CC BY
28
УДК 581.143
МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА ТРИХОМОВ ИНТАКТНЫХ И IN VITRO РАСТЕНИЙ STEVIA REBAUDIANA BERTONI В СВЯЗИ С ОБРАЗОВАНИЕМ И НАКОПЛЕНИЕМ СТЕВИОЛ-ГЛИКОЗИДОВ
Н.И. Бондарев1, М.А. Суханова1, Г.А. Семенова2, О.В. Горяева, С.Е. Андреева, А.М. Носов
(кафедра физиологии растений; e-mail: [email protected])
С помощью сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии исследована ультраструктура трихомов интактных и in vitro растений стевии. Как на верхней, так и на нижней поверхности листьев обнаружены три типа трихомов: железки округлой формы, а также крупные и мелкие волоски. На поверхности верхних листьев плотность трихомов выше, чем на поверхности нижних листьев, а у растений in vitro ниже, чем у интактных растений. Отмечена положительная корреляция между числом железок на листьях и уровнем содержания в них стевиол-гликозидов (СГ). Были выявлены три основные стадии онтогенеза клеток железки, которые отражают последовательность накопления секрета.
Ключевые слова: трихом, ультраструктура клеток железки, число железок, содержание стевиол-гликозидов.
Как известно, Stevia rebaudiana Bertoni (Astera-ceae) является источником стевиол-гликозидов (СГ) — низкокалорийных высокосладких соединений с уникальными свойствами [1—3]. Основным местом накопления СГ являются листья. В них может накапливаться от 4 до 15% СГ, тогда как в других органах растения (стебли, цветки, семена, корни) значительно меньше [4—8]. Ранее было выяснено, что все надземные части стевии покрыты трихомами [9, 10]. Однако исследования по эпидермальным образованиям стевии единичны и были проведены без использования электронной микроскопии. Некоторые исследователи полагают, что именно в эпи-дермальных образованиях идет синтез и накопление СГ [11, 12]. Однако никаких доказательств этого факта до настоящего времени не приведено.
Таким образом, целью данной работы было исследование ультраструктуры эпидермальных образований стевии с помощью сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии в связи с синтезом и накоплением СГ.
Материалы и методы
Объектами исследования служили интактные и in vitro растения стевии. Подготовку материала для трансмиссионной микроскопии проводили следующим образом. Кусочки листьев фиксировали при 20° в течение 1,2—2 ч в 1,25—2%-м глутаральде-гиде, приготовленном на фосфатном буфере с последующей дофиксацией в 1—2%-м растворе OSO4
или без нее. Затем образцы дегидратировали в растворах этанола восходящей концентрации, после чего контрастировали в 2%-м растворе уранилаце-тата, в 70%-м этаноле в течение 14 ч при 20°. После этого материал вновь обезвоживали в растворах этанола возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне и заключали в эпон. Тонкие срезы с образцов получали на микротоме LKB-III (LKB, Швеция) и ультратоме "Тесла", окрашивали ура-нилацетатом и цитратом свинца по Рейнолдсу [13]. Просмотр и съемку проводили с помощью электронных микроскопов JEM-7A и JEM-100B (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 100 кВ и рабочем увеличении 5000—20 000.
Образцы для сканирующей микроскопии дегидратировали в растворах этанола восходящей концентрации, вплоть до абсолютного. Затем образцы лиофильно высушивали и приклеивали на столик, на который было проведено напыление тонкого слоя платины. Просмотр и съемку проводили на сканирующем электронном микроскопе H-600 ("Hitachi") при ускоряющем напряжении 20 кВ и рабочем увеличении 30—2000.
Результаты и обсуждение
Эпидермис листьев стевии состоит из изодиа-метрических клеток, покрытых тонким слоем кутикулы. Клетки верхнего эпидермиса несколько крупнее и очертания их менее извилисты, чем у клеток нижнего эпидермиса. Устьица аномоцитного типа формируются на верхней и нижней сторонах лис-
1 Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276, г. Москва.
2 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., г. Пущино.
та, но на нижней стороне их значительно больше. Они располагаются равномерно или небольшими скоплениями. На поверхности листа нами были обнаружены три типа эпидермальных образований (рис. 1, а, б).
1. Крупные волоски. Волоски имеют коническую форму, прямые или изогнутые, состоят из 7—10 клеток. Их длина составляет у интактных растений 300—500 мкм, у in vitro растений — 120—150 мкм.
2. Мелкие волоски. Они более короткие и тонкие по сравнению с крупными волосками, состоят из 5—6 клеток. Длина мелких волосков колеблется от 80 до 150 мкм у интактных и от 60 до 80 мкм у in vitro растений.
3. Железки. Они имеют округлую форму и располагаются в углублениях листовой поверхности. Диаметр железок у интактных растений составляет 50—60 мкм, у in vitro растений — 40—50 мкм.
Рис. 1. Три типа трихом на поверхности листьев S. rebaudiana: а — интактное растение; б — растение in vitro. КВ — крупный волосок, МВ — мелкий волосок, Ж — железка. Масштабная линейка — 50 мкм
Рис. 2. Адаксиальная (а ) и абаксиальная (б) сторона листовой пластинки S. rebaudiana. Масштабная линейка — 100 мкм
У растений in vitro (рис. 1, б) число железок примерно в 1,5—2 раза меньше, чем у интактных растений. Это положительно коррелирует с содержанием СГ в листьях растений in vitro [7, 14].
Все три типа трихомов обнаружены как на адаксиальной (рис. 2, а), так и на абаксиальной (рис. 2, б) поверхности листьев. На поверхности молодых верхних листьев железок и волосков больше, чем на поверхности нижних стареющих листьев. Ранее нами было установлено, что в верхних листьях содержание СГ в 1,5—2 раза выше, чем в нижних [8], т.е. и в этом случае наблюдали положительную корреляцию между плотностью железок и содержанием СГ.
Апикальная часть железки, выступающая на поверхности листа, состоит из двухрядно располо-
Рис. 3. Зрелая железка с заполненной субкутикулярной полостью на поверхности листа геЬаыШапа. Масштабная линейка — 10 мкм
женных клеток. В этой части железки имеется суб-кутикулярная полость, которая может заполняться секретом (рис. 3).
Ранее бышо отмечено [12], что чем южнее находился район возделывания, тем большее число трихом и железок образуется на листе. При этом в листьях накапливалось большее количество СГ [12, 15]. Следовательно, согласно полученным в нашей работе результатам и данным литературы, существует положительная корреляция между количеством железок на листьях и уровнем содержания в них СГ. Отсюда можно сделать предположение о роли этих структур в образовании и накоплении СГ. Железки, расположенные на поверхности репродуктивных органов, несколько отличаются от подобных образований на поверхности листьев. Так, последние более крупные и находятся в углублениях.
Для того чтобы попытаться ответить на вопрос о локализации процессов биосинтеза и накопления СГ, мы провели исследование ультраструктуры клеток железок с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. На рис. 4 изображена продольно разрезанная железка, находящаяся в фазе созревания.
Железки состоят, как правило, из восьми двухрядно расположенных клеток (рис. 4, а, б). Размеры клеток в апикальной части железки несколько больше, чем в базальной. Ультраструктура клеток железки, начиная с ее базальной части и заканчивая апикальной, сильно меняется. Поэтому клетки железки можно условно разделить на три группы. К первой группе относятся клетки с типичной ультраструктурой и активным метаболизмом. Они находятся в базальной части железки. Ко второй группе принадлежат клетки на начальных ступенях деструкции и соответственно со сниженной функциональной активностью. Эти клетки распо-
Рис. 4. Ультраструктура клеток железки 5. геЬаыШапа. а — фиксация в глутаральдегиде с последующим осмированием; б — фиксация в глутаральдегиде без осмирования. В — вакуоль, К — кутикула, КС — клеточная стенка, ОВ — осмиофильное включение, СП — субкутикулярная полость, Хл — хлоропласт, Я — ядро. Масштабная линейка — 1 мкм
лагаются в средней части железки. К третьей груп- осмиофильным содержимым, в то время как копе относятся практически полностью деструкту- роткий 8-часовой день (как и переход к фазе сек-рированные клетки. Они находятся в апикальной реции при непрерывном освещении) способствует части железки (рис. 4, а). Активно функциониру- развитию агранулярного эндоплазматического реющие клетки содержат крупное ядро, пластидный тикулума, в котором осуществляется синтез стеро-аппарат, митохондрии и другие органеллы. Для них идов, а также исчезновению осмиофильного со-характерна плотная цитоплазма с небольшими ва- держимого из пластид и появлению центральных куолями округлой и вытянутой формы и электрон- вакуолей с электронно-плотным содержимым. При но-плотными включениями. Они похожи на липид- этом выход эфирного масла при непрерывном осве-ные капли, но отличаются от них зернистой струк- щении был почти на порядок выше, чем на ко-турой. Вероятно, в этих включениях содержится ротком дне [20]. Осмиофильное вещество, содер-какой-либо из предшественников биосинтеза ди- жащееся в тилакоидах пластид стевии, не является терпеноидов, о чем мы сообщали ранее [16, 17]. тождественным по химическому составу содержи-То, что дитерпеноиды могут содержаться в желези- мому пластоглобул. Это подтверждается следующим стых трихомах растений, отмечено у представите- наблюдением. При фиксации листьев стевии лишь лей различных семейств, например у Plectranthus в глутаральдегиде без осмирования на месте плас-madagascariensis (Lamiaceae) [18] и Nicotiana taba- тоглобул остается пустое пространство в результа-cum (Solanaceae) [19]. В пристеночном слое ци- те экстракции их содержимого, в то время как со-топлазмы накапливаются осмиофильные мелкозер- держимое тилакоидов и без осмирования остается нистые включения. Пластиды, представленные в электронно-плотным (рис. 5). Помимо этого в ци-основном хлоропластами различного размера, ли- топлазме и при таком способе фиксации (без ос-шены наружной мембраны и содержат большое мирования) видны осмиофильные включения нечисло осмиофильных пластоглобул. Строма пластид правильной формы, что позволяет их отличить от электронно-плотная. В тилакоидах гран и стромы липидных капель (рис. 4, б). В клетках, где час-обнаружено накопление осмиофильных веществ. Дан- тично начался процесс деструкции, органеллы при-ные характеристики свидетельствуют об активных жаты к клеточной стенке, а значительный объем метаболических процессах, протекающих в пласти- клетки занят несколькими крупными вакуолями. дах и, вероятно, связанных с синтезом терпено- Деструктурированные клетки лишены органелл и идов, так как число тилакоидов с электронно-плот- почти полностью заполнены огромной вакуолью. ным содержимым возрастает при усиленной веге- Очевидно, три типа клеток демонстрируют после-тации одновременно с увеличением содержания довательность накопления секрета в железках, ко-СГ [14]. Подобная особенность была отмечена ра- торый, возможно, представляет собой смесь дитер-нее для Perilla ocymoides L., Lamiaceae [20]. Эти ис- пеновых гликозидов, хорошо растворимых в воде. следователи обнаружили, что при непрерывном Секрет выделяется из клеток апикальной части и освещении пластиды клеток железки переполнены скапливается под кутикулой, которая при этом
отделяется от клеточных стенок в 2—3 местах, а затем образуется субкутикулярная полость сферической формы с небольшой перетяжкой посередине (рис. 3, 4). Суб-кутикулярная полость образуется за счет разделения клеточной стенки, небольшая часть которой отделяется вместе с кутикулой. Кутикула на поверхности железок имеет разную толщину и структуру. Апикальные клетки покрыты кутикулой, толщина которой в несколько раз больше относительно тонкой клеточной стенки, причем кутикула имеет выраженную дву-слойность: тонкий светлый наружный слой и более толстый темный внутренний слой. Базальные клетки покрывает тонкий светлый кутикулярный слой, но клеточная стенка этих клеток в 2—3 раза
Рис. 5. Ультраструктура хлоропласта геЬаыШапа. Пг — пластоглобула (без содержимого), Тл — тилакоид. Масштабная линейка — 0,1 мкм
толще, чем у апикальных (рис. 4, а). Такая прочная кутикула обеспечивает целостность субкути-кулярной полости и накопление в нем секрета. Однако иногда может происходить повреждение кутикулы и вытекание секрета из такой полости (рис. 1, б). Разрывы кутикулы и утечку содержимого железистых трихом наблюдали также и другие исследователи у некоторых видов семейства Аз1ега-сеае [21]. Встречаются также железки с незаполненными субкутикулярными полостями, хотя кутикула не несет видимых повреждений и вытекания содержимого не наблюдается. У только что сформированных железок верхних молодых листочков ультраструктура клеток железок максимально развита, а затем количество цитоплазмы и органелл постепенно уменьшается, клетки вакуолизируются. Как известно, степень сложности ультраструктурной организации терпеноидогенных клеток коррелирует с интенсивностью процессов синтеза и транспорта секрета [22]. Это согласуется с данными хроматографического анализа о более высоком содержании дитерпеновых СГ в молодых верхних листьях [8].
Заключение
Таким образом, все три типа эпидермальных образований обнаружены как на верхней, так и на нижней поверхности листьев. На поверхности молодых верхних листьев железок и волосков больше, чем на поверхности нижних стареющих листьев. У растений in vitro число железок и трихомов на листьях примерно в два раза меньше, чем у интакт-ных растений. Во всех случаях между количеством железок на листьях и уровнем содержания в них СГ отмечали положительную корреляцию. Железки состоят из клеток, находящихся на разных стадиях онтогенеза: живых клеток с активным метаболизмом, клеток на начальных ступенях деструкции и полностью деструктурированных клеток. Вероятно, что три типа клеток демонстрируют последовательность накопления секрета в железках. Интенсивность процессов синтеза и транспорта секрета определяется степенью сложности ультраструктурной организации терпеноидогенных клеток и активностью метаболических процессов, происходящих в них, что согласуется с данными о содержании СГ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kinghorn, A.D, Soejarto, D.D. Sweetening agents of plant origin // Critical Rev. in Plant Sciences. 1986. Vol. 4. N 2. P. 79-120.
2. Lyakhovkin A.G., Long T.D., Titov D.A., Anh M.P. Cultivation and Utilization of Stevia (Stevia rebaudiana Bertoni). Hanoi: Agricult. Pub. House, 1993. 44 p.
3. Matsui M., Matsui K., Kawasaki Y, Oda Y., Nogu-chi T., Kitagawa Y., Sawada M., Hayashi M, Nohmi T., Yoshihira K., Ishidate M., Sofuni T. Evaluation the genito-xicity of stevioside and steviol using six in vitro and one in vivo mutagenicity assays // Mutagenesis. 1996. Vol. 11. N 6. P. 573-579.
4. Zaidan L.B.P., Dietrich S.M.C., Felippe G.M. Effect of photoperiod on flowering and stevioside content in plants of Stevia rebaudiana Bertoni // Jap. J. of Crop Science. 1980. Vol. 49. P. 569-574.
5. Hsing Y., Su W, Chang W. Accumulation of stevio-side and rebaudioside A in callus cultures of Stevia rebadiana Bertoni // Bot. Bull. Acad. Sin. 1983. Vol. 24. P. 115-119.
6. Darise M., Kohda H., Mizutani K., Kasai R., Tana-ka O. Chemical constituents of flowers of Stevia rebaudiana Bertoni // Agric. Biol. Chem. 1983. Vol. 47. P. 133-135.
7. Bondarev N., Reshetnyak O., Nosov A. Peculiarities of diterpenoid steviol glycoside production in in vitro cultures of Stevia rebaudiana Bertoni // Plant Science. 2001. Vol. 161 (1). P. 155-163.
8. Bondarev N., Sukhanova M.A., Reshetnyak O., No-sov A. Steviol glycoside content in different organs of Stevia rebaudiana Bertoni and its dynamics during ontogenesis // Biol. Plant. 2004. Vol. 47. N 2. P. 261-264.
9. Hohmann B. Botanisch-warenkudliche Diognostik von Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl., einer supstoffliefernden Pflanze // Deutsche Lebensmittel-Rundschau. 1978. Bd. 74. N 8. P. 296-299.
10. Шафферт Е, Чеботарь А., Новикова В. Морфо-анатомическая характеристика стевии [Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl.] в связи с интродукцией на Южном берегу Крыма // Цитолого-эмбриологические исследования высших растений: Тр. Никитского бот. сада. Т. 113. Ялта, 1992. С. 25-37.
11. Денисова Г.А. Терпеносодержащие структуры растений. Л.: Наука, 1989. 141 с.
12. Дзюба О.О. Стевия — Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley. Интродукция, морфология, биология, возделывание: Автреф. дис. ... канд. биол. наук. СПб.: ВНИИ им. Н.И. Вавилова, 1999. 15 с.
13. Reynolds E.C. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. Vol. 17. P. 208—212.
14. Bondarev N.I., Reshetnyak O.V., Nosov A.M. Features of development of Stevia rebaudiana shoots cultivated in the roller bioreactor and their production of steviol glycoside // Planta Medica. 2002. Vol. 68. P. 759—762.
15. Вахрушева Т.Е., Гогичайшвили Н.Б., Горбатен-ко Л.Е., Дзюба О.О., Талалова Е.Е. Биохимическая характеристика стевии в зависимости от условий выращивания // Мат-лы II Междунар. симпоз. "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". Т. 2. Пущино, 1997. С. 617—618.
16. Суханова М.А., Бондарев Н.И, Горяева О.В., Андреева С.Е., Носов A.M. Ультраструктурная характеристика клеток растений и каллусных культур Stevia rebaudiana в связи с синтезом стевиол-гликозидов // Биотехнология. 2007. Т. 5. С. 51—59.
17. Ladygin V.G, Bondarev N.I., Semenova G.A., Smo-lov A.A., Reshetnyak O.V., Nosov A.M. Chloroplast ultrastructure, photosynthetic apparatus activities and production
of steviol glycosides in Stevia rebaudiana in vivo and in vitro // Biol. Plant. 2008. Vol. 52 (1). P. 9-16.
18. Ascensao L, Figueiredo A.C, Barroso J.G, Pedro L.G., Schripsema J., Deans S.G., Scheffer J.C. 1998. Plec-tranthus madagascariensis: Morphology of the glandular tri-chomes, essential oil composition, and its biological activity // Int. J. Plant Science. 1998. Vol. 159 (1). P. 31-38.
19. Wagner G.J. Secreting glandular trichomes: more than just hairs // Plant Physiol. 1991. Vol. 96. P. 675-679.
20. Данилова М.Ф., Кашина Т.К. Структурные основы актиноритмической регуляции цветения. СПб.: Наука, 1999. 218 с.
21. Duke S.O, Paul R.N. Development and fine structure of the glandular trichomes of Artemisia annua L. // Int. J. Plant Science. 1993. Vol. 154. P. 107-118.
22. Васильев A.E. Функциональная морфология секреторных клеток растений. Л.: Наука, 1977. 208 с.
Поступила в редакцию 23.09.08
MORPHOLOGY AND ULTRASTRUCTURE OF TRICHOMES OF THE INTACT AND THE IN VITRO PLANTS STEVIA REBAUDIANA BERTONI IN RELATION TO SYNTHESIS AND ACCUMULATION IN THEM OF STEVIOL GLYCOSIDES
N.I. Bondarev, M.A. Sukhanova, G.A. Semenova, O.V. Goryaeva, S.E. Andreeva, A.M. Nosov
Trichomes present on the leaf surface of both intact and in vitro Stevia plants (Stevia rebaudiana Bertoni) were examined using scanning and transmission electron microscopy. Three types of trichomes were observed both on adaxial and on abaxial surface of leaves: (a) spherical glands, (b) large hairs, (c) small hairs. The trichomes appeared in higher numbers on the leaf surfaces of the intact plants. The numbers of trichomes seem to be greater on the upper leaves than on the lower leaves. The results of the work provide evidence for positive correlation between number of glands on leaves and their content of the SGs. Three major stages in the development of the gland cells were identified, corresponding to the stages of secret accumulation.
Key words: trichom, ultrastructur of gland cells, numbers of glands, content of steviol glycosides.
Сведения об авторах
Бондарев Николай Ильич — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. ИФР РАН. Тел.: (495) 977-94-45, 977-92-22, 903-93-02; e-mail: [email protected]
Суханова Марина Александровна — канд. биол. наук, науч. сотр. ИФР РАН. Тел.: (495) 977-94-45, 977-92-22; e-mail: [email protected]
Семенова Галина Алексеевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Тел. (4967) 73-37-96; e-mail: [email protected]
Горяева Ольга Васильевна — канд. биол. наук, вед. инженер кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ. Тел. (495) 939-21-18
Андреева Светлана — канд. биол. наук, кафедра физиологии растений биологического факультета МГУ. Тел. (495) 939-21-18
Носов Александр Михайлович — докт. биол. наук, проф. кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ. Тел.: (495) 939-21-18, 977-92-22; e-mail: [email protected]
