CC BY
29
12. Lamy Т., Bernar D., Fardel О., Amiot L., Grulois I., et al. // Brit. J. Haematol. -1998.-№100.-P.509-515.
13. McKenna S.L., Padua R.A. // Brit. J. Haematol. - 1997. - №96. - P.659-674.
14. Nbrgaard J. M., Bukh A., Langkjer S. T. et al. // Brit. J. Haematol. - 1998. - №100.
- P.534-540.
15. Pallis M., Rvssell N. H. // Brit. J. Haematol. - 1998. - №100. - P.194-197.
16. Pastan L., Gottesman M.M. // New Engl. J. Medic. - 1987. - №316. - P.1388-1393.
17. Raghu G., Park S.W., Roninson I.В., Metcheter E.B. // Experimental Hematology.
- 1996. - №24. - P. 1258-1264.
18. Weisburg J.H., Curcio M., Caron P.C. et al. // J. Experiment. Medic. - 1996. -№183. - P.2699-2704.
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ХЕЛИКОБАКТЕРНОЙ ИНФЕКЦИИ В ЖЕЛУДКЕ
H.A. Морозов
МОНИКИ
В первые годы после установления патогенетической роли бактерий рода Helicobacter в развитии хронического гастрита, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки морфологические методы изучения биопсийного материала использовались преимущественно с диагностической целью и быстро утвердились в качестве «золотого стандарта» обнаружения инфекта. Однако в последние годы они начинают терять свои позиции в связи с разработкой и внедрением неинвазивных методов диагностики.
В настоящее время существует большой набор диагностических методов, с высокой степенью надежности выявляющих наличие бактерий рода Helicobacter в желудке человека. Однако, за исключением морфологического и микробиологического методов, все другие способы верификации инфекции являются непрямыми. Они основаны на обнаружении продуктов метаболизма бактерий, их генетических характеристиках, либо на выявлении результатов взаимодействия бактерий с иммунной системой организма. Наиболее широко распространенным методом является уреазный тест биоптатов слизистой оболочки желудка, фиксирующий с помощью изменения окраски инкубационного раствора появление аммиака после расщепления мочевины бактериальной уреазой. На этом же свойстве бактерий основан дыхательный тест с использованием стабильных изотопов углерода, фиксирующий их наличие в выдыхаемом воздухе. Выявление генетических характеристик Helicobacter pylori (HP) осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции (PCR). Иммунологические методы верификации HP-инфекции основаны на обнаружении в сыворотке крови больных антигенных особенностей бактерий с помощью специфических или моноклональных антител. Все вышеперечисленные методы имеют достаточно высокую специфичность и надежность. Но каждый из них имеет не только свойственные им положительные черты, но и ряд существенных ограничений. Самым главным ограничением является сложность и высокая стоимость специальной ап-
паратуры и реактивов, что не позволяет широко их использовать в практическом здравоохранении России. Естественно, что эти ограничения не распространяются на уреазные тесты биопсийного материала, являющиеся достаточно быстрыми и надежными. Однако их широкое использование у нас тормозится отсутствием промышленного производства стандартных наборов. Широкому распространению микробиологических методов диагностики НР-инфекции препятствует отсутствие в большинстве наших лечебных учреждений микробиологических лабораторий.
В свете сказанного особое значение приобретает использование морфологических методов диагностики, позволяющих с высокой долей надежности установить наличие или отсутствие НР-инфекции в желудке пациентов. Это особенно важно при впервые диагностированной язвенной болезни, осложненной кровотечением, при которой чаще всего встречаются поражения, желудка, не ассоциированные с HP-инфекцией. В этом случае в диагностическом алгоритме, предопределяющем направление лечебных мероприятий, выявление бактерий HP приобретает ключевое значение.
Стандартный морфологический метод светооптического изучения гистологических препаратов предписывает вполне определенный способ обработки биопсийного материала, состоящий из фиксации в забуференном 10% растворе формалина, ориентации препарата и его заключении в парафин, приготовлении срезов и их окраски селективными красителями. Микроскопическое изучение материала позволяет не только обнаружить HP-инфекцию и охарактеризовать изменения структуры слизистой оболочки различных отделов желудка (атрофию, метаплазию и т.д.), но и оценить взаиморасположение инфекта и ткани, выраженность и активность воспалительной реакции. Для этих целей в настоящее время все более широкое применение находит визуально-аналоговая схема оценки, предложенная Dixon с соавт. (1996), использование которой значительно снижает субъективность оценки морфологических изменений. В этой схеме изображены эталоны полуколичественной оценки изменений структуры: степень обсеменения слизистой оболочки Н. pylori или Н. heilmannii (НН), нейтрофильной и мононукле-арной инфильтрации, стадий атрофии и кишечной метаплазии в слизистой оболочке фундального и антрального отделов желудка. При этом наиболее точная картина поражения может быть получена в случае изучения не менее 5 биоптатов: по два из антрального и фундального отделов и одного из области угла желудка.
При высокой степени обсемененности слизистой оболочки диагностика НР-инфекции не вызывает особых затруднений. Опытный патолог легко обнаружит бактерии HP и Н.heilmannii даже при рутинной окраске гематоксилином и эозином или толуидиновым синим. Однако для достижения более надежных морфологических критериев НР-инфекции следует воспользоваться окрасками по Гимзе или Грамму. Столь же хорошие результаты можно получить, используя метод импрегнации бактерий серебром по Warthin -Starry, хотя и считается, что выявляемость НР-инфекции при этом
почти на 25% ниже, чем при окраске по Гимзе или Грамму. Очень хорошие результаты с отличной визуализацией бактерий могут быть получены при использовании окраски акридиновым оранжевым и изучении срезов в люминесцентном микроскопе. В ряде лабораторий (например, у Ashley В. Price) в качестве рутинного используется метод окраски "Cresyl fast violet", являющийся быстрым (5-7 мин.), надежным и чувствительным способом обнаружения НР-инфекции.
В то же время, вышеуказанные способы обнаружения бактерий HP и НН надежно воспроизводятся лишь в случае высокой степени бактериальной обсемененности слизистой оболочки желудка. При низкой степени обсемененности на результаты гистологического исследования могут повлиять объективно существующие ограничения метода, связанные с чисто технологической проблемой отмывания слизи (зоны обитания инфекта) с люминальной поверхности ткани в процессе фиксации и обезвоживания биопсийного материала. В результате этого при оценке степени бактериальной обсемененности по гистологическому препарату могут быть получены заниженные или ложноотрицательные результаты, а при очень низкой, но сохранившейся после эрадикационных мероприятий степени обсемененности - и вовсе ошибочная уверенность в эффективности проведенного лечения. Ликвидировать этот недостаток можно при использовании кислых фиксаторов, например, Карнуа. Добавление к фиксатору уксусной кислоты или спирта делает слизь почти нерастворимой. Однако в этом случае, при достаточно хорошей сохранности слизи резко снижается качество фиксации самой слизистой оболочки, появляются артефакты в виде разрежения кариоплазмы и цитоплазмы, что существенно влияет на оценку глубины патологического процесса. Попытки предотвратить отмывание слизи и вымывание из нее бактерий путем укрывания биопсийного кусочка слоем агарового геля (1%) пока не увенчались успехом. Несмотря на получение в ряде случаев великолепной сохранности слизи и бактерий, не удалось достичь стабильной повторяемости метода. Очень часто происходит отслойка и потеря агаровой реплики вместе со слоем слизи, что объясняется различной степенью сжатия геля и ткани во время обезвоживания.
В последнее время нами и рядом зарубежных исследователей высказано мнение о том, что наиболее приемлемым способом диагностики HP-инфекции при низкой степени обсемененности и после эрадикационных мероприятий является изучение мазков-отпечатков (touch cytology, brush cytology) с биопсий слизистой оболочки. Действительно, этот метод является простым, быстрым (5 мин.), специфичным при окраске по Грамму и высокочувствительным. Выявляемая по мазку-отпечатку степень обсемененности слизистой оболочки HP-бактериями всегда существенно выше, чем в гистологическом препарате. Для количественной оценки этого параметра можно, как и при гистологическом исследовании, пользоваться шкалой, предложенной Л.И.Аруином: 0 - отсутствие бак-
терий HP в препарате, 1 - легкая степень (до 20 бактерий в отдельных полях зрения при увеличении 900-1000 раз), 2 - средняя степень (от 20 до 50 бактерий) и 3 - сильная степень (свыше 50 бактерий).
Изучение мазка-отпечатка позволяет легко обнаружить не только Н. pylori, но и другие бактерии рода Helicobacter - Н. heilmannii. В настоящее время достоверно доказано, что Н. heilmannii передается человеку от домашних животных (преимущественно от кошек) и так же как Н. pylori вызывает при определенных условиях патологические изменения в желудке. При всей схожести этих двух видов бактерий по ферментативному и токсинному спектру, Н. heilmannii отличается длиной (до 8 мкм), количеством изгибов бактериального тела (4-5) и, что самое главное, отсутствием перехода в кокковую форму. Именно это свойство предопределяет большую подверженность Н. heilmannii гибели при эрадикации по стандартным схемам. Ранее считалось, что вследствие бактериального антагонизма не может быть коинфекции HP и НН, а моноинфекция НН встречается только в 0,3-1% случаев. Однако имеющийся в нашем распоряжении биопсийный и цитологический материал от 60 взрослых больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и 112 детей с хроническим гастритом позволил установить, что, напротив, чаще встречается коинфекция. Helicobacter heilmannii был обнаружен у 20% взрослых пациентов и лишь в 3 случаях (5%) наблюдалась моноинфекция. У детей НН был обнаружен в 8 наблюдениях (7,1%), а моноинфекция этой бактерии лишь в 2 (1,8%).
С помощью мазков-отпечатков возможно динамическое наблюдение за характером HP-инфекции в желудке. Выявление степени обсемененности, появление кокковых форм, изменение локализации инфекта в отделах желудка позволяет обнаружить патоморфоз хронического гастрита во время медикаментозного лечения: при наличии у больного резистентного штамма бактерии и воздействии антикислотосекреторными препаратами инфекция перемещается в фундальный отдел с последующим развитием в нем признаков хронического гастрита. Мазок-отпечаток позволяет судить и об активности воспалительного процесса, когда в нем выявляется фагоцитарная активность нейтрофилов в отношении НР-бактерий, присущая лейкоцитам, вышедшим в просвет желудка за пределы эпителиального пласта. Подобные процессы крайне редко можно обнаружить в гистологическом препарате.
На сегодняшний день мы не можем рекомендовать однозначного подхода для морфологической диагностики HP-инфекции слизистой оболочки желудка. Несомненно, что гистологическое изучение биоптатов из фундального и антрального отделов обязательно для выявления патологического процесса, оценки выраженности и активности воспалительной реакции, обнаружения атрофии и метаплазии, а также для раннего обнаружения процессов малигниза-ции. Вместе с тем, гистологический препарат не позволяет качественно решить проблему диагностики HP-инфекции вследствие вышеуказанных ограничений метода. И если при первичной диагно-
стике дуоденальной язвы можно пренебречь необходимостью выявления инфекта (поскольку при этой патологии HP встречается в 96-98% случаев), то при оценке эффективности эрадикации, а также при хроническом гастрите и язве желудка выявление бактерий всеми имеющимися в распоряжении врача способами следует считать обязательным. В этом случае наиболее предпочтительным является метод цитологического изучения мазков-отпечатков с биоптатов с окраской по Грамму.
Другим аспектом морфологических проблем инфекции Helicobacter pylori является изучение взаимоотношений бактерий с элементами своей экологической ниши - пристеночной слизью и апикальной поверхностью эпителиоцитов слизистой оболочки желудка. Эти исследования имеют фундаментальный характер и направлены на выяснение патогенетических механизмов развития заболеваний, ассоциированных с инфекцией бактерий рода Helicobacter.
Установлено, что одна из протеаз, вырабатываемых HP, обладает муциназной активностью. На этом основании считается, что инвазия бактерий может приводить к деградации защитного слоя слизи в желудке и за счет дестабилизации муцинов к снижению его вязкости. В дополнение к этому, бактериальная фосфолипаза может вызывать деградацию фосфолипидов слизи и снижению гид-рофобности слизистого слоя. Однако прямых структурных подтверждений всем вышеуказанным феноменам получено не было. При изучении биопсийного материала не отмечается ни зоны лизиса муцина вокруг бактериальных тел, ни достоверного уменьшения толщины слизистого слоя. Видимо, энзиматические воздействия на слой слизи не носят драматического характера, а имеют, скорее всего, физиологический (для бактерий) смысл, локально снижая вязкость слизи и облегчая, тем самым, условия передвижения бактерий в этом слое.
Дистантное патогенное влияние Helicobacter pylori непосредственно на эпителий слизистой оболочки желудка, по-видимому, ограничено. В пользу этого свидетельствуют факты обнаружения этих бактерий у лиц без желудочной патологии. Вместе с тем, пер-систирование бактерий в слое слизи без контакта бактериальных тел с поверхностным эпителием невозможно. Следовательно, при инвазии HP желудка человека развитие патологии предопределяется наличием определенных характерных особенностей, как бактерий, так и макроорганизма, а патогенное воздействие микробов может проявляться после их непосредственного контакта с эпите-лиоцитами слизистой оболочки. Этот контакт осуществляется посредством специфического рецепторного взаимодействия. Однако не у всех инфицированных в дальнейшем развиваются хеликобак-терассоциированные заболевания, так как экспрессия мембранных рецепторов адгезии у индивидуумов различна. Например, люди с группой крови 0(1) экспрессируют рецепторы в большем количестве, чем пациенты с группой крови AB (IV), чем объясняется их большая предрасположенность к язвенной болезни. Степень по-
17 Альманах клинической медицины том 2
257
вреждения слизистой оболочки гастродуоденапьной зоны и клиническая симптоматика также зависят от степени экспрессии различных бактериальных факторов HP. Определенные штаммы этих бактерий (тип I) экспрессируют специфический ген - Сад А (cytotoxin-associated gene) и продуцируют цитотоксический протеин с молекулярной массой 120 kDa. Этот белок является маркером более вирулентных штаммов HP. Тип I (в отличие от типа II) содержит 94 kDa Vac А - вакуолизирующий токсин, который в сочетании с Сад A-протеином вызывает более интенсивное воспаление слизистой оболочки желудка. Этот штамм HP встречается примерно у 70% больных дуоденальной язвой и только у 30% больных неязвенной диспепсией. Инфекция данным штаммом ассоциируется с усиленной секрецией эпителиальными клетками интерлейкина-8, который играет ключевую роль в хеликобактериндуцированном воспалении слизистой оболочки желудка.
При электронно-микроскопическом исследовании можно наблюдать различные варианты взаимодействия HP с поверхностью эпителиоцитов. Hessely и соавт. (1990) выделяет 3 вида контактов. I - прилипание бактерий к пьедесталу с блюдцеобразным углублением апикальной мембраны эпителиоцита; II - погружение бактерий в выемку на поверхности эпителиальной клетки и III - примыкание бактерий к апикальной поверхности эпителиоцита, лишенной микроворсинок. Результатом этих взаимодействий считают нарушение субмикроскопического строения эпителиальных клеток: появление разрывов мембран, деградация митохондрий, образование цитоплазматических вакуолей. На основании обнаружения подобных нарушений при отсутствии непосредственного контакта клеток с HP иногда делаются выводы о возможном «дистантном» влиянии микроорганизмов на эпителиоциты. Однако на том же основании можно придти и к прямо противоположному заключению об адгезии бактерий к клеткам с признаками инволютивных изменений. В пользу подобного утверждения свидетельствуют картины адгезии бактерий на апикальной поверхности эпителиоцитов с абсолютно нормальной ультраструктурой. По-видимому, в данном вопросе выяснение причинно-следственных связей дело будущих исследований.
Noach L. и соавт.(1993) выделяют пять вариантов взаимодействия бактерий с эпителием слизистой оболочки желудка: I - адгезия к пьедесталу на мембране эпителиоцита, II - адгезия с вдавлени-ем мембраны, III - приграничная адгезия без пьедестала или вдавления, IV - адгезия с расплавлением мембраны и V - интер-нализация бактерий в цитоплазму эпителиоцита.
В электронном микроскопе отчетливо видно, что большинство бактерий чаще всего образуют межгликокаликсные связи с клеточной мембраной, то есть сорбированы на поверхности без каких-либо вдавлений в цитоплазму клетки. Однако имеются еще два типа взаимоотношений между Helicobacter pylori и эпителиоцитом. Иногда наблюдается активное вдавление терминального конца бактерии в клетку без разрушения клеточной мембраны с сохране-
нием межгликокаликсных связей. Подобный процесс чаще отмечается при инфекции Helicobacter heilmannii. Другой тип взаимоотношений - это плотный контакт бактериальной обольчки и клеточной мембраны с их слиянием. В подобных случаях следовало бы ожидать какой-либо реакции со стороны цитоплазмы клетки, как это бывает при инфекционных процессах в желудочно-кишечном тракте. Однако, как правило, мы подобной реакции не наблюдаем. Во всяком случае, не отмечается морфологических признаков непосредственного действия вакуолизирующего и других бактериальных токсинов на цитоплазму эпителиоцитов. Подобные же возражения возникают при анализе демонстрируемых картин внутриклеточной интернализации бактерий, которые вызваны определенной ориентацией среза, прошедшего через бактериальное тело, частично вдавившее клеточную оболочку в цитоплазму.
Следует упомянуть и еще об одной форме взаимодействий HP со слизистой оболочкой желудка. Это инвазия бактерий в собственную пластинку путем проникновения микроорганизмов по межклеточным пространствам. Подобные картины наблюдались нами и другими исследователями в случае значительного угнетения общего иммунитета в результате заражения вирусом иммунодефицита или при гнойной инфекции вне органов желудочно-кишечного тракта.
Однако HP относится к неинвазивным микроорганизмам и его патогенное влияние, скорее всего, проявляется не в результате прямого воздействия на слизистую оболочку. В настоящее время доказано, что антигены HP (в первую очередь - липополисахари-ды), всасываясь или проникая во внутреннюю среду, вызывают иммунную реакцию с инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки иммунокомпетентными клетками, в том числе и макрофагами. Вырабатываемые последними цитокины привлекают и стимулируют нейтрофилы. Однако подобная защитная антимикробная реакция приводит не к разрушению микроорганизмов, а к повреждению ткани и ее микроциркуляторного русла. Нарушение микроциркуляции и угнетение трофики слизистой оболочки являются, по-видимому, основным структурным выражением патогенного воздействия HP и, в конечном счете, приводят к язвообразова-нию.
Язвообразованию способствует и стимуляция HP апоптоза -запрограммированной клеточной гибели, усиливающейся при хе-ликобактерной инфекции в несколько раз. Такое усиление не только играет важную роль в инициации образования язвенного дефекта, но и, видимо, влияет на процесс хронизации болезни, поскольку замечено, что в зоне пролиферирующего эпителия, закрывающего язву, прирост апоптозов в 10 раз превышает прирост вновь образующихся клеток. В этом одна из причин более медленного заживления язвенных дефектов при отсутствии эрадикации инфекции HP.
