Возможности морфометрической характеристики синапсов неокортекса человека при иммуногистохимической верификации

Мыцик Алексей Владимирович; Акулинин Виктор Александрович; Степанов Сергей Степанович; Ларионов Петр Михайлович

Виноградов Константин Анатольевич - заведующий кафедрой медицинской кибернетики, доктор медицинских наук, профессор, тел. (391) 220 03 89, e-mail: vinogradov16@yandex.ru; Наркевич Анна Александровна - ассистент кафедры туберкулеза с курсом ПО, тел. (391) 261 76 82, e-mail: kras-kaftuber@mail.ru.

ВОЗМОЖНОСТИ МОРФОМЕТРИЧЕСКОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ СИНАПСОВ НЕОКОРТЕКСА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ

Алексей Владимирович Мыцик1, Виктор Александрович Акулинин1,

Сергей Степанович Степанов1, Петр Михайлович Ларионов2 ('Омская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. А.И. Новиков, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии, зав. - д.м.н., проф. В.А. Акулинин; ^Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, директор - д.м.н., проф. М.А. Садовой, лаборатория молекулярногенетических и морфологических методов исследований, зав. - д.м.н., проф. П.М. Ларионов)

Резюме. Изучены возможности оценки структурно-функционального состояния синапсов неокортекса человека (n=5) с помощью комплексного использования иммунофлуоресцентной верификации синаптофизина и мор-фометрии. Установлено, что при использовании иммуногистохимических методов выявления синапсов и флуоресцентной микроскопии удается достаточно точно охарактеризовать только общую площадь маркированных частиц в единице поля зрения. Реальную численную плотность синапсов (в силу ограничения разрешающей способности флуоресцентного микроскопа) можно определить только при ультраструктурном исследовании. Обсуждаются проблемы получения объективной информации о структурно-функциональном состоянии синапсов неокортекса при использовании иммунофлуоресцентных методов и автоматизированного компьютерного анализа изображений с помощью программы ImageJ 1.46.

Ключевые слова: человек, неокортекс, синапсы, синаптофизин, иммунофлуоресценция, морфометрия, автоматизированный компьютерный анализ.

CAPABILITIES OF MORPHOMETRYС CHARACTERISTIC OF THE HUMAN NEOCORTEX SYNAPSES IN IMMUNOHISTOCHEMICAL VERIFICATION

A.V Mytsik1, V.A. Akulinin1, S.S. Stepanov1, P.M. Larionov2

('Omsk State Medical Academy, Russia; ^Novosibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopaedics, Russia)

Summary. Possibilities of an estimation of a structural-functional condition of human neocortex synapses (n=5) by means of complex use of immunofluorescent verifications of the synaptophysin and morphometry have been studied. It has been established, that in the use of immunohistochemical methods of revealing synapses and fluorescent microscopy it is possible to characterise precisely only a total area of the marked particles in the unit of a field of vision. The real numerical synaptic density (owing to restriction of resolution of a fluorescent microscope) can be defined only in ultrastructural research. There have been discussed the problems of obtaining the objective information of a synapses structural-functional condition in the use of immunofluorescent methods and the automated computer analysis of images by means of program ImageJ 1.46.

Key words: human, neocortex, synapses, synaptophysin, immunofluorescence, morphometry, automated computer analysis. ___________________________________________________________________________________________________

Необходимость исследования структурнофункционального состояния межнейронных синапсов неокортекса человека обусловлена стремлением выявления закономерностей реорганизации межнейронных отношений и поиском средств регуляции деструктивных и компенсаторно-восстановительных процессов, лежащих в ее основе [5,8].

При иммуногистохимических исследованиях синапсов наиболее стабильные результаты получены при использовании первичных антител к синаптофизину, который является интегральным мембранным белком синаптических пузырьков. Поэтому иммуногистохи-мическое выявление синаптофизина с помощью специфических моно- и поликлональных антител широко используется для изучения синапсов в нервной системе [3,4,6,9-13].

Цель работы: исследование структурно-

функционального состояния межнейронных синапсов неокортекса человека.

Материалы и методы

Работа выполнена на базе Омской государственной медицинской академии и Department of Anatomy and Cell Biology (Goteborg University, Medicinaregatan 3-5, Goteborg S-41390, Sweden). Материал для гистологического исследования забирался в Омском областном бюро судебно-медицинской экспертизы. Данное иссле-

дование одобрено этическим комитетом Омской государственной медицинской академии.

Для исследования использовался аутопсийный материал (5-10 ч после смерти) из поля 10 (по Бродману) лобной коры большого мозга (ЛКБМ) погибших в результате несчастных случаев (n=5).

Мозг фиксировали в 4% растворе параформа на 0,1М фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) при температуре +4оС (в течение 1 сут.) и заключали в парафин. Изготавливали серийные фронтальные срезы толщиной 10 мкм через все слои коры большого мозга, помещали их на предметные стекла. Для иммунофлуоресцентного исследования использовали первичные кроличьи поликлональные антитела (ImG) к синаптофизину, synaptophysin, p-38, (Rabbit Anti-Human Synaptophysin Polyclonal Antibody; Spring Bioscience, Pleasanton, USA, № Е2174), разведение 1:300. Для визуализации иммунной реакции были использованы козлиные поликлональные вторичные антитела к иммуноглобулину кролика (Goat polyclonal Secondary Antibody to Rabbit IgG - H&L (TR) № ab6719; Abcam, Cambridge, England), разведение 1:200. Антитела ассоциированы с флюоресцентным красителем Texas Red' Sulfonyl Chloride (молекулярная масса 625 дальтон). Данное вещество имеет длину волны поглощения 596 нм и длину волны испускания 620 нм, свечение выглядит красным. Вторичные антитела были экспонированы 20 мин на качающейся поверхности при комнатной температуре, затем слайды были промыты 0,05% фос-

фатным буфером.

Иммуногистохимические препараты просматривались на BioRad MRC 600 конфокальном лазерном сканирующем микроскопе, присоединенном к флюоресцентному микроскопу Nikon FXA. Использовался аргоно-криптоновый лазер с фильтром для FITS (488 DF 10) и липофусцина (568 DF 10). Применялась двухканальная флюоресценция (увеличение линзы - х20 (объектив Nikon; Fluor 1.30), шаг просмотра срезов - 2 мкм, увеличение поля - 3, средняя плотность - 1, режим быстрого просмотра, 10 просмотров каждого среза с помощью фильтров Kalman с коэффициентом 3 и размером блока 1/4, сохранение в памяти компьютера). Область сканирования составляла 188x125 мкм, при этом размер пикселя (единица сканирования) был равен 0,49x0,49 мкм, а область просмотра составляла 384x256 пикселей. Иммунофлюоресценция и липофусциновая флюоресценция сначала проводилась с использованием фильтра 488 DF 10 через первый канал (зеленый) с получением изображения 5-10-ти Z-серийных участков, затем эту же область исследовали на липофусцин с фильтром 568 DF 10 через второй канал (красный). Формировались графические файлы (XXX.PIC), а затем на них с помощью программы ImageJ 1.46 анализировались изображение меченых синапсов.

Проверку статистических гипотез проводили при помощи программы STATISTICA 8.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова (для парного сравнения) и ANOVA Краскела-Уоллиса (для множественного сравнения). В каждом сравниваемом случае количество измерений и полей зрения клеток определялось требованиями выявления статистической значимости при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования иммуногистохимических препаратов слоя III ЛКБМ было установлено, что флуоресцентная метка на синаптофизин маркировала множество разнообразных мелких и крупных структур на теле нейронов и в нейропиле. При этом преобладали нейроны с интенсивным непрерывным свечением синаптофизин-позитивного материала на всей поверхности клетки.

Рис. 1. 8-битное изображение синаптофизин-позитивных структур слоя III лобной коры большого мозга в поле зрения микроскопа (23500 мкм2). Большое количество нейрон-ассоциированной флуоресцирующей метки на телах нейронов (стрелки). Иммунофлуоресценция. Об. х20.

Существенно то, что нейропиль неокортекса содержал многочисленные четкие гранулы продукта иммуноги-стохимической реакции и на препаратах практически отсутствовали синаптофизин-негативные нейроны. Метки на синаптофизин располагались неравномерно, компактно в виде гранул без диффузии флуоресцирующего вещества в окружающее пространство нейропиля (рис. 1).

Таким образом, все вышесказанное свидетельствовало о том, что на аутопсийном материале неокортекса человека отчетливо верифицируются синаптофизин-позитивные структуры, которые могут быть подвергнуты морфометрическому анализу. Для этой цели нами использовалась программа Іша§еІ 1.46, специально адаптированная для анализа графических изображений.

На флуоресцентном микроскопе область просмотра составляла 188x125 мкм (384x256 пикселей), размер пикселя (единица сканирования, разрешающая способность матрицы) был равен 0,49x0,49 мкм, что было несколько меньше разрешающей способности оптического микроскопа (около 0,20 мкм).

Для увеличения степени детализации при работе с изображениями в программе Іша§еІ 1.46 мы целенаправленно уменьшили размер пикселя на полученных цифровых изображениях до 0,049x0,049=0,002 мкм2. В результате анализируемое на препарате поле зрения (188х125=23500 мкм2) составило 3840х2560=9830400 пикселей на изображение 32,1х21,4 см (118,1 пикселей на 1 см, конечное увеличение х1700).

Морфометрический анализ флуоресцентных изображений (8-битовые) мы проводили после их превраще-

Рис. 2. Маска 8-битового изображения поля зрения (23500 мкм2) слоя III коры большого мозга человека (А), созданная программой 1шаде1 1.46 (оригинал на рис. 1); Б, В - увеличенные фрагменты изображения. Стрелками отмечены самые мелкие частицы.

ния (Threshold) в маски (рис. 2А). При автоматическом анализе частиц (Analyze Particles) на масках их размер и форма не лимитировались. Это позволило отразить на масках все, даже очень мелкие частицы реального изображения (рис. 2Б, В). Минимальный размер выявленной частицы на изображении был равен 1 пикселю (0,049х0,049 мкм - на реальном препарате).

Маска представленного для иллюстрации реального изображения (поле зрения 23500 мкм2) содержала 230 частиц различных размеров и формы, отражающих имеющийся в конкретном срезе синаптофизин-позитивный флуоресцирующий материал (рис. 2А).

Мелкие частицы по форме приближались, как правило, к эллипсу или кругу (рис. 2Б, В), а крупные частицы имели сложную форму конгломератов и, судя по контурам, состояли из округлых мелких частиц (рис. 2А).

Площадь частиц на рис. 2А варьировала от 0,0024 мкм2 (один пиксель) до 89,6 мкм2 (37328 пикселей) (рис. 3). Пики гистограммы (n=11), превышающие на изображении 10000 пикселей (24 мкм2) принадлежали конгломератам аксосоматических синапсов различных нейронов ЛКБМ.

пуляции мелких синапсов, группы 2 - простых синапсов средних размеров, группы 3 - гипертрофированных синапсов или сложных синаптических устройств, группы 4 - конгломератов синапсов на крупных дендритах, группы 5 - конгломератов синапсов на телах нейронов.

Таблица 1

Результаты морфометрического анализа иммуногистохимических препаратов (п=50) слоя III лобной коры большого мозга человека (п=5) в норме

Показатель Размер частиц, мкм2

до 1,4 1,6-4,8 5,5-10,8 10,9-24,0 более 24,2

Численная плотность частиц (на 23500 мкм2) 95+14 76+11* 33+4* 14+3* 11+4

Средняя площадь, мкм2 0,6+0,1 3,1±0,5* 6,9±0,8* 16,4+4,2* 53,9+9,5*

Средний диаметр, мкм 0,8±0,2 1,9±0,7* 2,9±0,5* 4,6±1,1* 8,3±1,4*

Форма Круг Круг Круг, овал Овал, ГО ГО

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с предыдущей группой частиц; ГО - гроздевидное образование. Материал представлен как медиана ± среднее квадратич-

ное отклонение.

Рис. 3. Гистограмма распределения 230 частиц синаптофизин-позитивного материала в слое III лобной коры большого мозга по площади проекций на изображение.

После морфометрического анализа на маске анализируемого поля зрения четко выявлялось 5 групп (кластеров) частиц: 1) до 600 пикселей (до 1,4 мкм2); 2) 6502000 пикселей (1,6-4,8 мкм2); 3) 2100-4500 пикселей (5,010,8 мкм2); 4) 4510-10000 пикселей (10,8 до 24,0 мкм2) и 5) более 10100 пикселей (24,2-89,6 мкм2) (п=11). Самыми большими по количеству частиц были группа 1 (п=98) и 2 (п=74), меньше частиц было в группе 3 (п=33) и существенно меньше в группе 4 (п=14) и 5 (п=11).

Все частицы занимали 5,84% (1373 мкм2) площади поля зрения (23500 мкм2). При этом частицы группы 1 занимали 0,23%, группы 2 - 0,96%, группы 3 - 0,98%, группы 4 - 1,9% и группы 5 - 2,64% площади поля зрения. Среди всех маркированных частиц площадь мелких частиц группы 1 составила 3,9%, группы 2 - 16,4%, группы 3 - 16,8%, группы 4 - 17,6% и группы 5 - 45,3%.

Таким образом, синаптофизин-позитивный материал аксосоматических синапсов занимал 45,3% площади всех выявленных частиц. Все остальные синапсы аксо-шипиковые и аксодендритные синапсы нейропиля составили 54,7%.

Четкое разделение всех синаптофизин-позитивных частиц на пять групп позволяет предположить, что представители этих групп принадлежали разным типам синаптических устройств. Площадь частиц группы 1 отражала структурно-функциональное состояние по-

Общая численная плотность дискретных синаптофизин-позитивных частиц составила 1,0 на 100 мкм2 плоскости среза слоя III. Это существенно меньше, чем реальная плотность синапсов, выявленная нами в этом слое при электронномикроскопическом исследовании неокортекса человека (15-18 на 100 мкм2) [2]. Последнее свидетельствует о том, что большая часть синапсов при иммунофлуоресцентном исследовании выявляется в составе конгломератов. С учетом того, что средняя площадь терминали около 0,5 мкм2, общая численная плотность синапсов на рис. 1 составляла, вероятно, около 12 на 100 мкм2, что сопоставимо с данными ультраструктурного исследования [2].

Морфометрическая характеристика синаптофизин-позитивного материала в слое III ЛКБМ всех включенных в исследование пациентов представлена в таблице (табл. 1).

Данные таблицы подтверждают общие закономерности распределения синаптофизин-позитивных частиц в слое III, полученные при анализе рис. 1. Исходя из этого, можно с высокой долей вероятности дискриминировать частицы маски изображения по реальным структурам неокортекса. Ассоциированные с нейронами крупные частицы с высокой степенью вероятности являются конгломератом флуоресцирующих синаптофизин-позитивных аксосоматических синапсов. Более мелкие одиночные частицы, которые являлись в основном маской аксошипиковых и аксодендритных синапсов, занимали 40-70% (95% доверительный интервал) площади поля зрения и располагались в нейропиле.

Таким образом, при иммунофлуоресцентном исследовании можно получить информацию о расположении, распределении и площади всех синаптофизин-позитивных терминалей синапсов, а общую численную плотность синапсов точно определить нельзя. Это связано с низкой разрешающей способностью флюоресцентных микроскопов, а также со слиянием изображений соседних святящихся частиц в однородные конгломераты. В результате численная плотность маркированных частиц на маске изображения в 10-15 раз меньше, чем реальная плотность синаптических терминалей в конкретной нервной ткани. Однако определение численной плотности синапсов возможно на масках отдельных участков нейропиля, содержащих только простые мелкие или не очень крупные сложные конгломераты частиц. Последнее облегчается с использованием программы ImageJ 1.46, которая позволяет разделять присутствующие сложные фигуры на составляющие с помощью плагина «Watershed».

В данной работе проведен анализ большого количества флуоресцирующих объектов, точное морфометрическое исследование которых стало возможным только с использованием многофункциональной программы ImageJ 1.46. В настоящее время происходит интенсивное внедрение компьютерного анализа изображений нерв-

ной ткани с использованием данной программы в практику морфометрических исследований [1,7]. Программа обеспечивает быстрый и качественный анализ сложных графических объектов, а, по нашим данным, позволяет очень хорошо дискриминировать синаптофизин-позитивные структуры любых размеров и формы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мыцик А.В., Степанов С.С., Ларионов П.М., Акулинин В.А. Актуальные проблемы изучения структурнофункционального состояния нейронов коры большого мозга человека в постишемическом периоде // Журнал анатомии и гистопатологии. - 2012. - Т. 1. № 1. - C.37-48.

2. Семченко В.В., Степанов С.С., Боголепов Н.Н. Синаптическая пластичность головного мозга (фундаментальные и прикладные аспекты). - Омск, 2008. - 408 с.

3. Хренов Ф.И., Беличенко П.В., Шамакина И.Ю. Количественный анализ синаптофизина (р38) в мозге потомства второго поколения от самцов крыс с длительной морфинной интоксикацией // Бюллетень экспер. биол. и мед.

- 2000. - Т. 129. №1. - С.50-52.

4. Downes E.G., Robson J., Grailly E., et al. Loss of synaptophisin and synaptosomal-associated protein 25-kDa (SNAP-25) in elderly Down syndrome individuals // Neuropathol. Appl. Neurobiol. -2008. - Vol. 34. №1. - P. 12-22.

5. Fiala J.C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy // Journal of Microscopy. - 2005. - Vol. 218. №1. -P.52-61.

6. Glantz L.A., Gilmore J.H., Hamer R.M., et al. Synaptophisin and postsynaptoptic density protein 95 in the human prefrontal cortex from mid-gestation into early adulthood // Neurosci. -2007. - Vol. 149. №3. - P.582-591.

Полученные результаты необходимо учитывать при анализе состояния межнейронных синаптических взаимоотношений в коре большого мозга человека при различных сравнительных исследованиях, базирующихся на иммуногистохимических методах верификации структур нервной ткани.

7. Ho S-Y., Chao C-Y., Huang H-L., et al. NeurphologyJ: An automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery // BMC Bioinformatics.

- 2011. - Vol. 12. - P.1-18.

8. Manto M., Oulad ben Taib N., Luft A.R. Modulation of excitability as an early change leading to structural adaptation in the motor cortex // J Neurosci Res. - 2006. - Vol. 83. №2. - P. 177180.

9. Millerot-Serrurot E., Chausset A., Mossiat С., et al. Effect of early decrease in the lesion size on late brain tissue loss, synaptophisin expression and functionality after a focal brain lesion in rats // Neurochem. Int. - 2007. - Vol. 50. №2. - P.328-335.

10. Nag T.S., Wadhwa S. Differential expression of syntaxin-1 and synaptophysin in the developing and adult human retina // J. Biosci. - 2001. - Vol. 26. №2. - P.179-191.

11. Roudenok V., Kuhnel W. The development of synaptophysin immunoreactivity in the human sympathetic ganglia // Ann. Anat. - 2001. - Vol. 183. №4. - P.345-351.

12. Shimada A., Keino H., Satoh M., et al. Age-related loss of synapses in the frontal cortex of SAMP10 mouse: a model of cerebral degeneration // Synapse. - 2003. - Vol. 48. №4. - P.198-204.

13. Wiedenmann В., Franke W.W. Identification and localization of synaptophysin, an integral membrane glicoprotein of M 38000 characteristic of presynaptic vesicles // Cell. - 1985. -Vol. 41. - P.1017-1028.

Информация об авторах: Мыцик Алексей Владимирович - ассистент, 644043, г.Омск, ул. Ленина,12, тел. (3812) 239298, факс (3812)230414, e-mail: elysei@mail.ru; Акулинин Виктор Александрович - д.м.н., профессор, заведующий кафедрой, e-mail: akulinin@omsk-osma.ru; Степанов Сергей Степанович - д.м.н., ст.н.с., e-mail: serg_stepanov@mail.ru; Ларионов Пётр Михайлович - д.м.н., профессор, заведующий лабораторией,

630091, г.Новосибирск, ул. Фрунзе, 17, тел. (383) 3633131, e-mail: ptrl@mail.ru

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА МОЛОЧАЯ ФИШЕРА НА РЕПАРАЦИЮ КОЖНОЙ РАНЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Евгения Михайловна Кривошеева1, Елена Викторовна Фефелова2, Ирина Ивановна Бородулина3,

Сергей Тихонович Кохан1, Нина Владимировна Бородулина3 ('Читинский государственный университет, ректор - д.т.н., проф. С.А. Иванов, Институт социальнополитических систем, директор - д.п.н., проф. М.Ю. Швецов, кафедра основ медицины, зав.- к.м.н., доц. С.Т. Кохан; 2Читинская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. А.В. Говорин, кафедра патологической физиологии, зав. - д.м.н., проф. Н.Н. Цыбиков; 3Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, Санкт-Петербург, начальник - д.м.н., проф. А.Н. Бельских, кафедра челюстно-лицевой хирургии

и стоматологии, зав. - д.м.н., проф. Г.И. Прохватилов)

Резюме. Было изучено влияние экстракта молочая Фишера на репарацию кожной раны у мышей. Выявлено, что исследуемый экстракт стимулирует процессы заживления, обладает иммуностимулирующим и антибактериальным эффектом. В условиях гипергомоцистеинемии эффективность экстракта молочая остается высокой.

Ключевые слова: экстракт молочая Фишера, ромазулан, гипергомоцистеинемия, экспериментальная рана у мышей.

INFLUENCE OF EUPHORBIA FISHERIANA STEUDEL EXTRACT ON DERMAL WOUND REPARATION IN EXPERIMENT

E.M. Krivosheeva1, E.V. Fefelova2, I.I. Borodulina3, S.T. Kohan1, N.V. Borodulina3 ('Chita State University; 2Chita State Medical Academy; 3Military Medical Academy, St. Petersburg, Russia )

Summary. Influence of Euphorbia Fischeriana Steudel extract on dermal wound reparation was studied in mice. The extract under study was revealed to have immunostimulating and antibacterial effect and stimulates reparation. In condition of hyperhomocysteinemia efficiensy of the extract stays the same.

Key words: Euphorbia Fischeriana Steudel extract, romasulane, hyperhomocysteinemia, experimental wound in mice.

Одной из самых актуальных и сложных проблем в хирургии является лечение ран. Послеоперационные гнойные осложнения развиваются у 30% пациентов [5,7]. Серьезное влияние на течение раневого процесса оказывают изменение микрофлоры раны и реактив-

ность организма [2,7]. Перспективным направлением в лечении является поиск препаратов, обладающих антисептическим действием, благотворно влияющих на местный иммунитет, ускоряющих заживление.

При деметилировании метионина образуется гомо-

Capabilities of morphometry

Текст научной работы на тему «Возможности морфометрической характеристики синапсов неокортекса человека при иммуногистохимической верификации»