CC BY
148
© Т. А. ГРИШКИНА, 2012 УДК 616.993.192.-078
Т. А. Гришкина
морфологические особенности микроскопических грибов рода coccidioides
волгоградский государственный технический университет министерства образования и науки РФ
Исследованы морфологические особенности микроскопических грибов рода Coccidioides при культивировании на питательных средах. Показано, что мицелиальная форма возбудителей кокцидиоидомикоза характеризуется значительным полиморфизмом макро- и микроморфологических признаков на различных этапах развития агаровой культуры, но C. immitus и C. Posadasii не имеют видовых различий. Изучена динамика развития кокцидиоидомикозных штаммов в микрокультурах и интенсивность спорообразования, определены форма и размеры артроконидий.
Ключевые слова: Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, возбудители кокцидиоидомикоза, мицелиальная форма, микрокультура, артроконидии
T.A. Grishkina
THE MORPHOLOGIC CHARACTERISTICS OF MICROSCOPIC FUNGI OF GENUS COCCIDIOIDES
The morphologic characteristics of microscopic fungi of genus Coccidioides under cultivation in nutrient mediums are studied. It is demonstrated that filamentous form of agents of coccidioidomycosis is characterized by .significant polymorphism of macro- and micromorphologic signs on different stages of development of agar culture. But C. immitis and C. posadasii have no species' differences. The dynamics of development of coccidioidomycosis strains in microcultures is analyzed as well as the intensity of sporification. The forms and sizes of arthroconidiae are also established.
Key words: Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, coccidioidomycosis agent, filamentous form, microculture, arthroconidiae
Кокцидиоидомикоз (кокцидиоидная гранулема, болезнь Посадас - Вернике) - эндемическое заболевание для целого ряда штатов США, стран Центральной и Южной Америки, северных областей Мексики, Гватемалы, Венесуэлы, Аргентины, Парагвая, Гондураса [12]. Единичные случаи кокцидиоидомикоза описаны в Европе [3]. В нашей стране наблюдалось 50 случаев заболевания (Санкт-Петербург, Москва, Владимирская область, Амурская область), однако ни один из них не был подтвержден выделением культуры возбудителя. Описаны отдельные случаи заболевания кокцидиоидо-микозом работников лабораторий [4, 6]. По данным внутри-кожной аллергической пробы и результатам серологических реакций, в США инфицировано кокцидиоидомикозом около 10 млн человек и ежегодно заболевает 100 тыс. человек [12]. Расширение международных контактов обусловливает необходимость знакомства практических врачей с особенностями диагностики данного заболевания.
Возбудитель заболевания Coccidioides immitis впервые был выделен в чистой культуре В. Офюсом и Х. Моффитом в 1900 г [11] и до недавнего времени был представлен единственным таксоном (видом). Определение видовой принадлежности микроскопических грибов, в том числе рода Coccidioides, основано главным образом на морфологической (фенотипической) характеристике возбудителя, поскольку ни биохимические свойства ни состав антигенов не являются строго специфичными. Поэтому практические микологи чаще всего изучают макро- и микроморфологию. Вместе с тем в 1994 г C. Zimmermann и соавт. [13] с помощью рестрикци-онного анализа показали, что данный вид грибов различается по нуклеотидному составу хромосомной ДНК и может быть разделен на две генетические группы. Дальнейшие исследования в этом направлении подтвердили полученные ранее
Для корреспонденции:
Гришкина Татьяна Александровна, канд. мед. наук, доц. каф. промышленной экологии и безопасности жизнедеятельности Адрес: 400005, Волгоград, пр. Ленина, 59/65 Телефон: (8442) 23-16-80 E-mail: tatyana@ovel.ru
результаты, и на основании исследования микросателлитных последовательностей 12 ядерных локусов микроскопические грибы рода Coccidioides были разделены на две генетические группы. Они были обозначены как штаммы калифорнийского и некалифорнийского типа [9]. Последние с 2002 г. выделены в самостоятельный вид Coccidioides posadasii [10], т. е. показано раздельное формирование филогенетических ветвей С. posadasii и С. гтт^.
Возбудители кокцидиоидомикоза относятся к диморфным грибам, различающимся по структурной организации сапрофитической, мицелиальной (природной) и паразитической форм.
Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей макро- и микроморфологии мицелиальной формы возбудителей кокцидиоидомикоза в процессе культивирования на плотных питательных средах.
Материалы и методы. В работе использованы 25 культур возбудителей кокцидиоидомикоза единственной в Российской Федерации коллекции микроскопических грибов II группы патогенности из фонда Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. По генотипу 15 штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза соответствовали виду posadasii, а остальные 10 - гтт^ [5-7].
Изучение макроморфологии мицелиальных культур Сос-cidioides spp. проводили путем высева взвесей грибов на ага-ризованную среду Сабуро. Посевы культивировали при 28°С в течение 4 нед и характеризовали по таким показателям, как скорость роста, выраженность воздушного мицелия, морфология колоний и их окраска.
Исследование структурной организации Сoccidioides spp. проводили путем выращивания штаммов в микрокультурах в нашей модификации. Для этого мицелий исследуемых 4-недельных штаммов смывали 0,15 М №С1 рН 6,8-7,0. Полученные суспензии фильтровали через тканевые фильтры для освобождения от мицелиальных фрагментов. Фильтраты с артроконидиями (артроспорами) разводили для получения взвеси, соответствующей 5 ЕД оптического стандарта мутности (ОСМ) ГИСК им. Л. А. Тарасевича. В стерильную пробирку вносили 0,1 мл взвеси и 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°С агара Сабуро, быстро перемешивали
Таблица 1
Размеры артроконидий Coccidioides spp.
Штаммы Coccidioides sPP. Длина, мкм Ширина, мкм Форма артроконидий (ширина/длина) Количество штаммов
Coccidioides posadasii
А-1 7,2 ± 0,12 5,0 ± 0,3 1:1,4 3
36 5,4 ± 0,63 3,8 ± 0,22
51 6,4 ± 0,82 4.6 ± 2,06
М-11 4,1 ± 0,32 2,4 ± 0,21 1:2,0 4
24 4,5 ± 1,05 2,6 ± 0,84
7/86 4,2 ± 0,38 2,2 ± 0,5
В-475 6,2 ± 0,19 3,4 ± 0,31
В-13 11,0 ± 2,4 3,2 ± 0,41 1:3,0 2
442 12 ± 0,71 3,6 ± 0,29
22 10,4 ± 0,72 2,8 ± 0,43
30 883 9,0 ± 1,22 2,6 ± 0,36 1:4,0 4
36 794 8,8 ± 0,92 2,0 ± 0,19
95 271 10,6 ± 0,37 3,0 ± 0,49
27 567 9,2 ± 0,56 1,8 ± 0,32 1:5,0 2
37 686 5,2 ± 0,725 3,4 ± 0,84
Coccidioides immitis
46 4,1 ± 0,19 2,2 ± 0,5 1:2,0 1
С-5 9,0 ± 0,34 3,6 ± 0,64 1:3,0 2
5960 11,8 ± 0,32 4,0 ± 0,27
158 11,4 ± 2,04 3,0 ± 0,16 1:4,0 4
441 12,4 ± 0,71 2,8 ± 0,64
30 881 11,5 ± 0,50 2,7 ± 0,29
333 13,4 ± 0,72 3,6 ± 0,64
34 10,4 ± 0,42 2,2 ± 0,63 1:5,0 3
46-Р 9,3 ± 0,71 1,9 ± 1,21
46-Н 6,6 ± 0,31 1,4 ± 0,163
Рис. 1. С. гтт^ С-5 на агаре Сабуро (4-е сутки).
и выливали в стерильные чашки Петри. После застывания агаровые пластинки разрезали на фрагменты размером 10 х 10 мм, которые с соблюдением правил асептики переносили на предметное стекло и накрывали покровным стеклом. Готовые препараты помещали в чашки Петри. Микрокультуры выращивали при температуре 28°С в течение 3 нед. Обеззараживание препаратов проводили 10% раствором формалина, экспозиция составляла 24 ч. Динамику развития гриба
Таблица 2
интенсивность образования артроспор у двух видов кокцидиоидомикозного гриба
Штаммы Coccidioides spp. Количество штаммов (possadasii/ immitis) Количество артроконидий в стандартных взвесях, КОЕ/мл
С. posadasii С. immitis
442 - 1/0 2 • 106
М-11, В-13, 22, С-5, 158, 46, 6/5 1-7 • 105
51, 36, 36794 46-Н, 333
А-1, 24, 37686, 34,30881 4/2 1-5 • 104
95271
7/86, В-475, 46-Р, 5960, 441 4/3 1-8 • 103
27567, 30883
Рис. 2. Микрокультура С. immitis С-5 (5-е сутки).
х 100.
оценивали с помощью световой микроскопии нативных препаратов при увеличении в 100, 400 раз. Определение размеров структурных элементов мицелия проводили с помощью окулярного винтового микрометра МОВ-1-15х при линейном увеличении в = 46,375.
Интенсивность образования артроспор в культурах Сос-cidioides spp. исследовали с помощью культурального метода. Для этого штаммы выращивали на плотной среде Сабу-ро в течение 3 нед, затем смывали 0,15 М №С1 рН 6,8-7,0 и готовили взвеси, соответствующие 5 ЕД ОСМ. Взвеси фильтровали через тканевой фильтр, фильтрат, содержащий артроспоры, титровали и высевали по 0,1 мл из соответствующих разведений на чашки со средой Сабуро. Культивирование посевов проводили при 28°С, результаты учитывали на 5-е сутки.
Результаты и обсуждение. Визуально начало роста у большинства исследованных штаммов отмечали на 2-3-и сутки после посева. Засеянная поверхность агара начинала мутнеть, местами слегка приподнимаясь, затем на этих участках появлялся легкий восковидный влажный налет. В этот период, как показали дальнейшие исследования, происходило прорастание артроконидий и образование зародышевых трубочек. К 4-м суткам помутневшие участки агара, как правило, увеличивались в размере, сливались, и на них можно было видеть нежный воздушный мицелий белого, серого, кремового цвета (рис. 1). Однако у некоторых штаммов (С. гтт^ 5960, С. posadasii 27567) появление видимого роста наблюдалось в более поздние сроки на 5-7-е сутки. К 11-м суткам культивирования высота воздушного мицелия увеличивалась до 1 мм, он приобретал вид пушистой ваты или имел бархатисто-мучнистый вид. К 3-й неделе мицелий подсыхал и становился мучнистым, высота его уменьшалась,
Рис. 3. Микрокультура C. immitis C-5 (14-е сутки).
X 400.
Рис. 4. Микрокультура C. immitis C-5 (21-е сутки).
X 400.
Рис. 5. Микрокультура C. immitis 46-Р (14-е сутки).
X 400.
в этот период, по описанию М. Fiese [8], происходит максимальное образование артроконидий.
В процессе сохранения культур через 3 мес мицелий в ряде случаев становился складчатым (С. immitis С-5, 46, 46-Р, 46-Н, 158, 5960, 30881, С. posadasii М-11, 51, 442, В-475, 27567, 95271,) или даже кожистым. Примечательно, что небольшая часть штаммов С. immitis (46, 46-Р, 46-Н) продуцировала розовый пигмент, который отмечался лишь в весенний период, но не в другое время года. Анализ данных показал, что культуры Coccidioides spp. различались по морфологии: форме и окраске колоний с сезонными изменениями, характеру воздушного мицелия, а также скорости роста на агаровых средах.
Рис. 6. Микрокультура С. 158 (14-е сутки).
х 400.
Известно, что характерной особенностью мицелиальной формы возбудителей кокцидиоидомикоза является то, что она представлена ветвящимися гифами, состоящими из клеток прямоугольной формы, которые в дальнейшем дифференцируются на артроконидии, перемежающиеся клетками-разделителями. В процессе развития мицелий распадается с образованием свободных артроконидий бочкообразной или цилиндрической формы с "усиками", расположенными по углам артроспоры, являющимися обрывками клеток разделителей [11]. Изучение динамики развития микрокультур Сoccidioides 8рр. показало, что начиная со 2-х суток наблюдалось прорастание покоящихся артроконидий с образованием слегка извитых ростовых трубочек, которые в дальнейшем преобразовывались в гифы штамма, имевшие вид тонких полупрозрачных нитей различной степени ветвления. Затем их толщина увеличивалась, появлялись перегородки (септы) и субстратный мицелий приобретал вид бамбуковой палочки (рис. 2). Далее, к 7-м суткам, начиналась дифференцировка клеток мицелия. Отчетливо выделялись клетки, переходящие в артроконидии. В их цитоплазме просматривались уплотнения серо-голубого цвета, напоминающие клеточное ядро, у отдельных штаммов можно было наблюдать до трех таких образований. Клетки, переходящие в артроспоры, перемежались клетками-разделителями, имевшими несколько меньшие размеры. К 14-м суткам в микрокультурах формировались цепочки из артроспор (рис. 3), а к 21-м суткам начинался их распад на более короткие фрагменты и одиночно лежащие артроспоры (рис. 4).
Исследованные культуры возбудителей кокцидиоидомико-за соответствовали общим представлениям о структурной организации мицелиальной формы представителей рода Сoccid-ioides, но, безусловно, следует отметить штаммовые различия по степени разветвленности мицелия и его диаметру (рис. 5, 6), а также по форме и размерам артроконидий (табл. 1).
Артроконидии, являясь обязательными структурными элементами, у разных штаммов различались как по размеру, так и по форме клеток. В целом размеры определены в следующих пределах: длина 4,1-13,4 мкм, ширина 1,4-5,0 мкм. У большинства культур клетки имели прямоугольную форму, соотношение ширины и длины составляло 1:2-1:5, но 3 штамма С. posadasii (А-1, 51, 36) формировали артроспоры, которые по форме приближались к квадрату - 1:1,4. Вместе с тем достоверных межвидовых различий не было установлено, размеры артроконидий С. posadasii и С. immitis составляли 4,1-10,6 • 1,8-5,0 мкм и 4,1-12,4 • 1,4-4,0 мкм соответственно.
Содержание артроспор во взвесях исследованных штаммов Сoccidioides sрр. одного возраста было различным (табл. 2). Наибольшая концентрация отмечалась у штамма С. posa-dasii 442 (КОЕ/мл 2 • 106). Данная характеристика культур Сос-
cidioides spp. представляет интерес в связи с тем, что оценка патогенности штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза достаточно сложна, а методы, используемые в микробиологической практике, не вполне применимы к данным возбудителям. В основном это связано с тем, что кокцидиоидомикоз, как правило, хронический инфекционный процесс, в развитии которого значительную роль играют защитные факторы иммунитета макроорганизма [1, 2]. Кроме того, данные, полученные при моделировании заболевания на лабораторных животных не всегда сопоставимы с данными о тяжести заболевания у человека [4]. И, наконец, микроскопические грибы морфологически представлены несколькими структурными элементами, что не дает возможности провести полноценную стандартизацию культур или, по крайней мере, значительно ограничивает возможности исследователей. Штаммы, которые обильно продуцируют артроспоры, являются наиболее вирулентными, а главное инфекциозными [4].
Мицелиальная форма возбудителей кокцидиоидомикоза, образующаяся при культивировании на питательных средах, характеризуется значительным полиморфизмом макро- и микроморфологических признаков на различных этапах развития агаровой культуры. Фенотипические признаки не позволяют провести видовое типирование грибов рода Coccidioides, что определяет необходимость дальнейших исследований в этом направлении. При идентификации культур микроскопических грибов на принадлежность к Coccidioides spp. целесообразно ориентироваться на структурную организацию гриба, которая является постоянной у возбудителей кокцидиоидомикоза, несмотря на различия в размерах отдельных элементов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л., 1962.
2. Вальков Б. Г., Саллеева В. Н. // Материалы Всероссийского совещания по вопросам глубоких микозов. - Волгоград, 1970. -С. 61-63.
3. Кашкин П. Н., Елинов Н. П. Кокцидиоидомикоз и гистоплазмоз.
- Л., 1969.
4. Кашкин П. Н., Хохряков А.П. Определитель патогенных, токсичных и вредных для человека грибов. - Л., 1979.
5. Ткаченко Г. А., ГришинаМ., Савченко С. С. и др. // Материалы 4-го Всероссийского конгресса по медицинской микологии. -2006. - Т. 8. - С. 103-104.
6. Ткаченко Г. А., Гришина М. А., Антонов В. А. и др. // Молекул. генетика. - 2007. - № 4. - С. 25-31.
7. Щеклаков Н. Д., Лещенко В. М., Ройтбурд М. Ф. // Материалы 7-й Ленинградской микологической конференции. - Л., 1988. -С. 102-104.
8. FieseM. // Coccidioidomycosis. - Springfield, 1958.
9. Fisher M. C., Koenig G. L., White T. J., Taylor J. W. // Mol. Ecol. -1999. - Vol. 8. - P. 1082-1084.
10. Fisher M. C., Koenig G. L., White T. J., Taylor J. W. // Micologia. -2002. - Vol. 94, № 1. - P. 73-84.
11. Guarro J., Gene J., Stchigel A. // Clin. Microbiol. Rev. - 1999. -Vol. 12. - P. 454-500.
12. Valley Fever Center for Excellence [Электронный pecypc] - http:// www.vfce.arizona.edu/ValleyFeverPeopele/Default.aspx
13. Zimmerman C. R., SnedkerC. J., PappagianisD. // J. Clin. Microbiol.
- 1994. - Vol. 32. - P. 3040-3042.
Поступила 05.04.11
заметки из практики
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616.441-006.5-06:616.441-008.61]-074
Л. М. Фархутдинова1, Д. У. Аллабердина1, Г. А. Гайсарова2, Г. А. Биглова2, И. О. Круглова3, П. С. Гусева2, Л. Я. Мажерина2, А. А. Хамитов2, М. Ш. Кашаев2, И. В. Поляков2, И. М. Бакиев2
клинико-пабораторные проявления тяжелой формы диффузного токсического зоба
башкирский государственный медицинский университет, Институт последипломного образования, Республиканская клиническая больница им. Г. Г. Куватова, 3Лечебно-профилактический центр «Звездный», Уфа
Описаны современные представления о патогенезе системного аутоиммунного заболевания - диффузного токсического зоба. Проанализировано клиническое наблюдение тяжелой формы диффузного токсического зоба, осложненной системными аутоиммунными проявлениями с характерными изменениями результатов клинических, биохимических, гормональных и иммунологических исследований.
Ключевые слова: диффузный токсический зоб, иммунная система
L.M. Farkhutdinova, D.U. Allaberdina, G.A. Gaysarova, G.A. Biglova, I.S. Kruglova, P.S. Guseva, L.Ya. Madjerina, A.A. Khamitov,
M.Sh. Kashayev, I.V. Polyakov, I.M. Bakiyev THE CLINICAL LABORATORY MANIFESTATIONS OF SEVERE FORM OF DIFFUSE TOXIC GOITER
The article deals with nowadays considerations concerning the pathogenesis of such systemic autoimmune disease as diffuse toxic goiter. The clinical monitoring of severe form of diffuse toxic goiter complicated by systemic autoimmune manifestations with characteristic alterations of results of clinical, biochemical, hormonal and immunologic analyses is analyzed.
Key words: diffuse toxic goiter, immune system
