CC BY
42
Эпизоотологический мониторинг, сравнительная диагностика и иммунологический тест при оценке статуса коров в условиях неблагополучия по лейкозу в Оренбуржье
И.С. Пономарева, к.биол.н.; М.В. Сычева, к.биол.н.;
М.А. Поляков, к.вет.н., ст. преподаватель,
Оренбургский ГАУ
В настоящее время лейкоз крупного рогатого скота распространен во всех субъектах РФ. Начиная с 1991 г., эпизоотическая обстановка по лейкозу непрерывно осложняется, а с 1997 г. эта болезнь прочно занимает первое место в структуре инфекционной патологии [1]. Потенциальная возможность управления эпизоотическим процессом при лейкозе крупного рогатого скота заключается в своевременности выявления источника возбудителя инфекции: проведение серологических исследований реакцией иммунодиффузии (РИД) в агаре геля при лейкозе.
Диагностика должна обеспечивать оперативное и полное выявление животных — носителей инфекции и быть при этом простой и эффективной [2]. Формирование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) является обязательным компонентом нормального иммунного ответа. При определенных условиях может иметь место переход нормальной функции ЦИК в патологическую [3]. Выявлено, что повышенная концентрация иммунных комплексов может быть связана с развитием лейкоза крупного рогатого скота [4, 5].
Все вышесказанное и предопределило цель настоящего исследования: провести эпизоотоло-гический мониторинг и диагностику лейкоза, а также изучить уровень циркулирующих иммунных комплексов у животных, инфицированных вирусом лейкоза.
Материалы и методы. Изучены материалы годовых отчетов областного управления ветеринарии с целью мониторинга эпизоотической ситуации за последние 18 лет. Проведен анализ эффективности различных методов диагностики лейкоза: при помощи реакции иммунодиффузии, полимеразной цепной реакции, иммуно-ферментного анализа (РИД, ПЦР, ИФА). Исследования проводились согласно утвержденным методикам с использованием сывороток и стабилизированной крови. Для определения количества циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови здоровых и инфицированных животных использовали скрининговую методику. Авторы — Ю.А. Гриневич и А.Н. Алферов.
Результаты и обсуждение. Согласно данным ветеринарной отчетности за изучаемый период
времени (1991—2008 гг.) было исследовано серологическими методами в 35 районах и городах Оренбургской области 3096963 коров, выявлено 490157 инфицированных животных. За 18 лет произошло увеличение инфицированного поголовья в 3,6 раза. Минимальный процент инфи-цированности отмечен в 1991 г. — 7,4%, в 2006 — 22,0%, в 2008 — 26,7%, в среднем по области — 15,5%, а процент больных коров составил в среднем по области — 1,98%, при вариабельности показателя от 1,36% в 1993 г., до 2,6% — в 2004 г. (рис. 1).
Проведенный корреляционный анализ указывает на наличие прямой положительной корреляционной связи г = +0,99 между количеством инфицированных и больных животных.
При проведении диагностического тестирования животных с помощью серологических, гематологических и молекулярно-биологических методов нами были получены следующие результаты. Исследованием сыворотки крови при помощи РИД в агарозном геле выявлено 13% инфицированных животных, а методом ИФА — 26,7%, т.е. в 2,1 раза больше. Исследование материала реакцией иммунодиффузии и ПЦР показало, что РИД-позитивных животных было в 11,1% меньше, чем при исследовании методом ПЦР. В то же время, применение ПЦР позволило обнаружить вирусоспецифическую последовательность в ДНК лимфоцитов у 37,8% животных.
На рисунке 2 представлена электрофореграм-ма продуктов ПЦР. В дорожках всех исследуемых проб имеется полоса внутреннего контроля на уровне 582 п.н. (ген альфа-актина крупного рогатого скота). В дорожках положительных кон-тролей присутствуют специфические полосы на
-инфицированные животные
-больные коровы
Рис. 1 - Динамика инфицированности и заболеваемости коров в Оренбургской области с 1991 по 2008 гг.
Рис. 2 - Электрофореграмма продуктов ПЦР:
1 - пробы без вирусоспецифической последовательности; 2 - пробы содержат вирусоспецифическую последовательность; 3 - положительный контроль; 4 - отрицательный контроль; 5 - полосы внутреннего контроля
уровне 294 п.н., а в дорожках отрицательных контролей — отсутствуют. Положительными являются образцы, имеющие специфическую светящуюся полосу на уровне 294 п.н. большей или меньшей интенсивности.
Гематологические исследования, основанные на выявлении в единице объема крови лимфоидных клеток различной степени зрелости, позволили установить лимфоцитоз у 16,7% исследуемых коров. А молекулярно-биологическим методом выявлены специфические фрагменты нуклеиновых кислот вируса лейкоза крупного рогатого скота у 61,1% коров, что в 3,66 раза больше. Выявленные несоответствия результатов тестирования объяснимы разрешающей способностью и технической сущностью использованных методов.
Высокая чувствительность, быстрая постановка реакции позволяют считать ИФА современным методом исследования, который можно использовать для выявления вирусоносительства на последних стадиях оздоровления хозяйства. ПЦР позволит существенно сократить сроки оздоровительных противолейкозных мероприятий, поскольку разрешающая способность тест-систем для ПЦР на два и более порядка превосходит микробиологические и иммунологические методы, она аналогична таковой для живых систем
(биопроба на естественно восприимчивых животных).
Анализ результатов по изучению количества ЦИК у инфицированных вирусом лейкоза животных свидетельствует о том, что в максимальном количестве (406 ЕД ОП) ЦИК содержатся в пробах сыворотки крови, полученных от взрослых коров, имеющих резко положительную реакцию при исследовании методом ИФА. Более низким было содержание иммунных комплексов у инфицированных животных в возрасте 16—17 месяцев — 219—271 ЕД ОП, а к 22—24-месячному возрасту у животных уровень ЦИК повышался до 385—393 ЕД ОП. У неинфицированных животных в возрасте 16—17 месяцев уровень ЦИК достигает 332—336 ЕД ОП. Учитывая, что образование нерастворимых иммунных комплексов происходит при строго определенных условиях, можно предположить, что инфицирование вирусом лейкоза крупного рогатого скота приводит к увеличению уровня ЦИК за счет накопления значительного количества иммуноглобулинов в сыворотке крови в результате иммунного ответа. Выводы:
1. Показатели интенсивности эпизоотического процесса находятся в стадии подъема.
2. Процент инфицированности крупного рогатого скота в Оренбургской области увеличился за изучаемый период в 4,4 раза, процент больных — в 1,9 раза.
3. Метод ПЦР следует рекомендовать в качестве диагностического теста для выявления инфицированных животных на ранних стадиях заболевания.
4. У взрослых инфицированных животных отмечается повышение уровня ЦИК.
Литература
1. Мадисон, В. Лейкоз: пустые «страшилки» или общегосударственная проблема? / В. Мадисон, Л. Мадисон // Животноводство России. — 2006. — № 9. — С. 2—6.
2. Димов, С.К. Эпизоотический процесс и противоэпизооти-ческая система / С.К. Димов // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: сб.научн.тр. РАСХН. Сиб. отд-е. — Новосибирск, 1998. - С. 290-296.
3. Первиков, Ю.В. Иммунные комплексы при вирусных инфекциях / Ю.В. Первиков, Л.Б. Эльберт. — М.: Медицина, 1984. — 160 с.
4. Изучение иммунохимического состава циркулирующих иммунных комплексов сыворотки крови при лейкозе крупного рогатого скота / Ю.К. Пешкус, А.Б. Моркунас, П.Б. Садаучкас, В.Й. Тамощунас // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных: Тез.докл. Всесоюз. конф. (Ташкент, 9—11 октября 1984 г.). — Ташкент, 1984. — С. 69—70.
5. Circulating immune complexes in cows with enzootic bovine leucosis / T. Odawara, M.Onuma, H.Yoshikawa et al. // JpnJ.Vet.Sci. — 1987. — Vol. 49. — № 4. — P. 657—661.
