время для решения рутинных задач морфомет-рии широко используются различные компьютерные программы автоматического анализа изображений [4,8,9,11]. Среди некоммерческих проектов по числу публикаций лидирует программа ImageJ разных версий [4,11]. Эта программа, специально разработанная для анализа медицинских изображений, имеет открытый код и свободно распространяется на сайте http://rsb.info.nih.gov. При этом она имеет по настоящему неограниченный потенциал для решения всевозможных задач анализа изображений внутриклеточных структур, анализа гистологических препаратов, морфометрического изучения макрообъектов в медицине и биологии. Сотни подключаемых плагинов и макросов существенно увеличивают функциональные возможности программы ImageJ, открытый код делает ее гибкой, легко настраиваемой под любые конкретные требования.
Однако работ, основанных на использовании данной программы для анализа морфологии митохондрий при электронномикроскопических исследованиях в доступных базах данных, нами не выявлено.
Цель исследования — решение проблем получения объективной информации при изучении структурно-функционального состояния митохондрий коры большого мозга экспериментальных животных и человека с помощью автоматизированного компьютерного анализа электронно-микроскопических изображений.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на базе ГБОУ ВПО Омской государственной медицинской академии и департамента неврологии университета Калифорнии (Сан-Диего, США).
Эксперимент проведен на белых мышах (п=5) и крысах (п=10). Алгоритм автоматизированного компьютерного анализа изображений был отработан на электронограммах коры большого мозга (КБМ, слои I, II и III) контрольных белых мышей. Проверка алгоритма проводилась при анализе митохондрий КБМ белых
крыс в норме и через 3 суток после тотальной остановки системного кровотока, вызванной 10 минутной окклюзией восходящей дуги аорты по методу В.Г. Корпачева [3]. Животные содержались в условиях вивария, регламентируемых приказом МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983. Опыты проводили в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.77 и № 701 от 27.07.78 об обеспечении принципов гуманного обращения с животными с использованием анестезии.
Для анализа морфологии митохондрий КБМ человека ин-траоперационный материал забирался в отделении нейрохирургии ГУЗ Омская областная клиническая больница, аутопсийный материал - Омском областном бюро судебно-медицинской экспертизы. Данное исследование одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО Омской государственной медицинской академии протокол №40, от 23.05. 2011г. и информированного согласия родственников на изъятие биологического материала.
Были выбраны пациенты (n=11) с хронической ишемией головного мозга (возраст 23-62 года, 6 мужчин и 5 женщин). Причиной хронической ишемии были различные опухоли головного мозга (ангиоретикулома, менингиома, плоскоклеточный рак, протоплазматическая астроцитома, олигодендроглиома), которые локализовались в лобной, теменной и височной, имели объем от 27 до 195 см3. При магнитно-резонансной томографии вокруг опухоли подтверждалось наличие зоны ишемической полутени. Пациентам, в плановом порядке, была проведена костнопластическая трепанация черепа и удаление патологического очага. В силу глубокого расположения опухолей в удаляемый материал попадали также участки коры большого мозга из пери-фокальной зоны и частично неповрежденная кора. Все пациенты были выписаны из стационара в удовлетворительном состоянии. Контролем служил мозг погибших в результате несчастных случаев (n=7). Аутопсийный материал забирали из левого полушария спустя 5-10 ч после смерти. Во всех случаях исследовалось поле 10 лобной доли коры большого мозга (по Бродману).
Экспериментальный, интраоперационный и аутопсийный материал фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) с 5% сахарозой. Далее материал рассекали на блоки (ориентированные пирамидные), дофиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 1 часа при температуре +4°С, промывали в фосфатном буфере и обезвоживали. Затем все образцы заключали в эпон-аралдитную смесь.
Ультратонкие срезы КБМ на уровне I-III слоев готовили с помощью ультратома UltracutE (фирмы Reichert-Jung). Перед просмотром в электронном микроскопе (Hitachi 600H) материал дополнительно контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. С каждого случая фотографировали 5-10 участков нейро-пиля при увеличении 10000, получали электронограммы размером 70x87 мм (файл с расширением tif, 3242x4210 пикселей, 8 бит). При пересчете в единицы измерения СИ размеры сторон 1 пикселя на конечном изображении составили 2,2x2,2 нм, площадь пикселя - 4,8 нм2.
В аспекте настоящей работы под определение объекта исследования попадали срезы митохондрий, ориентированных в различных плоскостях. Собственно анализ также обеспечивал определение производных величин митохондрий, таких, например, как площадь или периметр объекта, его наклон, поперечные размеры. Для анализа использовали программу ImageJ 1.46, разработанную агентством National Institutes of Health (NIH) Департамента здравоохранения США. Программа обеспечивала быстрый и качественный анализ любых графических объектов, позволяла отображать, редактировать, анализировать, обрабатывать, сохранять и печатать 8-битные, 16-битные и 32-битные изображения. В ImageJ можно вычислять площади, статистические показатели пиксельных значений различных выделенных областей интереса на изображениях, которые выделены вручную или при помощи пороговых функций, измерять расстояния и углы [4,8, 11].
В КБМ животных и человека определяли численную плотность митохондрий, их размеры (периметр, площадь, большой и малый поперечник), а также форму органелл (круглая, овальная, удлиненная) в норме и после ишемии.
Полученные результаты обработаны в программе STATISTICA 6.0. Проверку статистических гипотез проводили при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни (для парного сравнения) и ANOVA Краскела-Уоллиса (для сравнения
трех независимых групп по одному признаку). В каждом сравниваемом случае количество измерений и полей зрения клеток определялось требованиями выявления статистической значимости при р<0,0З.
Результаты и их обсуждение. Отработка деталей алгоритма автоматизированного компьютерного анализа изображений с помощью программы ImageJ 1.4б была проведена на 42 оцифрованных (8 бит, 13б48820 пикселей) электронограммах коры большого мозга контрольных белых мышей. Использование мелких лабораторных животных позволяло создать максимально сходные условия эксперимента. В качестве «золотого стандарта» морфологического анализа митохондрий использовали способ «ручной» визуализации объектов с помощью Photoshop (Version 8.0).
Непременными требованиями к отработке алгоритма программного анализа популяции митохондрий являлись: 1) стандартизация приготовления электронограмм, 2) режимов фотосъемки и ориентации слоев экранных образований головного мозга, 3) исходных порогов и установок программы, 4) увеличения, З) использование цифровой камеры со сходными характеристиками и размером матрицы, б) однородность (схожесть) объектов изучения в различных полях зрения. Это своеобразные факторы включения электронограмм в серийное исследование по отработке алгоритма. Всем этим требованиям отвечали электро-нограммы КМБ белых мышей в норме (рис. 1).
Рис. 1. Фрагмент нейропиля слоя II коры большого мозга белой мыши в норме. А - аксон, Д - дендрит, М - митохондрия, С - синапс. Уранилаце-тат и цитрат свинца. Ув. 10000
Общая схема работы с ImageJ при анализе митохондрий на электронограммах заключалась в следующем: 1) открывался файл с изображением нейропиля (8-битное изображение) (рис. 1); 2) с помощью плагина «Cell Counter» подсчитывалось количество митохондрий в поле зрения (учитывались только полные профили); 3) с помощью апплета «Threshold» устанавливались пороги, в интервале между которыми располагались все пиксели, участвующие в формировании изображения митохондрий (рис. 2А); 4) далее запускался апплет «Analyze Particles» для разделения митохондрий по размерам и форме (позволял исключить объекты, имеющие площадь больше или меньше заданной), циркуляр-ность (при высокой степени отмечались только круглые объекты, при низкой - удлиненные) (рис. 2Б); 5) для визуального контроля указывалась необходимость наложения оверлейной маски митохондрий на исходное изображение (рис. 3).
HI Ш 9
ЕВ ► 107
Default * Red
Г Dart: background Г Stack histogram Auto I Apply I Reset I Set I
sue (риекг) ШВ] Circularity 0.00-0 60
snow Overlay Masks *■
I? Display results Г” Clear results P Summarize [5* Add lo Manager
l~ Exclude on edges W Include holes Г Record starts S' In situ Show
Cancel
J Help 1
А
Б
Рис. 2. Ключевые апплеты программы ImageJ 1.46 для анализа частиц. А - апплет «Threshold» (установка порогов изображения митохондрий -оттенки серого), Б - апплет «Analyze Particles» для разделения митохондрий по размерам и форме
Рис. 3. Оверлейная маска исходного изображения нейропия белой мыши в норме. М - митохондрия
После выполнения апплета формировалась таблица, которая содержала имя графического файла, количество объектов, площадь, периметр, длину, ширину выделенных объектов, общую площадь поля, на котором производился подсчет. При установке шкалы (отношения пиксел/мкм) все данные отражались в мкм [8].
Следующим этапом анализа митохондрий было сравнение оверлейной маски с исходным изображением объекта (рис. 1 и 3). По данным подсчета трех независимых специалистов (пример рис. 3), на исходном изображении было выявлено соответственно 32, 33, 36 (среднее = 33) объектов, идентифицированных ими как митохондрии. Согласно оверлейной маске, в изученном поле зрения было выявлено существенно больше частиц (объектов), удовлетворяющих вводным данным для апплета «Analyze Particles». Это было связано с тем, что кроме митохондрий в ограничивающий интервал размеров и формы попадали другие структуры нейропиля - синапсы, миелиновые оболочки, мелкие дендри-ты и аксоны (рис. 1).
Существенно то, что все объекты, идентифицированные специалистами как митохондрии, были представлены на оверлейной маске. Однако полная дискриминация структур нейропи-ля и митохондрий была затруднена из-за слияния внешних контуров некоторых представленных объектов (рис. 3). Из 33 объектов, идентифицированных как митохондрии, только 28 (84,9%) можно было использовать для дальнейшего анализа. Расчет по
всем включенным в исследование полям зрения (42 поля зрения, около 1500 митохондрий) показал, что доверительный интервал (ДИ) этого показателя составлял 82,5-87,1%. Таким образом, 1500 объектов изучения в нашем исследовании были представлены репрезентативной выборкой (123 8-1307 дискриминированных объектов), пригодной для измерения всех морфометрических параметров митохондрий.
На следующем этапе 1ша§е1 1.46 использовалась для самой трудоемкой задачи любого морфометрического исследования -определения площади, периметра, продольного и поперечного размеров идентифицированных митохондрий, которые являются очень сложными геометрическими формами (рис. 1). При анализе электронограмм контрольных животных последовательность действий записывалась в макрос и изображения автоматически обрабатывались пакетом. Полученные данные помещались в электронную таблицу, которая легко импортировалась в другие приложения (например, 8Р88). Окончательные резуль-
таты морфометрического исследования митохондрий в КБМ контрольных животных в зависимости от способа измерения представлены в табл.
Таблица
Морфометрическая характеристика митохондрий коры большого мозга контрольных белых мышей, Ме &к)
Показатели Способ морфометрического анализа Р
Автоматический с помощью ImageJ 1.46А Ручнойс помощью Photoshop 8.0
Общая численная плотность митохондрий на 100 мкм2нейропиля 52 (43; 64) 54 (45; 67) >0,05
Площадь митохондрии, пиксели 23335,5 (19258; 28715) 27440,0 (20562; 31124) >0,05
Периметр митохондрии, пиксели 2749,5 (2401;3298) 2125,5 (1754; 2375) =0,03*
Меньшая ось, пиксели 124,5 (114; 131) 128,0 (117; 138) >0,05
Большая ось, пиксели 219,5 (195; 246) 229,0 (205; 258) >0,05
Площадь всех митохондрий в поле зрения, пиксели 795472 (588536; 981708) 932960 (765489; 1108543) >0,05
Отношение большая/меньшая ось, ус.ед. 1,76 1,79 >0,05
Распределение митохондрий по размерам, % <=20000 пикселей 20001-40000 40001-60000 60001-80000 80001-100000 100001-120000 120001-140000 пикселей 57,09 (ДИ 53,6560,48%) 26,68 (23,70-29,83%) 9,74 (7,81-11,96%) 3,73 (2,55-5,25%) 1,80 (1,01-2,95%) 0,60 (0,20-1,40%) 0,36 (0,07-1,05%) 54,20 (ДИ 50,75-57,63%) 28,10 (25,0731,29%) 10,62 (8,6112,91%) 3,98 (2,765,54%) 1,90 (1,093,08%) 0,70 (0,251,53%) 0,50 (0,251,53%) Х2=6,6; df=6; p=0,36
Проверка на тип распределения Критерий Колмогорова-Смирнова (p<0,01), Лиллие-форса (p<0,01), Шапиро-Уилка (p=0,0000)
Примечание: * - различия между результатами сравниваемых способов морфометрического анализа изображения статистически значимы при р<0,05 (критерий Колмогорова-Смирнова). Материал представлен как медиана (нижний и верхний квартили) и проценты. А - из всех митохондрий поля зрения нейропиля полная автоматическая дискриминация возможна только в 82,5-87,1% случаев. ДИ - доверительный интервал
Согласно данным, представленным в табл., распределение размеров митохондрий отличалось от нормального со смешением в сторону мелких митохондрий. Статистически значимые различия были выявлены только по показателю, характеризующему периметр изученного объекта. Это было, вероятно, связано с тем, что при традиционном «ручном» способе анализа в процессе контурирования митохондрий происходило сглаживание контуров объекта (приближение к овалу или кругу).
По нашим данным, реальные размеры митохондрий в КБМ белых мышей составили: малая ось (толщина) - 0,274 (0,251; 0,288) мкм, большая ось (длина) - 0,483 (0,429; 0,541) мкм, площадь среза
- 0,113 (0,093; 0,139) мкм2. Максимальная толщина митохондрий была 0,704 мкм, а длина - 2,347 мкм, минимальная толщина составила 0,075 мкм. Выявлялась положительная корреляционная связь (г=0,85; р<0,05, Спирмен) между размерами митохондрии и диаметром ветви дендрита, в котором она располагалась. Наиболее крупные митохондрии локализовались в дендритах на уровне слоя III КБМ. В зоне синапсов преобладали мелкие и средние митохондрии округлой формы. В различных полях зрения срезы митохонд-
рий занимали от 3,02 (min) до 14,8% (max).
Таким образом, полученная в ходе автоматического анализа выборка объектов была репрезентативной и правильно отражала структуру митохондриальной популяции коры большого мозга белых мышей в норме. Следовательно, разработанный алгоритм автоматического анализа митохондрий с помощью программы ImageJ 1.46 можно использовать для морфометрического исследования митохондрий в норме.
Применение данного алгоритма позволило существенно сократить трудоемкость и увеличить точность процесса измерения митохондрий. Алгоритм был опробован при морфометрическом исследовании митохондрий нейропиля КБМ белых крыс и человека в норме и при ишемии. При рутинном способе измерения, требующем ручного контурирования объекта, на анализ одного поля зрения (в норме) было необходимо 56±21 мин (среднее ± стандартное отклонение, n=60), а при использовании ImageJ 1.46
- 15±5 мин (критерий Колмогорова-Смирнова, р<0,001). Кроме того, при рутинном способе измерения у разных исследователей и у одного исследователя при повторном анализе через продолжительное время отмечались статистически значимые различия по ряду изученных показателей конкретной митохондрии. Особенно различались результаты контурирования сложных и очень мелких митохондрий, влияющие на измерение площади их среза. То есть, результаты измерений митохондрий с помощью ImageJ 1.46 были существенно более стабильными и не зависели от конкретного специалиста.
Таким образом, для максимально полного и объективного анализа структурно-функционального состояния митохондрий КБМ экспериментальных животных и человека в норме с помощью программы ImageJ необходима следующая схема морфометрического и статистического анализа.
Первый этап - идентификация нужных объектов - состоит из: 1 шаг - определение площади и формы фигур; 2 шаг - визуальный контроль специалиста.
Второй этап - собственно морфометрический анализ параметров идентифицированных митохондрий (численная плотность, площадь, размеров осей), а на основании этих данных -анализ особенностей структурно-функционального состояния митохондрий различных отделов и слоев КБМ.
Третий этап - формирование массива данных в базовых таблицах статистических программ (Statistica, SPSS, MedCalc, Excel).
Четвертый этап - системный статистический анализ фактического материала из полученных таблиц с помощью различных методов статистики, включая и методы дискриминантного анализа с построением прогностической модели.
Полученные результаты, кроме доказательства возможности использования программы ImageJ 1.46 для морфометрических исследований митохондрий, свидетельствует о необходимости индивидуального решения каждой поставленной задачи и наличия контроля специалиста. Программа существенно облегчает получение количественных данных, но не избавляет от необходимости заключительного контроля специалиста. Это связано с тем, что митохондрии имеют очень сложное строение и представлены неоднородной популяцией (размер, форма, тинкториальные свойства матрикса, плотность пространственного распределения), дискриминация которой на морфологические типы возможна только при одновременном или последовательном анализе большого количества параметров, включая и мнение специалиста. Основным преимуществом использования ImageJ является (при условии правильной идентификации объектов), высокая степень результативности измерений, быстрая последующая морфометрическая оценка больших массивов митохондрий по множеству параметров и возможность стороннего контроля каждого шага исследования по графическому и табличному архиву.
Для верификации и морфометрического изучения митохондрий в постишемическом периоде использовали КБМ белых крыс и человека. Острая и хроническая ишемия приводила к существенному изменению изображений митохондрий в отростках и синапсах нейропиля (рис. 4А). Наряду с типичными для нормы митохондриями появлялись органеллы с выраженными ультра-структурными изменениями - отеком, набуханием, вакуолизацией, просветлением матрикса. Кроме того, в результате изменения тинкториальных свойств цитоплазмы появлялись зоны повышенной осмиофилии в дендритах, близкие по пиксельному составу митохондрий (рис. 4А). Все это усложняло автоматическую дискриминацию объектов (рис. 4Б) и требовало постоянного вмеша-
тельства специалиста. Происходило статистически значимое изменение структуры гистограммы, отражающей пиксельное содержание цифрового изображения (рис. 5). Если в норме (8 битное изображение) преобладал 133 оттенок серого цвета, то после ишемии - 255 (очень светлые пиксели). Кроме того, происходило уплощение гистограммы. Участок гистограммы, отражающий пиксельный состав митохондрий в норме (оттенки 33219, мода 106) имел более значительную амплитуду разброса (наклон прямой линии), чем аналогичный участок (0-204, мода -77) при ишемии. Поэтому пакетный анализ такого материала становится проблематичным из-за часто встречающегося слияния внешних контуров митохондрий с окружающими структурами нейропиля (рис. 4Б).
А Б
Рис. 4. Верификация митохондрий в постишемическом периоде. А - фрагмент нейропиля слоя III коры большого мозга белой крысы через 7 сут после ишемии. Уранилацетат и цитрат свинца. Б - оверлейная маска исходного изображения нейропия. Ув. 10000.
А Б
Рис. 5. Гистограммы 8-битовых изображений электронограмм нейропиля коры большого мозга в норме (А, белая мышь) и после ишемии (Б, белая крыса). Значительное увеличение содержания светлых пикселей после ишемии (мода 133 и 255)
При морфометрическом исследовании митохондрий в КБМ после ишемии на этапе подсчета количества органелл в поле зрения с помощью плагина «Cell Counter» определяли содержание неизмененных, реактивно и деструктивных митохондрий. Анализ неповрежденных органелл далее проводили с использованием разработанного алгоритма автоматического анализа митохондрий с помощью программы ImageJ 1.46. Для измерения реактивно и деструктивно измененных митохондрий требовалась индивидуальная дополнительная подстройка входных параметров для каждого конкретного поля зрения или применение полностью ручного способа измерения. Это было связано с деструктивными изменениями органелл, которые существенно влияли на их пространственную организацию и тинкториальные свойства матрикса митохондрий.
Таким образом, на первоначальном этапе анализа изображения в постишемическом периоде из всех объектов поля зрения выявлялись те, основная масса которых с очень высокой степенью вероятности верифицировалась как неповрежденные митохондрии. Однако, использованные признаки дискриминации (площадь и кривизна) на фоне ишемических деструктивных изменений ультраструктуры нейропиля не позволяли сделать это в полной мере.
Выводы:
1. Для автоматического анализа митохондрий необходима стандартизация приготовления препаратов, режимов фотосъемки,
ориентации блоков коры большого мозга, исходных порогов и установок программы, а также использование цифровой камеры со сходными характеристиками и размером матрицы.
2. При анализе митохондрий нейропиля в норме существует возможность автоматической стандартной обработки пакета данных (серий полей зрения) по соответствующим макросам.
3. Использованная дискриминационная модель обладает высокой чувствительностью и позволяет правильно идентифицировать 82,5-87,1% объектов в коре большого мозга контрольных животных. При этом увеличивается точность измерений, а время анализа сокращается в 4 раза.
4.Для верификации и морфометрического анализа митохондрий в постишемическом периоде, на фоне выраженных деструктивных и тинкториальных изменений всех составляющих нейропиля, необходима индивидуальная дополнительная подстройка входных параметров (порогов) каждого конкретного поля зрения, а также постоянный контроль специалиста. Поэтому целесообразно сочетанное использование автоматического и ручного способов измерения параметров изучаемого объекта.
Заключение. В настоящее время происходит интенсивное внедрение компьютерного анализа изображений нервной ткани с использованием программы ImageJ в практику морфометрических исследований по различным направлениям. Так, с помощью данной программы проведен морфометрический анализ тел и разветвления отростков нейронов у животных [11] и человека [4]. Получение объективной информации о структурнофункциональном состоянии митохондрий головного мозга экспериментальных животных и человека сопряжено с необходимостью анализа большого объема разнообразных качественных и количественных данных, что существенно увеличивает продолжительность анализа и снижает его точность. Необходима разумная стандартизация и ускорение всех этапов морфологического исследования от взятия материала до конечного заключения. Наиболее реальным в этом плане является ускорение и увеличение точности морфометрической оценки митохондрий с помощью методов автоматизированного компьютерного анализа изображений. Оптимальным инструментом для решения этих задач является бесплатная программа ImageJ 1.46, которая обеспечивает быстрый и качественный анализ графических объектов. Нами проведена адаптация данной программы для анализа митохондрий коры большого мозга мелких лабораторных животных (белая мышь, крыса) и человека в норме и после ишемии.
Литература
1. Автандилов, Г.Г. Основы количественной патологической анатомии / Г.Г. Автандилов.- М.: Медицина.- 2002.- 240 с.
2. Вараксин, А.Н. Статистический анализ биологической и медицинской информации: проблемы и решения / А.Н. Вараксин // Международный журнал медицинской практики.- 2006.-№2.- C.32-34.
3. Корпачев, В.Г. Моделирование клинической смерти и постишемической болезни у крыс / В.Г. Корпачев, С.П. Лысен-ков, Л.З. Тель // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 1982.- №3.- С.78-80.
4. Мыцик, А.В. Актуальные проблемы изучения структурно-функционального состояния нейронов коры большого мозга человека в постишемическом периоде / А.В. Мыцик, С.С. Степанов, П.М. Ларионов, В.А. Акулинин // Журнал анатомии и гистопатологии.- 2012.-Т.1, №1.- C. 37^8.
5. Симчера, В.М. Методы многомерного анализа статистических данных / В.М. Симчера.- М.: Финансы и статистика.-2008.- 400 с.
6. Bertoni—Freddari, C. Reactive structural dynamics of synaptic mitochondria in ischemic delayed neuronal death / C. Bertoni-Freddari, P. Fattoretti, T. Casoli, G. Di Stefano, M. Solazzi, E. Perna, C. De Angelis // Ann N Y Acad Sci.- 2006.-Vol. 1090.- P.26-34.
7. Bertoni-Freddari, C. Synaptic and mitochondrial morphometry provides structural correlates of successful brain aging. / C. Bertoni-Freddari, P. Fattoretti, B. Giorgetti, Y. Grossi, M. Balietti, T. Casol, G. Di Stefano, G. Perretta // Ann N Y Acad Sci.- 2007.-Vol. 1097.- P.51-53.
8. Ferreira, T.A. The ImageJ user guide version 1.43.2010 / T.A. Ferreira, W. Rasband // http:// rsbweb.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf
9. Fiala, J.C. Reconstruct: a free editor for serial section mi-
croscopy / J.C. Fiala // Journal of Microscopy.- 2005.- Vol. 218.- N 1.- P. 52-61.
10. Hirai, K. Mitochondrial abnormalities in Alzheimer's disease / K. Hirai, G. Aliev, A. Nunomura, H. Fujioka, R.L. Russell, C.S. Atwood, A.B. Johnson, Y. Kress, H.V. Vinters, M. Tabaton,
S. Shimohama, A.D. Cash, S.L. Siedlak, P.L. Harris, P.K. Jones, R.B. Petersen, G. Perry, M. A. Smith // J Neurosci.- 2001.- Vol. 21.-N9.- P. 3017-3023.
11. Ho, S-Y. NeurphologyJ: an automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery / S-Y. Ho, C-Y. Cha, H-L. Huang, T.W. Chiu, P. Charoenkwan, E. Hwang // BMC Bioinformatics.- 2011.- Vol.12.- P. 1-18.
12. Madhavi, C. Morphometry of mitochondria in the choroidal ependyma of hydrocephalic guineapigs / C. Madhavi, M. Jacob // Indian J Med Res.- 1992.- Vol. 96.- P. 72-77.
MITOCHONDRIAL MORPHOLOGY AUTOMATIC-MAKING MORPHOMETRICESTIMATION IN NEOCORTEX OF EXPERIMENTAL ANIMALS AND HUMAN IN NORMAL AND DURING POSTISCHEMIC PERIOD
S.S. STEPANOV, P.V. BELICHENKO, A.V. MYTSIK, V.A. AKULININ
Omsk state medical academy, University of California, San Diego, USA
Features and problems of reception of the objective information on a mitochondria structurally functional condition in neuropil of neocortex various layers of experimental animals (white mice, rats) and human in normal and during postischemic period was considered. The way of the automated computer analysis of the images, based on use of program ImageJ 1.46, is offered.
Key words: mitochondria, morphometry, the automatic analysis of images.
УДК 616.24-073.96+167/168.001.8+519.8/71
МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРОЦЕССОВ В ОРГАНИЗМЕ
А.Е.КОРНЕЕВ*, В.И.РАЗУМОВ**, В.П.СИЗИКОВ***, Н.В.ЮРГЕЛЬ****
Предложен развитый до ДИС-технологии на базе теории динамических информационных систем подход к моделированию и анализу процессов в живом организме. Приведены основные результаты по режимам функционирования в живом организме и примеры их интерпретаций, впервые дающие обоснование серии известных из практики медико-биологических закономерностей в живом организме и качественно новые подходы к работе с ними. Это также открывает возможности для учёта влияния подключаемых к живому организму искусственных систем и организации смысловых аспектов структурирования в живом организме.
Ключевые слова: процессы в живом организме, медико-
биологическиезакономерности.
Живой организм (ЖО), находящийся в естественной среде обитания, немыслим без протекающих в нём активных процессов. Любой процесс в ЖО является прямым следствием взаимодействия его элементов: от частей клеток до Земли в целом. Главным в понимании ЖО является не «замороженное» во времени его состояние, а работа органов, функционирование ЖО в единой цепи причинно-следственных связей. Тогда решающее значение имеет не просто факт наличия но и сам режим функционирования.
Однако современные представления о процессах оказываются весьма скудными и далеко не адекватными. Первичным элементом таких представлений обычно является понятие «замороженного» во времени, т.е. одномоментного состояния. Так что и управление процессом ограничивается изменением лишь отдельно взятого его состояния. В частности, для большинства процессов характерны квазигиперболические распределения [1], к которым традиционные технологии исследований не обеспечивают доступа.
В работе [2] использовались элементы теории динамических информационных систем (ДИС, ТДИС) [3] и одновременно приводились обоснования, что потенциальные возможности у ТДИС по моделированию и изучению процессов не уступают
* 644074, Омск; ул. 70 лет Октября, 18. тел. 89139733933; e-mail: [email protected]
** 644077, Омск, пр. Мира, 55А, ОмГУ; тел. 89136062239; e-mail: [email protected]
*** 644046, Омск, пр. Маркса, 35, ОмГУПС; тел. 83812504167; e-mail: [email protected]
**** 644099, Омск, ул. Ленина, 15, Комитет по фармацевтической деятельности и производству лекарств.
