CC BY
45
удк
морфологические особенности процессов регенерации ран при лечении коллаген-хитозановыми и желатин-хитозановыми губками
С.Ф. Антонов 1, Б.А. Парамонов2, Б.А. Никонов 1, Т.Ш. Нугаев2, Н.В. Золина 1,
И.Л. Потокин 1, Я.Г. Свиридов 1, Н.А. Абрамов2
1 ГНИИ особо чистых биопрепаратов,
2 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия
morphological characteristics of regeneration after using collagen-chitosan and gelatin-chitosan sponges
S. Antonov 1, B. Paramonov2, B. Nikonov 1, T. Nugaev2, N. Zolina 1,I. Potokin 1, Y. Sviridov 1, N. Abramov 2 1 Research Institute of HPB, Saint-Petersburg, Russia
2 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2012
Проведённое клинико-экспериментальное исследование гистологических и цитологических особенностей ран при лечении коллаген-хитозановыми и желатин-хитозановыми губками позволяет сделать вывод, что ранозаживляющая эффективность коллаген-хитозановых губок «Хитоскин» и желатин-хитозановых губок примерно одинаковая и существенно превышает ранозаживляющую эффективность губок «Комбутек-2». Изученные губочные раневые покрытия могут эффективно использоваться для эпителизации ран и трофических язв.
ключевые слова: раневое ложе, ранозаживляющая активность, коллаген-хитозановые и желатин-хитозановые губки, грануляционная ткань.
After studing histological and cytological wound features we can make a conclusion, that woundhealing effectiveness of collagen-chitosan («Chitoskin») and gelatin-chitosan sponges are approximately identical and much higher than woundhealing effectiveness of «Kombutek» sponges. These sponge wound dresses have high healing effectiveness and can be used in wound treatment.
Key words: wound bed, woundhealing activity, collagen-chitosan and gelatin-chitosan sponges, granulation tissue.
Разработка препаратов для местного лечения ран и трофических язв является одной из актуальных задач хирургии. Одной из лекарственной форм таких препаратов являются раневые покрытия. Наиболее перспективно использовать губочные раневые покрытия, в состав которых включено лекарственное вещество [1].
Для раневых покрытий лучше всего подходят природные биодеградируемые полимеры - коллаген, желатин и хитозан [2]. Они дешевы, био-совместимы, легко усваиваются организмом, совместимы с большинством лекарственных веществ, к тому же их природные источники неограниченны. В ходе первичной переработки коллагенового и хитозанового сырья практически полностью устраняется их антигенность. Коллаген проявляет стимулирующее действие на репарационные процессы в основном на пер-
вой стадии раневого процесса, тогда как в последующем он тормозит заживление вследствие образования пленки с низкой воздухопроницаемостью. Хитозан, помимо стимулирования пролиферации на первых стадиях, очень полезен на завершающей фазе заживления - перестройке рубца (его присутствие в ране помогает избежать образования грубых рубцов) [3, 4]. Хитозан хорошо проводит воздух к заживляемой поверхности. Смешанная полимерная матрица позволяет использовать достоинства обоих биополимеров. Таким образом, раневые покрытия на основе хитозана, коллагена и желатина представляют больной практический интерес в современной хирургии.
цель исследования - изучить гистологические и цитологические особенности ран при лечении коллаген-хитозановыми и желатин-хитозановыми губками.
Материал и методы
Клинико-экспериментальное исследование проведено на белых крысах, полученных из питомника «Рапполово» (пос. Рапполово, Ленинградской обл.). Животных выдерживали в карантине 2 недели до начала экспериментов. Эксперименты выполнены на взрослых З0 крысах - самцах массой 250-270 г.
Исследовали следующие виды губок:
- коллаген-хитозановые губки «^итожин» (пр-ва ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург);
- желатин-хитозановые губки (пр-ва «Sangui Bio Tech Gmbh» Germany), серия 243 54, 2004;
- губки «Комбутек-2» (пр-ва «Лужского завода “Белкозин”», Луга, Ленинградская область). Эта губка, помимо коллагена, содержит хинозол, борную кислоту и TWEEN-80).
Анестезия смесью калипсола и дроперидола (70 и 1 мг/кг веса соответственно). В области спины вырезали кожу (до фасции) размером 2,0x2,0 см. Накладывали тонкие пластиковые пластинки, которые подшивали к краю кожной раны и к фасции узловатыми швами. На раны накладывали следующие препараты: «Комбутек-2» (К); коллаген-хитозановые губки ^XT) и желатин-хитозановые губки (ЖXГ). Перед аппликацией губки предварительно смачивали физиологическим раствором 0,9% р-ром NaCl. Поверх губок накладывали стерильные салфетки, которые фиксировали швами к коже. Смену повязок осуществляли в следующие сроки: на 3-е, 5-е, 10-е, 15-е, 20-е сутки и далее через
3 дня до завершения заживления.
Морфологические исследования выполнены в лаборатории электронной микроскопии НИИ особо чистых биопрепаратов. Биоптаты тканей для светооптической микроскопии фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина с последующей проводкой через спирты восходящей концентрации и заливкой в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином-эозином (обзорные препараты), по Ван-Гизону (для оценки коллагеновых волокон) и толуи-диновым синим (для визуализации кислых му-кополисахаридов). Фотографирование проводили на микроскопе с фотонасадкой «Opton» (Германия). Для ультраструктурных исследований биоптаты фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида в буферном р-ре Xенк-са в течение 1-2 часов при +4°С, промывали, постфиксировали в 2% растворе OsO4 в течение 10-12 часов при той же температуре. Дегидра-
тацию материала осуществляли в этаноле восходящей концентрации (40-100%). Уплотнение исследуемого материала проводили в смеси Эпон-812/аралдит по общепринятой методике. Ультратонкие срезы изготовляли на ультрамикротоме <^КВ» (Швеция), контрастировали уранил-ацетатом, спиртовым раствором и солями свинца по Рейнольдсу, после чего исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе <<|ет-100с» (Япония).
Цитологические исследования: с поверхности раны при помощи стерильного ватного шарика предварительно снимали гной (но не верхний лейкоцитарный слой). Поверхностью стерильного стекла прикасались к ране. Фиксацию препаратов проводили в метиловом спирте в течение 5 минут, после чего проводили окрашивание азур-эозином, гематоксилин-эозином и по методу Романовского. Учет цитограмм проводили отдельно по различным видам клеток. Использовали полуколичественный метод оценки цитограмм.
результаты и их обсуждение
Данные клинико-экспериметального исследования показали, что на 2-е сутки в контроле (губка «Комбутек-2») раны были покрыты рыхлым красновато-коричневым струпом, легко отделяющимся от подлежащих тканей с обильным серозно-фибринозным отделяемым. В опытных группах (КХГ и ЖХГ) губки были истончены и несколько уплотнены, их площадь несколько сократилась. Губки плотно прилегали к дну ран. После их удаления на нижней поверхности губок был виден присохший к ней местами экссудат. На ранах имелось небольшое количество серозно-фибринозного экссудата. На 5-е сутки при применении «Комбутек-2» имела место воспалительная реакция. В мазках-отпечатках -наличие бесструктурных масс, нитей фибрина, фрагментов клеток, деформированных эритроцитов, среди которых встречаются нейтрофиль-ные лейкоциты в стадии распада. Фагоцитоз был выражен слабо. В большом количестве определялись свободно лежащие микроорганизмы. Особенностями являлось большое количество дистрофически измененных клеток и отсутствие полибластов и соединительнотканных элементов. На 5-е сутки в опытных группах в отличие от контроля было существенно большее количество макрофагов. Появились полибласты (округлые клетки с крупным светлым ядром, имеющим ядрышки). В мазках отмечено появление юных фибробластов. В мазках
было относительно мало микроорганизмов, много нейтрофильных лейкоцитов, цитоплазма которых содержит микроорганизмы и другие включения, что указывает на активную защитную реакцию организма. При анализе срезов на 5-е сутки в контроле струп состоял из 2-х слоев. Наружный слой был сформирован, главным образом, из высохшего раневого покрытия и экссудата, представляющего собой бесструктурную массу и включающую в себя обломки клеток. Нижний слой состоял, в основном, из омертвевшей ткани, нейтрофильных лейкоцитов и гемо-лизированных эритроцитов. Встречались макрофаги с «пенистой структурой» (фагосомами), отдельные тучные клетки. Сплошного слоя грануляций не было. Грануляционная ткань была выражена, главным образом, по краям раны. Можно сделать вывод о том, что аппликация губки «Комбутек-2» обусловила высыхание определенного слоя ткани. На расстоянии 0,1—0,3 мм от краев раны отмечена регенерация эпителия в виде небольших, относительно тонких пластов новообразовавшихся эпителиальных клеток, растущих под струп на раневую поверхность.
При применении КХГ и ЖХГ была более развита грануляционная ткань, которая в отличие от контроля занимала почти весь раневой дефект. Источником роста грануляционной ткани в центре являлась фасция. Максимально грануляционная ткань была развита по краям раны, что, по-видимому, можно объяснить лучшим кровоснабжением. В грануляционной ткани было большое количество фибробластов, часто встречались клетки с митозами. Формирующиеся сосудистые петли имели вертикальную направленность, что свидетельствовало о хорошем кровоснабжении ткани (направление перпендикулярное в поверхности раны); в межклеточном веществе имелось значительное количество коллагеновых волокон. Грануляционная ткань состояла из веретенообразных клеток, между которыми располагаются коллагеновые волокна, которые окрашиваются в красный цвет по Ван-Гизону, что свидетельствует об их относительной зрелости. В грануляционной ткани отмечено скопление кислых гликозаминогликанов, выявляющихся окраской толуидиновым синим. Обращала на себя внимание отчетливо выраженная регенерация эпидермиса. Эпителиальный пласт со всех сторон распространился на расстояние 2-3 мм. Вместе с тем, связь клеточного пласта с подлежащими тканями была слабая. Местами имеет место прорастания эпителиального пласта по губку и под поверхностный струп.
В некоторых местах отмечено прорастание грануляционной ткани в губки. В этих местах особенно интенсивно идет резорбция губки, остатки перегородок губки истончены и окружены клетками различного типа, среди которых много макрофагов и нейтрофильных лейкоцитов.
На 10-е сутки отмечена интенсивная регенерация. В мазках-отпечатках из ран у контрольных животных основной клеточный состав - это нейтрофильные лейкоциты, фагоцитоз выражен относительно слабо, бактериальная флора обильная. Встречаются относительно редкие по-либласты и фибробласты. Имеются скопления нитей фибрина, бесструктурные массы различной величины, обрывки цитоплазмы и ядер распадающихся гранулоцитов. Под губками КХГ и ЖХГ раневая поверхность чистая. В мазках-отпечатках отмечено уменьшение количества нейтрофильных лейкоцитов. Вместе с тем, ней-трофилы активно занимаются фагоцитозом.
Результаты цитологического анализа подтверждаются гистологическим исследованием. В контроле раневой дефект целиком заполнен грануляционной тканью, степень зрелости которой повышалась от центра ран к ее краям и от поверхности ко дну. В ткани преобладают волокна коллагена, между которыми располагаются фибробласты. В ткани относительно мало нейтрофильных лейкоцитов, вместе с тем, по сравнению с предшествующим сроком исследования увеличилось количество макрофагов и лимфоцитов. Эпителий выглядит как более зрелый и дифференцированный.
В пробах ткани из ран, где лечение проводилось с использованием губок, отмечено следующее. Степень зрелости гранулирующей ткани примерно одинаковая в центре и по периферии ран. В глубоких слоях в грануляционной ткани волокнистые элементы преобладают над клеточными. Выявляются волокна, имеющие горизонтальную направленность. Меньше выражена нейтрофильная инфильтрация ткани.
На 15-е сутки при цитологическом исследовании в группе, где применяли губку «Комбутек-2» по сравнению с предшествующим сроком наблюдения уменьшилось количество нейтрофильных лейкоцитов, микроорганизмов. Одновременно увеличилось количество фибро-бластов. При использовании КХГ и ЖХГ количество фибробластов в мазках-отпечатках было существенно большим.
В сроки позднее 15 суток степень зрелости грануляционной ткани при использовании гу-
бок КXГ и ЖXГ примерно одинаковая в центре и по периферии. Вместе с тем, в глубоких слоях грануляционная ткань созревала быстрее, что было заметно, в частности, по степени зрелости ее волокнистой части. Так, уже в эти сроки были выявлены волокна, имеющие горизонтальную направленность. Восстановленный эпидермис выглядел как вполне зрелый.
В более поздние сроки наблюдения во всех исследуемых пробах происходило возрастание зрелости соединительной ткани, продолжался процесс краевой эпителизации ран. Наблюдение продолжалось до 15 суток течения раневого процесса.
Выводы
Проведённое клинико-экспериментальное исследование показало, что ранозаживляющая эффективность коллаген-хитозановых и желатин-хитозановые губок примерно одинаковая и существенно превышает ранозаживляющую эффективность губок «Комбутек-2». Все изученные губочные раневые покрытия показали свой высокий лечебный потенциал и могут эффективно использоваться для эпителизации ран и трофических язв.
Литература
1. Фельдштейн, М.М. Химия и технология медико-биологических полимеров / М.М. Фельдштейн, В.С. Якубович, Л.П. Рас-кина, Т.Т. Даурова // Итоги науки и техники. -М. : ВИНИТИ0, 1981. - № 16. - С. 67-120 (Химия и технология высокомолекулярных соединений).
2. Kabiri, M. Preparation and characterization of absorbable hemostat crosslinked gelatin sponges for surgical applications / M. Kabiri, S.H. Emami, M. Rafinia, M. Tahriri // Current Applied Physics. -2011. - Vol. 11, Issue 3, May. - P. 457-461.
3. Иванова, Л.А. Коллаген в технологии лекарственных форм / Л.А. Иванова, И.А. Сы-чеников, Т.С. Кондратьева. - М. : Медицина, 1984. - С. 87-91.
4. Воздействие хитозана на ультраструктуру клеток патогенных и условно патогенных микроорганизмов / В.М. Бондаренко, О.В. Ры-бальченко, Н.Б. Вербицкая, С.Ф. Антонов // Материалы VIII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (13-17 июня) : тез. докл. - Казань, 2006. - С. 175-179.
Т.Ш. Нугаев
Тел.: +7-911-037-31-62
e-mail: [email protected]
