CC BY
58
УДК: 547.29 612.017.34
В.Л. Лимонов, А.В. Шурлыгина, М.В. Робинсон, Н.Г. Пантелеева,
О.П. Колесникова, С.В. Айдагулова, Г.И. Непомнящих, В.А. Труфакин
МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧЕК И СЕЛЕЗЕНКИ У МЫШЕЙ С ИММУНОКОМПЛЕКСНЫМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ, ИНТАКТНЫХ И НА ФОНЕ ИММУНОСУПРЕССИВНОЙ ТЕРАПИИ
ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН,
ГУ НИИ физиологии СО РАМН,
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН,
ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН, Новосибирск
Проведено изучение морфологической картины почек и селезенки мышей с экспериментальной моделью аутоиммунного заболевания (иммунокомплексный гломерулонефрит) на фоне иммуносупрессивной терапии соединением ВЛ-11-02 (производное индолилтиоалканкарбо-новой кислоты) в сравнении с традиционно применяемым для лечения аутоиммунных заболеваний препаратом азатиоприн. Обнаружено, что у животных, получавших иммуносупрес-сивную терапию, независимо от использованного препарата снижается протеинурия, уменьшаются патоморфологические проявления почечной патологии и активации селезенки. Сделано заключение, что соединение ВЛ-11-02 по своей эффективности не уступает препарату сравнения (азатиоприну), а по некоторым параметрам превосходит его.
Ключевые слова: индолилтиоалканкарбоновая кислота, иммунокомплексный гломерулонефрит, почка, селезенка, иммуносупрессия
Иммунокомплексный гломерулонефрит является моделью аутоиммунного заболевания, при котором поражение почек обусловлено иммунологическими механизмами [1]. Иммунологическим механизмом, запускающим каскад нарушений в почках, является Т-зависимая поликлональная активация В-клеток, сопровождающаяся увеличением синтеза анти-ДНК антител, формированием иммунных комплексов, что приводит к системному иммунокомплексному воспалительному процессу в почках — нефриту и про-теинурии. Такой тип повреждения почек сравним морфологически и функционально с характером поражения почек при СКВ [2, 3].
В лечении аутоиммунных заболеваний человека широко применяются иммунодепрессанты (азатиоприн, глюкокортикоиды), которые оказывают цитостатическое действие на иммунокомпе-тентные клетки и тем самым снижают выраженность аутоагрессии. Однако многие из препаратов этого класса обладают либо значительными побочными эффектами (глюкокортикоиды), либо высокой токсичностью (азатиоприн). Это ограничивает возможности их применения в клинике и заставляет искать новые средства иммунокоррекции заболеваний аутоиммунного генеза.
В предварительных экспериментах установлено, что синтетическое производное индолилтио-алканкарбоновой кислоты (соединение ВЛ-11-02)
обладает выраженными миело- и иммунодепрес-сивными свойствами и значительно меньшей токсичностью, чем традиционно используемые иммунодепрессанты. Целью настоящего исследования явилось изучение иммунокорригирующего эффекта данного вещества на экспериментальной модели аутоиммунной патологии в сравнении с традиционно применяемым для лечения аутоиммунных заболеваний препаратом азатиоприн.
Материал и методы
В работе использовали здоровых половозрелых животных — мышей линии DBA/2 и мышей гибридов (C57BL/6xDBA/2)F1 (BDF1), самок 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные были одного возраста и получены одновременно из одного питомника («Рассвет», г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и подопытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводили в одно и то же время суток (утром). Все эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минздрава СССР от 12.08.77 г.).
Модель иммунокомплексного гломеруло-
нефрита вызывали у самок BDF1 двукратным с недельным интервалом внутривенным введением лимфоидных клеток от самок родительской линии DBA/2. Содержание белка в моче определяли калориметрически с красителем Kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie) на Titertec Multiscan, длина волны X 570 nm. В опытах использовали мышей со стойкой протеинурией и содержанием белка 3 мг/мл и более (белок в моче определялся неоднократно). Физиологическая протеинурия составляет у мышей от 0 до 1,0 мг/мл
Для изучения иммуносупрессорных свойств соединения ВЛ-11-02 проведено 2 серии опытов. В I серии у мышей со стабильной протеинурией на протяжении 2-х месяцев и содержанием белка в моче от 3,0 до 6,5 мг/мл проведено курсовое введение соединения ВЛ-11-02. Курс составил 10 ежедневных внутрижелудочных введений через зонд соединения в дозе 5мг/кг (100 мкг/ мышь) и 10 мг/кг (200 мкг/мышь). Аналогичным образом вводили препарат сравнения азатиоприн в дозе 5 мг/кг. Измерение протеинурии проводили через сутки после последнего введения препаратов.
Для гистологического исследования селезенки и почек мышей забивали под эфирным наркозом через сутки после последнего введения препаратов и извлекали соответствующие органы. Контролем служили животные, которым моделировали иммунокомплексный гломерулонефрит, но не применяли медикаментозного воздействия. Селезенку фиксировали в жидкости Телесницкого и заливали в парафин. На ротационном микротоме приготовляли срезы толщиной 5-7 мк. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином по общепринятой методике. Морфометрическое исследование проводили на комплексе Axioplan-2 (Karl Zeiss) по программе Axiovision при увеличении ок.10, об.10. В срезах измеряли площади фолликулов белой пульпы, реактивных центров и периарте-риальных зон, вычисляли размеры В-зависимых зон белой пульпы (общая площадь фолликула
— площадь периартериальной зоны) и соотношение Т- и В-зависимых зон (площадь периар-териальной зоны/площадь В-зависимой зоны). Для каждой мыши проводили по 10 измерений (для тимуса и для селезенки) в произвольно выбранных срезах из разных отделов органов. Кроме того, под световым микроскопом при том же увеличении подсчитывали количество фолликулов белой пульпы с реактивными центрами и без реактивных центров. Образцы почек фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига; затем материал проводили для заливки в парафин и в эпоксидные смолы. Парафиновые срезы окрашивали гематок-
силином и эозином в сочетании в реакцией Пер-лса (на выявление ионов железа), по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию. Полу-тонкие срезы окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Результаты статистически обработаны с использованием пакета прикладных программ для ПК STATISTICA 5. Достоверность различий показателей экспериментальных групп оценивали по критерию и Манна-Уитни при 95% уровне значимости.
Результаты и обсуждение
Мыши с экспериментальным иммунокомп-лексным гломерулонефритом характеризуются выраженной протеинурией (уровень белка в моче составляет в среднем 8,47 мг/мл), что свидетельствует о нарушении фильтрационной функции почечных клубочков. Введение соединения ВЛ-11-02 в разных дозах в 80% случаев привело к снижению белка в моче. При введении азатиоприна в I серии опытов протеинурия снижалась у 40% животных, а во II — у 83%. Можно сказать, что в целом по эффективности соединение не уступает широко используемому в клинической практике иммунодепрессанту азатиоприну, а в некоторых случаях и превосходит его.
Патоморфологическое исследование почек дало следующие результаты. В препаратах почек мышей контрольной группы (нелеченные) в большинстве клубочков наблюдаются изменения, касающиеся всех их компонентов — уменьшение диаметра, редукция просветов капиллярных петель и мочевых пространств, адгезия и очаговые синехии боуменовой капсулы. Местами прослеживается гиперплазия капсулярного эпителия. Просветы сосудистых петель неравномерно, но значительно расширены, со стазом эритроцитов. Гломерулярные базальные мембраны резко утолщены, ШИК-позитивны, сегментарно отмечен феномен «проволочных петель» — десквамация эндотелиальной и эпителиальной составляющих гломерулярного фильтра. Пролиферация мезангиоцитов отсутствует. Почечные канальцы в состоянии дистрофии. Эпителий многих проксимальных канальцев с многочисленными крупными железосодержащими гранулами, характеризующимися положительной реакцией Перлса. Во всех случаях в просветах канальцев выявлены многочисленные крупные белковые цилиндры. Часть канальцев с признаками выраженной тотальной альтерации и десквамации тубулярного эпителия. В интерстиции полнокровие сосудов, в мозговом слое — лимфостаз, выражена интенсивная периваскулярная, перитубулярная и пе-ригломерулярная мононуклеарная лимфо-мак-рофагальная инфильтрация. В строме отмечены
Рис. 1. Структурные изменения почек при экспериментальном иммунокомплексном гломерулонефрите.
Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 250. а — многочисленные гранулы гемосидерина в эпителиоцитах канальцев, сидерофаги в интерстиции, коллапс гломерулярных капилляров; б — периваскулярная мононуклеарная инфильтрация.
Рис. 2. Структурные изменения почек при коррекции экспериментального иммунокомплексного гломерулонефрита азатиоприном.
а — утолщение гломерулярных базальных мембран, расширение зон мезангия, клеточный детрит в просветах канальцев. Полутонкий срез, окраска азуром II. Ув. 400; б — значительная периваскулярная мононуклеарная инфильтрация, белковые цилиндры в просветах канальцев, атрофия клубочка. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 250.
Рис. 3. Структурные изменения почек при коррекции экспериментального иммунокомплексного гломерулонефрита соединением ВЛ-11-02.
а — очаговое увеличение зон мезангия без признаков гиперплазии мезангиоцитов, гипертрофия эндотелиоцитов гломерулярных капилляров. Полутонкий срез, окраска азуром II. Ув. 400; б — минимальная периваскулярная мононуклеарная инфильтрация, отсутствие гранул гемосидерина в эпителии канальцев. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 250.
значительные скопления гранул гемосидерина (Рис. 1).
У животных, леченных азатиоприном, в меньшей степени выражены структурные изменения гломерулярного и тубуло-интерстициального компартментов почек. В меньшей степени выражен и распространен феномен «проволочных петель», и более заметна пролиферация эндотелио-цитов. В почечных канальцах единичные мелкие белковые цилиндры. Мононуклеарная клеточная инфильтрация, представленная преимущественно лимфоцитами, выражена в меньшей степени и в основном приурочена к крупным артериям, встречаются мелкие перитубулярные и перигло-мерулярные лимфоидные инфильтраты. Отложения гемосидерина в интерстиции, в отличие от контрольной группы, имеют не диффузный, а очаговый характер (Рис. 2).
У мышей, получавших соединение ВЛ-11-02, почечные клубочки во всех случаях характеризовались умеренно выраженным полиморфизмом
— от близкой к нормальной структуры до измененной. Как правило, гломерулярные сосудистые петли неравномерно расширены и полнокровны, с различной степенью адгезии сосудистого пучка к боуменовой капсуле, с очаговым увеличением зон мезангия, но также без признаков гиперплазии мезангиоцитов. Гломерулярные базальные мембраны неравномерно утолщены, с минимальными сегментарными изменениями по типу «проволочных петель». Эндотелий и подоциты умеренно полиморфны. В почечных канальцах небольшое количество гранул гемосидерина. Эпителиальная базальная мембрана канальцев ШИК-позитивна, цилиндры не обнаружены. Клеточная инфильтрация минимальна или отсутствует, носит преимущественно лимфоцитарный характер, приурочена к единичным гломерулам, мелким сосудам и еще реже — канальцам. Одиночные гранулы гемоси-дерина в интерстиции обнаружены в одном случае (Рис. 3).
Таким образом, животные с экспериментальным иммунокомплексным гломерулонефритом характеризуютсяпоражениемвсехкомпартментов почек. Применение и азатиоприна, и соединения ВЛ-11-02 приводит к уменьшению выраженности структурных изменений гломерул, тубулярной альтерации, интерстициального гемосидероза, а также мононуклеарной инфильтрации. Применение соединения ВЛ-11-02 по сравнению с аза-тиоприном приводит к максимальному уменьшению мононуклеарной клеточной инфильтрации, исчезновению геморрагического синдрома и появлению тенденции к регенерации эндотелиоци-тов капилляров клубочков.
Исследование селезенки показало, что у животных, получавших и азатиоприн, и соединение ВЛ-11-02, снижается весовой индекс органа, процент фолликулов белой пульпы с реактивными центрами и повышается процент фолликулов, не имеющих реактивных центров. Размеры реактивных центров уменьшаются при обоих видах воздействия. Размеры периартериальных муфт (Т-зависимые зоны) имеют тенденцию к снижению. В группе, получавшей азатиоприн, средняя площадь этих структур оказалась достоверно меньше, чем у мышей, которым вводили соединение ВЛ-11-02 (таблица 1). Таким образом, и цитостатик (азатиоприн), и исследуемое соединение снижают активацию селезенки при экспериментальном аутоиммунном процессе. Вероятно, иммуносупрессия обусловливает уменьшение морфофункциональных нарушений в почках, в патогенезе которых ведущую роль играют иммунологические механизмы [1]. При этом соединение ВЛ-11-02 оказывает меньшее по сравнению с азатиоприном влияние на Т-зависимые зоны селезенки, что, возможно, связано с его меньшей токсичностью.
Заключение
Соединение ВЛ-11-02 проявляет иммуносуп-рессивные свойства в модели иммунокомплекс-
Таблица
Влияние азатиоприна и соединения ВЛ-11-02 на морфометрические параметры селезенки мышей
с иммунокомплексным гломерулонефритом
Параметр Контроль (M±m) Азатиоприн (M±m) Соединение ВЛ-11-02 (M±m)
Весовой индекс 7,98±1,87 3,79±0,43* 4,07±0,59*
Фолликулы с реактивными центрами (%) 68,18±7,4 16,16±2,19* 17,31±3,01*
Фолликулы без реактивных центров (%) 31,82±7,4 83,84±2,19* 82,69±3,01*
Площадь фолликулов (мкм2х103) 82,12±8,31 87,52±4,66 74,54±3,47
Площадь реактивных центров (мкм2х103) 20,2±2,60 14,26±13,03* 12,01±1,16*
Площадь периартериальных муфт (мкм2х103) 17,14±6,97 10,65±2,06 15,91±3,26#
Примечание: * — отличия от группы «контроль» достоверны прир<0,05; # — отличия от группы «азатиоприн» достоверны при р<0,05.
ного гломерулонефрита, который по своему патогенезу и клиническим проявлениям во многом аналогичен такой аутоиммунной патологии, как системная красная волчанка. Применение данного вещества уменьшает патологические проявления в почках и снижает активацию иммунной системы преимущественно на уровне В-клеточно-го звена. В целом по эффективности соединение не уступает широко используемому в клинической практике иммунодепрессанту азатиоприну, а в некоторых отношениях превосходит его.
The use of the derivative of indoliltiocarbonic acid (compound VL-11-02) as immunocorrector with the help of immunocomplex glomerulo-nephritis model
V.L. Limonov, A.V. Shurlygina, M.V. Robinson, N.G. Panteleeva, O.P. Kolesnikova,
S.V. Aidagulova, G.I. Nepomniashih, V.A. Trufakin Immunocorrective effect of the derivative of indoliltiocarbonic acid (compound VL-11-02) which has myelo- and immunodepressive properties has been investigated in mice’ kidney and spleen with
the experimental model of autoimmune pathology (as compared to traditional immunodepressant azo-thioprine). It has been found that azothioprine and compound VL-11-02 decreased proteinuria and pathomorphological features of renal pathology and spleen activation. It has been concluded that the efficacy of the compound VL-11-02 does not yield to azothioprine and surpasses it in some parameters.
Литература
1. Показатели эритро- и иммунопоэза в развитии аутоиммунных заболеваний, индуцированных хронической реакцией трансплантат против хозяина / О.П. Колесникова, О.Т. Кудаева, В.А. Логинов и др. // Вести. АМН СССР. — 1991. — № 12. — С. 13-16.
2. Appleby P. Murine chronic graft-versus-host disease as model of systemic lupus erythematosus: effect of immunosuppressive drugs on disease development / P. Appleby, D.G. Webber, J.G. Bowen // Clin. and Exp. Immunol.
— 1989. — Vol. 78. — № 3. — P. 449-453.
3. Kimura M. Depressed antibody responses to exogenous antigens in mice with lupus-like graft-versus-host diseases /M. Kimura, E. Gleichmann // Clin. Immunol. and Immunopathol. — 1987. — Vol. 43. — № 1. — P. 97-109.
