Научная статья на тему 'Морфологическое обоснование возможности использования электрохимических биосенсоров в диагностике колоректального рака'

Морфологическое обоснование возможности использования электрохимических биосенсоров в диагностике колоректального рака Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
110
41
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Верник Сефи, Белкин А.Н., Фрейнд Генриетта Герхардовна, Кацнельсон М.Д., Лицин С.Н.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Морфологическое обоснование возможности использования электрохимических биосенсоров в диагностике колоректального рака»

клинические исследования

Удк 616.348-005.4-036.86-08

морфологическое обоснование возможности использования электрохимических биосенсоров в диагностике колоректального рака

Сефи Верник1, А. Н. Белкин2, Г. Г. Фрейнд2, М. Д. Кацнельсон 3 4, С. Н. Лицин1, Йоси Шахам-Диаманд1, В. А. Четвертных *2

1 Тель-Авивский университет, г. Тель-Авив, Израиль,

2Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А Вагнера, г. Пермь, Россия, 3Пермский национальный исследовательский политехнический университет, г. Пермь, Россия

4Российский университет дружбы народов (филиал в г. Перми), г. Москва, Россия

MORPHOLOGICAL GROUNDING FOR POSSIBILITY OF USING ELECTROCHEMICAL BIOSENSORS IN COLORECTAL CANCER DIAGNOSIS

Sefi Vernic1, A. N. Belkin2, G. G. Freind2, M. D. Katsnelson 3 4, S. N. Litsin1, Josi Shacham-Diamand1, V. A. Chetvertnykh2

1 Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel,

2Perm State Academy of Medicine named after Academician E. A. Wagner, Perm, Russia, 3Perm National Research Polytechnical University, Perm, Russia, 4Russian University of People's Friendship (Perm Branch), Moscow, Russia

Проведены электрохимическое исследование и анализ содержания щелочной фосфатазы в биоптатах нормальной слизистой оболочки и опухолей толстой кишки при имплантации культуры клеток опухоли мышам с использованием биосенсоров. Образцы тканей были помещены в специально разработанные многокамерные электрохимические датчики. При добавлении субстрата для щелочной фосфатазы (р-аминофенилфосфат) происходила ферментативная реакция с выделением электрохимически активного продукта (р-аминофенола) и регистрацией электрического тока с помощью рабочего электрода. значительные различия в сигналах тока наблюдались в опухолевой и здоровой тканях слизистой оболочки кишки: низкие показатели при исследовании опухолевой ткани и высокие в здоровой ткани.

© коллектив авторов, 2012 e-mail: rector@psma.ru тел. 8 (342) 217 08 60

[четвертных В. А. (* контактное лицо) — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии ПГМА им. ак. Е. А. Вагнера; кацнельсон М. д.— профессор кафедры прикладной физики, кафедры МСИ ПНИПУ, кафедры прикладной информатики РУдН (филиал в г. Перми); Верник С. — инженер-исследователь кафедры физической электроники Тель-Авивского университета; Белкин А. Н. — аспирант кафедры патологической анатомии с секционным курсом ПГМА им. ак. Е. А. Вагнера; Фрейнд Г. Г. — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии с секционным курсом; лицин С. Н. — профессор кафедры электротехнических систем Тель-Авивского университета; Шахам-диаманд Й. — профессор кафедры электротехнических систем Тель-Авивского университета].

Необходимо проведение дальнейших морфологических исследований для изучения возможности применения данного метода в клинической практике.

Ключевые слова. Амперометрический метод, биосенсоры, патология, колоректальный рак, щелочная фосфатаза.

Electrochemical study and analysis of alkaline phosphatase content in normal mucosa bioptates and colonic tumors with tumor cell culture implantation to mice using biosensors was performed. Tissue samples were placed into specially developed multicell electrochemical sensors. When alkaline phosphatase substrate (r-aminophenylphosphate) was added, there occurred enzymatic reaction with isolation of electrochemically active product (r-aminophenol) and registration of electric current by means of working electrode. Significant differences in current signals were observed in tumor and healthy tissue of colonic mucosa: low tumor tissue indices and high healthy tissue indices. Further morphological investigations should be carried out to study the possibilities of using the above method in clinical practice.

Key words. Amperometric method, biosensors, pathology, colorectal cancer, alkaline phosphatase.

Введение

Рак толстой кишки занимает одно из первых мест в структуре смертности от злокачественных новообразований в развитых странах. Выявление колоректального рака на ранних стадиях существенно влияет на прогноз заболевания. Ведущим методом диагностики новообразований является морфологическое исследование биоптатов опухолей, полученных при проведении эндоскопии. В настоящее время перспективным является применение в диагностике рака методов, сочетающих морфологию и микроэлектронику. Вследствие высокой чувствительности и широкого линейного диапазона интенсивно исследуются электрохимические биосенсоры, в основе которых лежат ампе-рометрические датчики [1]. Посредством ам-перометрических иммуносенсоров разрабатываются методы выявления опухолей различных локализаций [2—10]. Несмотря на прогресс, достигнутый в этой области, современная тенденция в диагностике направлена на создание и эксплуатацию высокопроизводительных систем, использующих удобное и недорогое оборудование [11].

Известно, что во многих низкодиф-ференцированных колоректальных клеточных линиях уровень экспрессии щелочной фосфатазы (ЩФ) очень низок, почти отсут-

ствует, а ее активность составляет всего лишь <0,0001 ед./мг ткани, тогда как в здоровых дифференцированных клетках кишечного эпителия активность может достигать >0,7 ед./мг ткани [14, 15]. кроме того, гистохимические методы, основанные на сравнении содержания ЩФ в нормальных и злокачественных тканях толстой кишки, выявили резкое падение экспрессии ЩФ в опухолевой ткани, в отличие от нормальной ткани [16, 17]. Имеются результаты биохимических исследований культур клеток колоректального рака [18, 19]. Однако это трудоемкая и дорогостоящая процедура. до сих пор не проводилось непосредственное исследование биоптатов рака прямой кишки.

Цель исследования — определение ферментативной активности щелочной фосфа-тазы в ткани колоректального рака и в слизистой оболочке кишки вне опухоли.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

исследования

У мышей индуцировали развитие опухолей. клеточные линии аденокарциномы толстой кишки ЖГЛ^ вводили бестимусным (так называемым голым мышам) подкожно и внутрибрюшинно. Опухоли развивались в течение 4 недель. для контроля у тех же

мышей исследовали здоровую ткань кишки. Изучены 131 фрагмент ткани опухоли и 104 биоптата не пораженной опухолью стенки кишки. После отбора материал хранили при комнатной температуре в запечатанных пробирках в культуральной среде. Перед началом исследования биоптаты объемом 2 мм3 промывали фосфатным буфером и в течение 1 ч электрохимически исследовали уровень ЩФ.

Хроноамперометрию проводили в вось-миканальном высокочувствительном портативном потенциостате «PalmSens» (фирма «Palm Instruments BV», Нидерланды), оборудованном восьмиканальным мультиплексором, дающим возможность одновременно проводить измерения в восьми электрохимических ячейках. При проведении анализа использовали аппарат, изготовленный в лаборатории Тель-Авивского университета, содержащий электрические контакты электродов, изготовленные методом трафаретной печати, в сочетании с эффективным перемешиванием по принципу всасывания/вытеснения [12]. Электрохимическая камера на 300 мкл содержала в нижней части электрод, изготовленный методом трафаретной печати (произведенным на заказ фирмой «Gwent», Великобритания). Конструкция электрода состоит из золотого рабочего электрода, угольного противоэлектрода и хлорсеребря-ного электрода сравнения. Дополнительные измерения проводили в кремниевых электрохимических ячейках с планарным золотым рабочим электродом, золотым противо-электродом и хлорсеребряным электродом сравнения, изготовленными методами фотолитографии, напыления (золотые) и гальваностегии (хлорсеребряный). В процессе измерений происходило непрерывное перемешивание. конструкция электродов, изготовленных методом трафаретной печати, и кремниевой микросхемы представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Конструкция электродов

Из каждого фрагмента биоптата готовили суспензию в электрохимической камере в 220 мкл фосфатного буфера. Все электроды, соединенные восьмиканальным мультиплексором, работали в непрерывном режиме в условиях перемешивания. Потенциал относительно хлорсеребряного электрода сравнения составлял 220 мВ. После короткого времени установления равновесия, необходимого для стабилизации системы и определения фонового сигнала, обусловленного фоновыми электрохимическими и биохимическими реакциями [20], добавляли субстрат — парааминофенилфосфат (ПАФФ). Перед добавлением субстрата образцы в течение 5 мин приводили в равновесие под напряжением 0,22 В. Схема предложенного метода обнаружения представлена на рисунке 2.

Под действием выделяемого фермента (кишечной ЩФ) добавленный ПАФФ претерпевает дефосфорилирование до параамино-фенола (ПАФ). Образовавшийся ПАФ далее окисляется на рабочем электроде при низком положительном потенциале относительно хлорсеребряного электрода сравнения (0,22 В) до иминохинона. Затем образовавшийся иминохинон подвергается гидролизу до хинона. Электрохимическая реакция показана на рисунке 3. ЩФ гидролизует функциональную группу субстратов, первичных ортофосфатов, гидролизуется с образованием соответствующих спиртов (ЮН):

Рис. 2. Схема метода исследования

RHPO-+H2O^ROH+H2PO4-, проявляя оптимальную активность при щелочной pH. После этого полученные продукты могут подвергнуться дальнейшему электрохимическому окислению согласно реакции: ROH^RO+ne-+nH+, тогда как ПАФФ не должен давать электрохимического сигнала при том же потенциале, как его дефосфорилиро-ванная форма (продукт; ROH). Электрохимическая реакция, за которой следует ферментативный катализ, показана на рисунке 3.

Рис. 4. Хроноамперометрическое исследование биоптатов,

отобранных из опухолей ИСТ116 и из здоровых тканей толстой и тонкой кишок. Сигналы тока соответствуют ферментативной активности ЩФ, отражающей степень дифференцировки клеток (п/к — подкожное, в/б — внутрибрюшное введение, ср. х19 — среднее из 19 образцов и т. п.)

электрохимический сигнал, отражающий постепенное повышение силы тока. Тем не менее, поскольку аденокарцинома в большинстве случаев наблюдается в толстой, а не в тонкой кишке, для получения объективных результатов сравнивали образцы, полученные из толстой кишки, как показано на рисунке 5.

Рис 3. А — субстрат (п-аминофенилфосфат) подвергается дефосфорилированию под действием ЩФ; Б — образовавшийся п-аминофенол окисляется на электроде с потенциалом 022 В, создавая ток

Результаты и их обсуждение

Результаты хроноамперометрического исследования биоптатов опухолей НСТ116 и здоровых тканей приведены на рисунке 4.

В течение нескольких секунд после добавления субстрата наблюдался отчетливый

Рис. 5. Хроноамперометрическое исследование биоптатов, отобранных из опухолей НСТ116 и из здоровых тканей

толстой кишки. Сигналы тока соответствуют ферментативной активности щелочной фосфатазы, отражающей степень дифференцировки клеток (п/к — подкожное, в/б — внутрибрюшное введение, ср. х19 — среднее из 19 образцов и т. п.)

Вследствие высокого содержания ЩФ в биоптатах здоровой толстой кишки регистрировался сигнал тока, который значительно отличается от силы тока, наблюдаемого при исследовании биоптатов опухолей. Стандартное отклонение вычисляли по среднему токовому сигналу, полученному спустя 500 сек после добавления субстрата, как показано на рисунке 6.

120

4 100

i «

г

5 60

?«1

«ад

НЭДМгНЬНЭЯ ТОРСТЭЯ ЙИШКЭ ■1 ь|Ш-Ё-Й, которые были зее-де^ь. щитки НСТ116 )ср - Е|

Стумоль НСТИ6(ср «171

Е'О опуАОЛь

НСТ116 ! ср. КЯ)

Рис. 6. Средний сигнал тока и стандартное отклонение, полученные спустя 500 сек после добавления субстрата

(п/к — подкожное, в/б — внутрибрюшное введение, ср. х19 — среднее из 19 образцов и т. п.)

Несмотря на различия между типами исследованных образцов, из полученных нами результатов следует, что в тканях опухолей выявлены существенно пониженные уровни активности ЩФ.

Аналогичный эксперимент был проведен с использованием других электрохимических ячеек и модифицированного нами с помощью кремниевых микросхем электрохимического анализа. Результаты амперомет-рического определения ферментативной активности ЩФ в образцах здоровой толстой кишки и опухолей, проведенного с помощью кремниевых микросхем, показаны на рисунке 7.

Результаты проведенных исследований являются дополнительным свидетельством того, что ферментативную активность ЩФ можно измерять непосредственно в свежих

Рис. 7. Хроноамперометрическое исследование биоптатов, отобранных из опухолей НСТ116 и из здоровых тканей толстой кишки; величина силы тока соответствует ферментативной активности ЩФ, отражающей степень дифференцировки клеток

биоптатах (рис. 8). Измеряемая сила тока оказалась намного выше показателей, полученных ранее с помощью электродов, изготовленных методом трафаретной печати, благодаря улучшению чувствительности кремниевой микросхемы и общих эксплуатационных характеристик. как и ранее, стандартное отклонение вычисляли по среднему сигналу тока, регистрируемого спустя 850 сек после добавления субстрата.

В целях анализа результатов было проведено сравнительное морфологическое изучение биоптатов, исследованных с помощью биосенсора (как опухолевых, так и здоровых тканей). Свежие фрагменты нормальных

Рис. 8. Средний сигнал тока и стандартное отклонение, полученные спустя 500 сек после добавления субстрата

при гистологическом исследовании обнаруживали низкодифференцированную адено-карциному. Биоптаты, взятые из слизистой оболочки здоровой толстой кишки и дававшие сильные сигналы тока, имели нормальную гистологическую структуру. Результаты морфологических исследований представлены в таблице. Все исследованные образцы

Таблица

Результаты патогистологического исследования биоптатов, взятых из ксенотрансплантатных опухолей HCT116 и здоровой слизистой оболочки толстой кишки

и опухолевых тканей исследовали с помощью биосенсора, а оставшийся материал зафиксировали 10%-ным нейтральным формалином, обработали по общепринятой методике и окрасили гематоксилином и эозином. В биоптатах опухолей, которые при добавлении ПАФФ в процессе исследования с помощью биосенсора давали слабые сигналы тока,

Обозначение образца/ увеличение Гистологическая картина Гистологический препарат, окрашенный гематоксилином и эозином

HC3/x10 Нормальная слизистая оболочка толстой кишки с подслизистой основой д ;

T2/x4 Опухолевая ткань из брюшной полости мыши после прививки культуры ткани. Отсутствие железистых структур свидетельствует о низкой дифференци-ровке опухоли Шк

T7/x10 Очаги некроза и кровоизлияний в ткани опухоли ill

T4/x40 Выраженный ядерный полиморфизм и патологические митозы в опухолевых клетках

были обозначены в соответствии с их морфологией, например нормальная слизистая оболочка толстой кишки, образец № 1 — как HC1, ткань опухоли — как T1 и т. д.

Рабочая гипотеза, что простое биоэлектрохимическое измерение, проведенное непосредственно по биоптатам, позволяет установить различия выраженности диффе-ренцировки нормальных и опухолевых клеток, была подтверждена результатами, приведенными на рисунках 1—4. Данные, приведенные на рисунке 4, отчетливо указывают на то, что образцы, взятые из здоровой слизистой оболочки кишки, характеризуются высокими уровнями ферментативной активности маркера дифференцировки клеток слизистой оболочки кишечника — щелочной фосфатазы, что подтверждает результаты ранее проведенных исследований [13]. Уровни активности фермента в опухолевых тканях значительно снижены, что свидетельствует о подавлении экспрессии щелочной фосфа-тазы. Результаты проведенных нами исследований служат обоснованием предлагаемого метода диагностики колоректального рака по биоптатам. Токовый сигнал, создаваемый исследуемыми биоптатами опухолей, значительно слабее (для образцов, полученных из опухолей HCT116, средняя AI в 5,3 раза ниже), чем от образцов здоровых тканей. Повышение чувствительности достигалось за счет использования кремниевой микросхемы, как показано на рисунке 7. Повышенная чувствительность изготовленных биомикросхем по сравнению с электродами, изготовленными методом трафаретной печати, была подтверждена тем, что создаваемая при этом средняя AI была в 31 раз ниже. Использование мультиплексора позволило создать высокопроизводительную схему детекции содержания ЩФ с одновременным исследованием нескольких образцов тканей. Благодаря высокой чувствительности хроноамперометри-

ческого метода стало возможным проведение исследований по мелким фрагментам биоптата. Результаты морфологического исследования коррелировали с результатами, полученными ранее с помощью биосенсора на базе электрохимических ячеек. как известно, «золотым стандартом» в диагностике колоректального рака является патогистоло-гическое исследование, поэтому подтверждение данных, основанных на изучении содержания ЩФ с использованием биосенсоров, является объективным обоснованием возможностей применения электрохимического метода.

Выводы

Применение электрохимического биосенсора для диагностики колоректального рака является перспективным методом исследования. В данной работе мы привели обоснование амперометрической схемы прямого анализа свежих биоптатов с использованием биосенсоров.

Определение ферментативной активности ЩФ в образцах опухолей осуществляется в течение нескольких минут после взятия биоптата. Электрохимическое исследование позволяет регистрировать высокое содержание ЩФ в дифференцированных клетках кишечного эпителия и низкое в злокачественных низкодифференцированных клетках.

Результаты патогистологического исследования коррелируют с данными, полученными при электрохимическом исследовании с использованием биосенсоров.

Проведенное морфологическое исследование служит обоснованием более высокой чувствительности применения модифицированного метода электрохимического анализа с использованием кремниевых биосенсоров.

клинические исследования

Выражение признательности

Авторы выражают благодарность г-ну К. Левкову, научному сотруднику кафедры молекулярной микробиологии и биотехнологии Тель-Авивского университета, за помощь в проведении исследований. Авторы признательны Н. В. Игишевой за помощь в подготовке рукописи.

Работа выполнена при финансовой поддержке министерства образования и науки Пермского края.

Библиографический список

1. Wang J. Biosens. Bioelectron., 21, 1887 2006.

2. Dan D., Xiaoxing X., Shengfu W. and AidongZ. Talanta, 71, 1257 2007.

3. Dai Z, ChenJ, Yan F. andJu H. Cancer Detect. Prev., 29, 233 2005.

4. Lin J, Qu W. and Zhang S. Anal. Sci., 23, 1059 2007.

5. Meyerhoff M. E, Duan C. and Meusel M. Clin. Chem., 41, 1378 1995.

6. Sarkar P., Pal P. S, Ghosh D., Setford S. J. and Tothill I. E. Int. J. Pharm., 238, 1 2002.

7. Healy D. A, Hayes C. J, Leonard P., McKenna L. and O'Kennedy R. Trends Biotechnol., 25, 125 2007.

8. Fu X. H. Electroanalysis, 19, 1831 2007.

9. He Z, Gao N. and Jin W. Anal. Chim. Acta, 497, 75 2003.

10. He Z, Gao N. and Jin W. J. Chromatogr., B: Biomed. Appl., 784, 343 2003.

11. Soper S. A., Brown K, Ellington A., Frazier B, Garcia-Manero G, Gau V., Gutman S. I., Hayes D. F., Korte B, LandersJ. L et al. Biosens. Bioelectron., 21, 1932 2006.

12. Paitan Y, Biran I., Shechter N, Biran D, Rishpon J. and Ron E. Z. Anal. Biochem., 335, 175 2004.

13. Hinnebusch B. F., Siddique A, Henderson J. W., Malo M. S, Zhang W., Athaide C P, Abedrapo M. A, Chen X, Yang V. W. and Hodin R. A Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 286, G23 2004.

14. Barnard J. A and Warwick G. Cell Growth Differ., 4, 495 1993.

15. Gum J. R, Kam W. K, Byrd J. C, Hicks J. W., Sleisenger M. H. and Kim Y. S. J. Biol. Chem., 262, 1032 1997.

16. Giatromanolaki A, Sivridis E, Maltezos E. and Koukourakis M. I. Semin. Oncol., 29, 14 2002.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

17. Bell L. and Williams L. Histochem. Cell Biol., 60, 85 1979.

18. Velcich A, Palumbo L., Jarry A, Laboisse C., Racevskis J. and Augenlicht L. Cell Growth Differ., 6, 749 1995.

19. Boren J, Lee W. N. P., Bassilian S, Centelles J. J., Lim S, Ahmed S, Boros L. G. and Cascante M. J. Biol. Chem., 278, 28395 2003.

20. Popovtzer R., Neufeld T, Popovtzer A, Rivkin I, Margalit R., Engel D, Nudelman A, Rephaeli A, Rishpon J, Shacham-Diamand Y. et al. Nanomedicine, 4, 121 2008.

Материал поступил в редакцию 03.09.2012

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.