CC BY
66
Морфологическое обоснование эффективности применения пробиотических препаратов при лечении сальмонеллёза крыс
Л.Л. Абрамова, д.б.н, профессор, Оренбургский ГАУ; А.Н. Сизенцов, к.б.н., Н.В. Шеботина, Оренбургский ГУ
На современном этапе лечения инфекционных болезней использование антибиотиков существенно уменьшило смертность людей, сократились сроки клинических проявлений заболеваний [1]. Вместе с тем следует отметить, что антибиотики широкого спектра действия воздействуют не только на патогенную, но и на нормальную микробную флору кишечника и могут вызывать желудочно-кишечные расстройства или способствовать развитию вторичных инфекций [2].
Пробиотики в отличие от антибиотиков не оказывают негативного эффекта на нормальную микрофлору, поэтому их широко применяют для профилактики и лечения дисбактериозов, которые могут быть вызваны применением антибиотических препаратов [3, 4].
Можно сделать предположение, что наибольшую эффективность имеет комплексная терапия, а именно: сочетанное применение антибиотиков и пробиотиков. Однако для этого необходимо
учитывать резистентность микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов, к антибиотикам, в комплексе с которыми они применяются [5].
Цель нашего исследования: морфологически обосновать эффективность совместного применения пробиотиков с антибиотиками при лечении экспериментальной кишечной инфекции, в частности, сальмонеллёза.
Исходя из поставленной цели, определены следующие задачи.
1. Изучить эффективность лечения сальмонеллёза с применением антибиотика, пробиотика и комплекса антибиотик + пробиотик.
2. Оценить степень воздействия исследуемых микроорганизмов на микроморфологию органов мишеней лабораторных животных во всех сериях эксперимента.
В качестве объектов исследования использовались:
1) бактерии рода Bacillus, входящие в состав пробиотических препаратов («Биоспорина», «Споробактерина», «Бактисубтила»);
2) тест-организм (Salmonella enteritidis);
Эффективность совместного применения пробтгтиков с антибиотиками при
лечении сальмонеллёза
Контрольная Контрольная
1п=9 1н=13
(обычный р Л1Ш0Н (обычный
н условия г одержання) р ащюн+пар аженне)
Контрольная
1»=9
(обичныЛ
рацион
+бактнеубтнл)
Контрольная Контрольная
1»=9 1п=9
(обычный (обычный
р ащюн+біхос порнн! рацион +< пор о б ак тер ПИ)
Опытная 1
їй=9 (тар аж енне +антибиотик 1)
Опытная У
1п=9
(таражемне +антпбііотнк 3)
Опытная 5 1и=9 О яр ажение +с пор о б ак тер нм)
Опытная *
1» =9
(тар аж «мне +бпоспорнн +антибі«от»«к 1)
Опытная 9 1п=9 (іараженне +бактнгубтнл +*нтибпот»«к 3)
Опытная 2 1н=9 (тар аженне +антибиотик 2)
Опытная 4 1«=9 (тар аженне +бпогпорісн)
Опытная 6 1и-9 (lap а ж «ни* +бак тис у бтнл)
Опытная 8 U=9 (тар ажемне +< п ор о б ак т ер і IH +антибпотнк 2)
Убой животных будетпротводиться в количестве трёх голов на каждой контрольной точке исследовний для определения эффективности применения исследуемых препаратов В качестве контрольных точек установлены следующие сроки фоковое значение(перед применением препаратов). через 5 н 10 дней после начала экспернмента)
Рис. 1 - Схема исследования:
К0 - обычный рацион, К1 - заражение, К2 - биоспорин, К3 - споробактерин, К4 - бактисубтил, О1 - заражение + хлорам-феникол, О2 - заражение + цефотаксим, О3 - заражение + пенициллин, О4 - заражение + биоспорин, О5 - заражение + споробактерин, О6 - заражение + бактисубтил, О7 - заражение + биспорин + цефотаксим, О8 - заражение + споробактерин + хлорамфеникол, О9 - заражение + бактисубтил + пенициллин
3) органы и ткани лабораторных животных (крыс).
Решению поставленных задач способствовали следующие методы:
1. Определение антибиотикорезистентности штаммов микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов, и исследуемого тест-организма с использованием АТВ тест-систем, диско-диффузионного метода и метода серийных разведений.
2. Метод гистологического исследования органов и тканей.
По результатам предварительных исследований были выбраны следующие антибиотики для сочетанного применения: с биоспорином — це-фотаксим, со споробактерином — хлорамфеникол и с бактисубтилом — пенициллин.
Для подтверждения результатов проведены исследования с использованием метода серийных разведений с целью определения количественных значений минимальных подавляющих концентраций.
На втором этапе изучалась эффективность совместного применения пробиотиков и антибиотиков при лечении лабораторной инфекции (рис. 1).
Исследования, направленные на определение эффективности комплексного применения антибиотиков и пробиотиков при лечении лабораторной инфекции, проводились на лабораторных животных.
С этой целью сформировали группы животных-аналогов по половой, возрастной характеристикам и массе. Были созданы контрольные группы:
— фоновая группа, в которой оценивали действие пробиотиков на лабораторных крыс;
— группа, в которой оценивали действие пробиотиков (биоспорина, срдержащего Б.шЫШн + БЛскет/огш1з, споробактерина Б.шЫШн, бакти-субтилла Б.сегет) на лабораторных крыс;
— группа, в которой оценивали действие лабораторной инфекции на организм животных без проведения лечения.
В опытных группах сравнивалась эффективность лечения инфекции антибиотиками, а также комплексного использования антибиотиков и пробиотиков.
Убой животных проводился в количестве трёх голов на каждой точке исследований для определения эффективности применения испытуемых препаратов. В качестве точек исследования были установлены следующие сроки: фоновое исследование перед применением препаратов, на пятый и на 10-й день после начала эксперимента. Заражение лабораторных животных осуществляли однократно перорально. Пробиотики и антибиотики вводились в соответствии с аннотацией к препарату. Введение препаратов в опытных группах проводилось через 12 часов с момента заражения.
Для гистологического исследования отбирали образцы тонкого отдела кишечника. Обработку гистоматериала, получение и окрашивание гистопрепаратов производили по традиционной методике.
При исследовании фоновых значений тонкого отдела кишечника было установлено, что во всех исследуемых группах признаки патологических изменений слизистой оболочки отсутствовали. Сосудистая реакция сводилась к полнокровию сосудов (венул) поверхностных слоёв слизистой оболочки, чаще в области ворсинок. Расщепление верхушек последних увеличивало поверхность всасывания слизистой оболочки. Крипты без изменений, слабо инфильтрова-ны лимфоцитами. Малодифференцированные энтероциты донной части крипт митотически активны, имели выраженную базофилию ядра. В криптах хорошо выражено формирование бокаловидных клеток (рис. 2).
На пятый день исследования в группе К1 на всём протяжении слизистой оболочки кишечника были выражены: гиперемия, кровоизлияния и периваскулярные отёки. Хорошо просматривались в подслизистом слое лимфоидные образования, с точечными кровоизлияниями и периваскулярными отёками.
Ворсинки укороченные, их основа истончается, нарушается микроциркуляция. Выражена вакуолизация эпителия ворсинок (рис. 3А). Видна мелкоклеточная инфильтрация основы ворсинок и местами формирование лимфоидных узелков. Крипты укороченные, с расширенными просветами, вокруг крипт гемокапилляры расширены. В энтероцитах крипт наблюдалась слабая базофилия (рис. 3Б), пониженная митотическая активность, дезорганизация криптоворсиночного комплекса. Выявлен также и лизис мембран энтероцитов. Ядра энтероцитов прозрачные, ядрышки разрушены (рис. 3Б). Просматриваются «цепочки» мигрирующих лимфоцитов между криптами. Отдельные крипты содержали фигуры митоза, образовавшиеся вследствие включения адаптивно-приспособительных механизмов.
Рис. 2 - Тонкий кишечник крысы. Общий контроль (окрашивание гематоксилином) ув. х1500 - крипта
В группах К2, К3, К4 признаки патологии слизистой оболочки. Сохранялась целостность отсутствовали. Сосудистая реакция сводилась ворсинок, в которых хорошо развиты соедини-к полнокровию сосудов поверхностных слоёв тельнотканная основа и микрососуды.
Рис. 3 - Тонкий кишечник крысы в группе ^(заражение); окрашивание гематоксилином; ув. х1500: А - ворсинки; Б - крипта
Рис. 4 - Тонкий кишечник крысы в группах К2, К3, К4; окрашивание гематоксилином; ув. х1500: А - крипты и ворсинки; Б - крипта
Рис. 5 - Тонкий кишечник крысы в группах Оь О2; окрашивание гематоксилином: А (ув. х600) - ворсинки и крипты; Б (ув. х1500) - крипта
Рис. 6 - Тонкий кишечник крысы в группах Оь О2; окрашивание гематоксилином; ув. х600: А - лимфоидное образование; Б - ворсинки
В эпителии основания ворсинок увеличено содержание бокаловидных энтероцитов (рис. 4А) Крипты нормально удлинённой формы, имеют чётко выраженные просветы без признаков отёчности (рис. 4Б).
В опытной группе О4 изменения в слизистой оболочке кишечника минимальны. Сосудистая реакция сводилась к полнокровию сосудов (венул) в области основания ворсинок. Сосуды паретиче-ски расширены, с тромбами. Ворсинки сохраняли нормальную структуру, численность бокаловидных энтероцитов в эпителии также в пределах нормы. Крипты не имели изменений: границы, ядро и ядрышки энтероцитов были хорошо выражены.
Патологические изменения в опытных группах О5, О6, О3 минимальны и сводились к отёку стромы. Ворсинки сохраняли свою целостность, имели характерную для физиологической нормы высоту, наблюдалась хорошо развитая соединительнотканная основа ворсинок и микрососуды. Крипты имели удлинённую форму с незначительными периваскулярными отёками.
В опытных группах О!, О2 на всём протяжении слизистой оболочки были выражены отёки, кровоизлияния, гиперемия, поверхностный некроз и изъязвления слизистой оболочки (рис. 5А); полнокровные, набухшего вида лимфоидные образования. В области крипт установлена повышенная секреция, слущивание эпителия, который скапливался в их расширенных частях (рис. 5Б) вместе со слизью и лейкоцитами, мелкоклеточная инфильтрация.
В группах О7, О8, О9 обнаружены минимальные изменения в слизистой оболочке. Сосудистая реакция сводилась к полнокровию сосудов (ве-нул) поверхностных слоёв слизистой оболочки, чаще в области ворсинок. Последние имели правильную структуру, все виды энтероцитов — без признаков патологии. Крипты имели правильно удлинённую форму и просветы. Признаков отёчности не наблюдалось.
На 10-й день исследования в группе К0 изменения не обнаружены. В группе К! на всём протяжении слизистой оболочки кишечника наблюдались отёк, кровоизлияния, гиперемия, поверхностный некроз и изъязвления слизистой оболочки. Лимфоидные образования слизистой были хорошо выражены, имели набухший вид, полнокровные сосуды, точечные кровоизлияния (рис. 6А). Ворсинки укороченные, основа их истончена. Регистриртровалась массовая вакуолизация эпителия ворсинок и лизис мембран энтероцитов крипт. Наблюдались слабая базо-филия и выраженная вакуолизация энтероцитов крипт. В комплексе ворсинка — крипта выявлено нарушение регенерации эпителия.
В группах К2, К3, К4 признаки патологии отсутствовали. Сосудистая реакция сводилась
к полнокровию сосудов поверхностных слоёв слизистой оболочки. Целостность ворсинок сохранялась, хорошо были развиты соединительнотканная основа ворсинок и микрососуды (рис. 6Б). Микрососуды имели нормальную структуру и степень наполненности.
В группах О4, О5, О6 установлены незначительные патологические изменения в слизистой оболочке, сосудистая реакция сводилась к полнокровию её сосудов. Подслизистая основа слизистой оболочки инфильтрировалась лимфоцитами, которые скапливались преимущественно вокруг сосудов. Строение ворсинок и крипт оставалось в норме.
Отёк и кровоизлияния местами наблюдались в группах Оь О2. Повышалась секреция эпителия крипт; происходило массовое слущивание эпителия, который скапливался в расширениях желёз вместе со слизью и лейкоцитами; местная вакуолизация энтероцитов крипт. Ворсинки имели характерное для нормы строение. В группе О3 изменения в слизистой были минимальны. Сосудистая реакция выражалась в полнокровии сосудов поверхностных слоёв слизистой оболочки, чаще в области ворсинок. Минимальные изменения выявлены в слизистой животных группы О7. Признаки патологии отсутствовали. Целостность ворсинок сохранялась. Крипты имели удлинённую форму без признаков отёчности, микрососуды — нормальную структуру и степень наполненности. В группах О8,Ор изменения в слизистой также были минимальны. Признаки патологии отсутствовали, но имелся небольшой отёк стромы. Крипты незначительно расширены. Ворсинки сохраняли нормальные размеры.
Таким образом при экспериментально созданной лабораторной инфекции, в частности сальмонеллезе, патоморфологические изменения в слизистой оболочке кишечника крыс эффективно снимает применение пробиотика биоспорина и его сочетания с антибиотиком цефотаксимом. Менее эффективно действует пробиотик споробактерин и его сочетание с хлорамфениколом. Наименьший эффект оказывает пробиотик бактисубтил и его сочетание с пенициллином.
Литература
1. Никитин А.В. Антибиотики как регуляторы механизмов воспалительных реакций организма при инфекционном процессе // Антибиотики и химиотерапия. 1997. №9. С. 2—4.
2. Егоров Н.С. Что такое антибиотики // Основы учения об антибиотиках. М., 2004. 528 с.
3. Collins M.D., G.R. Gibson Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut // AmJ.Clin.Nutr. 1999. Vol.69. № 5. Р. 1052-1057.
4. Бережной В.В., Крамарев С.А., Шунько Е.Е. Микрофлора человека и роль современных пробиотиков в её регуляции // Здоровье женщины. 2004. №1 (17). С. 134-139.
5. Захаренко С.М., Суворов А.Н. Антибиотики, пробиотики, пребиотики: друзья или враги? // Consilium Medicum. 2009. №8.
