CC BY
9УДК 616.853 DOI: 10.29039/2224-6444-2022-12-3-13-19
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГИППОКАМА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЭПИЛЕПТИЧЕСКОГО ПРИПАДКА
Демяшкин Г. А.1, Шаповалова Е. Ю.2, Григорян М. С.2, Зорин И. А.1
'ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), 119048, ул. Трубецкая, 8 стр.2, Москва, Россия
2Институт «Медицинская академия имени С. И. Георгиевского» ФГАОУ ВО «Крымский- федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь,*Россия
Для корреспонденции: Демяшкин Григорий Александрович, к.м.н., заведующий лабораторией гистологии и иммунногистохимии ИТМиБ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет); e-mail: dr.dga@ mail.ru
For correspondence: Grigory Demyashkin, PhD, Head of Department of Histology and Immunohistochemistry, ITM of I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), e-mail: dr.dga@mail.ru
Information about authors:
Demyashkin G. A., https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Shapovalova E. Y., http://orcid.org/0000-0003-2544-7696 Grigoryan M. S., https://orcid.org/0000-0002-8417-9153 Zorin I. A., https://orcid.org/0000-0002-1621-7015
РЕЗЮМЕ
На сегодняшний день изучение эпилепсии остается одним из основных направлений в современной неврологи. Несмотря на многолетнюю историю наблюдения эпилепсии и эпилептических припадков, нейробиологическая составляющая болезни остаётся малоизученной. Для понимания основных механизмов развития и разработки новых методов лечения эпилептического приступа в основном используется экспериментальный метод моделирования приступа на животных. Цель исследования - морфологическая оценка гиппокампа в условии коразоловой модели острого и хронического приступа эпилепсии. Материал и методы. Животные были поделены на группы: 1-ая (n=20) - моделирование острого приступа эпилепсии, 2-ая (n=20) - моделировали хронический приступ эпилепсии на основе киндлинг-эффекта, 3-ья (n=10) -контрольная. Полученные фрагменты головного мозга исследовали гистологическим методом. Результаты. У I группы животных после введения ПТЗ наблюдали клиническую симптоматику острого приступа эпилепсии. При морфологическом исследовании гиппокампа экспериментальных обнаружили нарушение гистоархитектоники с появлением «темных» нейронов, которые исчезали к 5 дню от начала эксперимента. У II группы животных была успешно смоделирована модель хронической эпилепсии с развитием генерализованного припадка после 3-го введения препарата. Характер морфологических изменений в головном мозге был более мягкий по сравнению с I группой. Заключение. Морфологической особенностью эпилепсии является появление в гиппокампе «темных» нейронов, количество которых при остром приступе больше, чем при киндлинг-эффекте. На основании обнаруженной клинико-морфологической картины пентилтетразол можно использовать для моделирования острого и хронического приступа эпилепсии у мышей линии СВА. Ключевые слова: эпилепсия, гиппокамп, зубчатая извилина, пентилтетразол.
MORPHOLOGICAL FEATURES OF MODELING EPILEPSY IN EXPERIMENTAL ANIMALS
Demyashkin G. A.1, Shapovalova E. Y.2, Grigoryan M. S.2, Zorin I. A.1
1I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia institution «Medical Academy named after S. I. Georgievsky» of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
The study of epilepsy remains one of the main areas in modern neurology. Despite a long history of observation of epilepsy and epileptic seizures, the neurobiological component of the disease remains poorly understood. To understand the main mechanisms of development and develop new methods for the treatment of an epileptic seizure, an experimental method of simulating a seizure in animals is mainly used. The aim of the study was to evaluate the morphological assessment of the hippocampus in the corazole model of epilepsy. Material and methods. Animals were divided into groups: group 1 (n=20) - simulation of an acute epileptic seizure, group 2 (n=20) - chronic epileptic seizure modeled based on the kindling effect, group 3 (n=10) - control. The obtained fragments of the brain were examined by the histological method. Results. In group I animals after the administration of PTZ observed clinical symptoms of generalized seizure. A morphological study of the experimental hippocampus revealed a violation of histoarchitecton-ics with the appearance of «dark» neurons, which disappeared by the 5th day from the start of the experiment. In group II animals, a model of chronic epilepsy was successfully modeled with the development of a generalized seizure after the 3rd injection of the PTZ. The nature of morphological changes in the brain was milder compared to group I. Conclusion. The morphological feature of epilepsy is the appearance of «dark» neurons in the hippocampus, the number of which during an acute seizure is greater than after the kindling effect. Based on the detected clinical and morphological picture, pentyltetrazole can be used to simulate acute and chronic epilepsy seizures in CBA mice.
Key words: epilepsy, hippocampus, dentate gyrus, pentylenetetrazole.
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
На сегодняшний день изучение эпилепсии остается одним из основных направлений в современной неврологии [1; 2]. Несмотря на многолетнюю историю наблюдения эпилепсии и эпилептических припадков, нейробиологи-ческая составляющая болезни остаётся малоизученной [3]. Для понимания основных механизмов развития и разработки новых методов лечения эпилептического приступа в основном используется экспериментальный метод моделирования приступа на животных.
Принципиально модели эпилепсии можно разделить на генетические и индуцированные. Генетические модели основаны на специфических мутациях в ДНК, которые приводят к спонтанным эпилептическим приступам у животных. Индуцированные могут быть вызваны химическим (лекарственным) веществом, электрической или акустической стимуляцией. В настоящее время предпочтение отдается использованию химических нейроконвульсантов, которые обеспечивают хорошую воспроизводимость и, как предполагается, соответствуют идиопатическим эпилептическим припадкам у человека [4; 5]. Одной из наиболее популярной моделью является коразоловая модель, в которой используется вещество коразолового ряда -пентилтетразол (ПТЗ). При использовании ПТЗ возможно добиться, как острого эпилептического приступа, так и хронической эпилепсии. Механизм развития приступа под действием ПТЗ на сегодняшний день остается до конца не изученным, но предполагается, что эпилептоге-нетический эффект достигается за счет воздействия на ГАМК- и глутаматергическую, а также антиоксидантную системы [6; 7].
Необходимо отметить, что многочисленные исследования, которые проводились с использованием ПТЗ-индуцированной модели эпилепсии, доказали, что ПТЗ-модель может быть использована не только для оценки эффективности противоэпилептических препаратов и методов лечения эпилептических приступов, но и для исследования механизмов эпилепто-генеза [7]. Клинические данные, полученные в ходе моделирования приступов, согласуются с результатами реальных пациентов с эпилепсией. Таким образом, ПТЗ-модель эпилепсии является одной из немногих, которая подходит для изучения нейробиологического субстрата как острого припадка, так и хронической эпилепсии, которую возможно моделировать с использованием киндлинг-эффекта [8; 9].
Ограничения для использования этого метода, во-первых, обусловлены большой вариативностью протоколов и схем для вызова эпилептического припадка. Во-вторых, ПТЗ-модель не
подходит для изучения инициации эпилептического приступа и механизмов его распространения.
Тем не менее, на основании ПТЗ-модели возможно провести морфологическую оценку гиппокампа и зубчатой извилины для изучения изменений, вызываемых приступом. Это является необходимым для продолжения работы по исследованию патогенетических механизмов эпилепсии и созданию новых эффективных методов лечения.
Таким образом, на сегодняшний день необходима дальнейшая разработка и усовершенствование модели эпилепсии с использованием ПТЗ для улучшения понимая патоморфологических и молекулярно-биологических процессов в головном мозге при эпилепсии, что в дальнейшем послужит базисом для разработки новых методов лечения и профилактики эпилепсии.
В данном исследовании будет впервые подробно описана процедура воспроизведения острого эпилептического припадка и хронической эпилепсии с характерными гистопатологи-ческими особенностями в головном мозге.
Цель исследования - морфологическая оценка гиппокампа в условии коразоловой модели острого и хронического приступа эпилепсии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Экспериментальное морфологическое исследование проводили на базах института «Медицинская академия имени С. И. Георгиевского» ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» и Сеченовского Университета.
Модель животных для исследования in vivo.
В качестве моделей использовали самцов половозрелых мышей популяции CBA (30 - 35 г; 12 недель; n=50). Животные содержались в виварии при 12 часовом световом дне, кондиционировании при температуре 23°С и влажности 40 - 60%, на стандартном рационе питания с водой ad libitum. Мышей содержали в пластиковых клетках со слоем, покрытым абсорбирующим материалом (рисовой шелухой), обеспечивающим гнездовой материал. На время длительного эксперимента животные были размещены в клетках по две особи, чтобы исключить возможное влияние длительного одиночного содержания на поведение. Все манипуляции осуществляли согласно Международным рекомендациям и Руководствам по проведению медико-биологических исследований по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS) и Правилам лабораторной практики и приказу Министерства здравоохранения РФ № 199н от 01.04.2016 «Об утверждении правил лабораторной практики».
Животные были поделены на группы: 1-ая (п=20) - моделирование острого приступа эпилепсии, 2-ая (п=20) - моделировали хронический приступ эпилепсии на основе киндлинг-эффекта, 3-ья (п=10) - контрольная.
Протокол моделирования острого приступа эпилепсии.
1. Измерить массу животного.
2. Поместить животное в экспериментальную камеру на 3 минуты для привыкания
3. Во время привыкания, рассчитать количество раствора ПТЗ для интрапери-тонеального введения на основе массы животного и дозировки раствора. Для моделирования острого приступа эпилепсии использовали дозировку 45 мкг/ кг однократно.
4. Ввести раствор ПТЗ интраперитонеаль-но, избегая его попадания в белую линию живота.
5. Провести наблюдение животных в течение 30 минут после инъекции и оценить реакцию, используя шкалу Расина.
6. После оценки приступа животных оставляют на 6 - 10 часов для наблюдения за состоянием.
Протокол моделирования хронической эпилепсии на основе киндлинг-эффект.
Количество баллов от 0 до 2 расценивали как малые/фокальные припадки, а от 3 до 6 как генерализованный приступ. Максимальное количество баллов (7) приводило к тоническому сокращению мускулатуры с дальнейшей гибелью животного. Выведение мышей из эксперимента Животных 1-ой группы выводили из эксперимента последовательно на 1, 3 и 5 сутки от начала введения ПТЗ. Животных 2-ой группы выводили из эксперимента последовательно после каждой инъекции для динамической оценки изменений в зубчатой извилине гиппокампа. Животных 3-ей группы выводили из эксперимента планово через неделю после инъекции.
1. Измерить массу животного.
2. Поместить животное в экспериментальную камеру на 3 минуты для привыкания.
3. Во время привыкания, рассчитать количество раствора ПТЗ для интраперито-неального введения на основе массы животного и дозировки раствора. Для моделирования острого приступа эпилепсии использовали дозировку 30 мкг/кг.
4. Ввести раствор ПТЗ интраперитонеаль-но, избегая его попадания в белую линию живота.
5. Провести наблюдение животных в течение 30 минут после инъекции и оценить реакцию, используя шкалу Расина.
6. После оценки приступа животных оставляют на 6 - 10 часов для наблюдения за состоянием.
7. Для развития хронической эпилепсии на основе киндлинг-эффекта экспериментальным животным вводили ПТЗ на 1, 3, 5 сутки.
Оценка тяжести эпилептического приступа.
1. Наблюдение за животным в течение 30 мин после введения ПТЗ.
2. Оценка эпилептического поведения, используя модифицированную шкалу Расина, в баллах [10]:
Выводили животных из эксперимента путем введения высоких доз анестетика. Морфологическое исследование Для исследования морфологического субстрата эпилепсии исследовали гиппокамп экспериментальных животных, особой зоной интереса являлись регионы СА1, СА3 и зубчатая извилина (Рис. 1).
Фрагменты головного мозга фиксировали в 10% нейтральном формалине, забуференным по Лилли (при рН 7,2 - 7,4), заливали в парафин по стандартной методике. После депара-финизации и регитратации парафиновых срезов их окрашивали гематоксилином и эозином.
Баллы Поведенческая реакция
-1 Нормальное поведение
0 Подёргивание усов
1 Внезапное нарушение поведения (неподвижный взгляд)
2 Подергивание лица
З Подергивание лица и шеи
4 Клонические судороги в положении сидя
s Клонические судороги лёжа на животе
6 Клонические и тонико-клонические судороги с хаотичными движениями по клетке
7 Тоническое сокращение, внезапная кардиальная/респираторная недостаточность, смерть
КРымсКИЙ зПР2ал эКСпериментальной и клинической медицины
Рис. 1. Гиппокамп контрольной группы с обо-значеннымизонамиинтереса. Окраска: гематоксилин и эозин, увелич. х 50. ЗИ - зубчатая извилина.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика поведения животных во время эксперимента.
Животные 1-ой группы, которые получали ПТЗ в дозировке 45 мкг/кг, показали хорошую восприимчивость к препарату и демонстрировали генерализованныйприступвтечениеЗО минут после инъекции. Большинство приступов былооценеиона 4-5балловпомодифициро-ваннойшкале Рдсиб5-та0оица1).Ы декодорых особей (п=3) развившейся приступ был оценен на 3 балла. Длительность приступа у всех особей не превышала 5 минут.
Оценка тяжести приступа эпилепсии у животных 1-ой группы.
На животных 2-ой группы была смоделирована хроническая эпилепсии на основе киндлинг-эффекта. Экспериментальные мыши получали ПТЗ в дозировке 30 мкг/кг, что соот-
ветствует подпороговому значению для развития большого тонико-клонического приступа эпилепсии. Фракционное введение ПТЗ проводили по 3-ступенчатой схеме, что позволило добиться развития генерализованного приступа на 5 сутки эксперимента (3-ья доза ПТЗ). После 1-го введения у животных отмечали развития фокального припадка, что соответствовала 1 - 2 баллам по шкале Расина, после 2-го введения у большинства животных зафиксировали 2 - 3 балла. После финальной инъекция (3-ья доза) у животных наблюдали генерализованный припадок, который был оценен на 4 балла.
В ходе обоих экспериментов было установлено, что используемые дозировки и схемы введения способны эффективно вызывать эпилептические приступы. Животные второй группы выдавали регулярные приступы с тенденцией к генерализации, что характерно для хронической эпилепсии.
В результате эксперимента животные контрольной группы набрали -1 балл по модифицированной шкале Расина.
Морфологическая характеристика в гиппо-кампе экспериментальных животных.
В контрольной группе наблюдали типичную гистологическую картину: нейроны округлой или овальной формы с голубой цитоплазмой и светло-голубым ядром, четкие границы.
У животных первой группы обнаружили значительные нейрональные изменения в организации зубчатой извилины гиппокампа, нарушение гистоархитектоники пирамидных и гранулярных клеток: нейроны были сморщены, «тёмные», без различимой границы между ядром и цитоплазмой. Количество «тёмных» нейронов демонстрировало прямую корреляцию со временем, прошедшим с момента приступа. Таким образом, наибольшее количество измененных нейронов обнаружили через сутки после генерализованного приступа с тенденцией к их сокращению к 5 дню после приступа (Рис. 2).
Патоморфологические изменения, вызванные фракционным введением препарата (2-ая группа) носили менее выраженный характер. Количество «тёмных» нейронов было незначительным, они появились через сутки после первого введения ПТЗ, а на третьи и пятые сутки их количество сократилось. Так же при исследовании гиппокампа животных 2-ой группы наблюдали миграцию гранулярных клеток (Рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании мы исследовали эффекты применение коразоловой модели эпилепсии на основе ПТЗ для симуляции острого приступа и хронической эпилепсии у экспериментальных животных.
1
сутки
3
сутки
5
сутки
I группа
II группа
Рис. 2. Морфологические изменения в гиппокампе экспериментальных животных I и II группы. «Тёмные» нейроны с признаками пикноза отмечены стрелкой. Окраска: по Нисслю.
Несмотря на имеющиеся данные специализированной научной литературы об использования коразоловой модели их количество остается недостаточным для наиболее полного описания возможностей этого метода. В настоящем исследовании мы стандартизировали протокол выполнения эксперимента для вызова острого приступа и модели хронической эпилепсии на основе киндлинг-эффекта. Более того, клиническая картина эпилепсии, оцененная с помощью модифицированной шкалы Расина, была дополнена морфологической характеристикой гиппо-кампа, как во время эпилепсии, так и в период восстановления после приступа.
Одна из ключевых особенностей коразоло-вой модели заключается в появление «тёмных» нейронов. На сегодняшний день роль «темных» нейронов в гистоархитектонике головного мозга остаётся предметом научных споров. В некоторых исследованиях приводятся доказательства того, что темные нейроны являются клетками в состоянии апоптоза. Однако, другие авторы предполагают, что «темные» клетки, по всей видимости, являются транзитной формой, необходимой для выживании общей популяции нейронов, а их способность передавать и генерировать сигналы остается неясной [11-14]. В настоящей работе мы наблюдали довольно быстрое сокра-
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
2022, т. 12, № 3
щении количества «тёмных» нейронов на 5 сутки от начала эксперимента в обоих группах.
В I группе такие результаты могут указывают на восстановление нейрональных связей и нормальной структуры головного мозга, что согласуется с морфологическими исследованиями других авторов. Таким образом, можно однозначно подтвердить, что описанная нами схема введения ПТЗ является надёжной для вызова генерализованного (тонико-клонического) приступа у экспериментального животного. Однако, необходимо учитывать, что степень и характер проявлений может быть различен не только в пределах разных линий животных, но и у одного вида, что было продемонстрировано в таблице 1.
Характер морфологических изменений в II группе носил более «мягкий» характер, что по всей видимости, связано с меньшей дозой введения и тяжестью начальных приступов. Особенно стоит отметить тот факт, что при регулярном введение препарата количество «темных» нейронов у экспериментальных животных продолжило снижаться и на 5 сутки их количество оставалось незначительным, несмотря на то что у животных развился тонико-клонический приступ. Такие результаты свидетельствуют о том, что роль «темных» нейронов остается до конца неясной. На основе нашего сравнительного анализа можно с уверенностью сказать, что существует связь между эпилептическими припадками и формированием гиперхромных нейронов. Однако, четкой корреляции между дозой ПТЗ, клинической симптоматикой и морфологической характеристикой не выявлено. Для более подробного освещения этой темы необходимо продолжить изучение в этом направление с применением молекулярно-генетических, иммуногистохимических и других специфических методов исследования.
Преимуществом нашего исследования является сравнительная оценка двух разных по характеру приступов в динамике, при которой мы можем четко проследить стадийность, как клинических проявлений, так и морфологических изменений, что несет в себе научную новизну, необходимую для дальнейшего изучения эпилепсии. Так же необходимо отметить, что мы впервые публикуем столь подробный анализ применения коразоло-вой модели у животных мышей линии СВА.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Морфологической особенностью эпилепсии является появление в гиппокампе «темных» нейронов, количество которых при остром приступе больше, чем при киндлинг-эффекте.
На основании обнаруженной клинико-мор-фологической картины пентилтетразол можно использовать для моделирования острого и хро-
нического приступа эпилепсии у мышей линии СВА.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Beghi E. The Epidemiology of Epilepsy. Neuroepidemiology. 2020;54(2):185-1 91. doi:10.1159/000503831.
2. Andrade-Machado R., Benjumea-Cuartas V., Santos-Santos A., Sosa-Dubón M. A., García-Espinosa A., Andrade-Gutierrez G. Mortality in patients with refractory temporal lobe epilepsy at a tertiary center in Cuba. Epilepsy Behav. 2015;53:154-160. doi:10.1016/j. yebeh.2015.08.038.
3. Akyuz E., Polat A. K., Eroglu E., Kullu I., Angelopoulou E., Paudel Y. N. Revisiting the role of neurotransmitters in epilepsy: An updated review. Life Sci. 2021;265:118826. doi:10.1016/j.lfs.2020.118826.
4. Löscher W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. 2017;42(7):1873-1888. doi:10.1007/s11064-017-2222-z.
5. Kandratavicius L., Balista P. A., Lopes-Aguiar C. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 2014;10:1693-1705. doi:10.2147/NDT.S50371
6. Shimada T., Yamagata K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J Vis Exp JoVE. 2018;(136):56573. doi:10.3791/56573.
7. Vasilev D. S., Tumanova N. L., Kim K. Kh. Transient Morphological Alterations in the Hippocampus After Pentylenetetrazole-Induced Seizures in Rats. Neurochem Res. 2018;43(8):1671-1682. doi:10.1007/ s11064-018-2583-y.
8. Löscher W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 2011;20(5):359-368. doi:10.1016/j.seizure.2011.01.003.
9. Grone B. P., Baraban S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 2015;18(3):339-343. doi:10.1038/nn.3934.
10. Van Erum J., Van Dam D., De Deyn P. P. PTZ-induced seizures in mice require a revised Racine scale. Epilepsy Behav. 2019;95:51-55. doi:10.1016/j. yebeh.2019.02.029.
11. Zimatkin S. M., Bon' E. I. Dark Neurons of the Brain. Neurosci Behav Physiol. 2018;48(8):908-912. doi:10.1007/s11055-018-0648-7.
12. Ahmadpour S., Behrad A., Vega I. F. Dark Neurons: A protective mechanism or a mode of death. J Med Histol. 2019;3(2): 125-131. doi:10.21608/ jmh.2020.40221.1081.
13. Ooigawa H., Nawashiro H., Fukui S. The fate of Nissl-stained dark neurons following traumatic brain injury
in rats: difference between neocortex and hippocampus regarding survival rate. Acta Neuropathol (Berl). 2006;112(4):471-481. doi:10.1007/s00401-006-0108-2.
14. Kostyaeva M. G., Kastyro I. V., Yunusov T. Yu. Protein p53 Expression and Dark Neurons in Rat Hippocampus after Experimental Septoplasty Simulation. Mol Genet Microbiol Virol. 2022;37(1):19-24. doi:10.3103/ S0891416822010037.
REFERENCES
1. Beghi E. The Epidemiology of Epilepsy. Neuroepidemiology. 2020;54(2):1 85-1 91. doi:10.1159/000503831.
2. Andrade-Machado R., Benjumea-Cuartas V., Santos-Santos A., Sosa-Dubón M. A., García-Espinosa A., Andrade-Gutierrez G. Mortality in patients with refractory temporal lobe epilepsy at a tertiary center in Cuba. Epilepsy Behav. 2015;53:154-160. doi:10.1016/j. yebeh.2015.08.038.
3. Akyuz E., Polat A. K., Eroglu E., Kullu I., Angelopoulou E., Paudel Y. N. Revisiting the role of neurotransmitters in epilepsy: An updated review. Life Sci. 2021;265:118826. doi:10.1016/j.lfs.2020.118826.
4. Löscher W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. 2017;42(7):1873-1888. doi:10.1007/s11064-017-2222-z.
5. Kandratavicius L., Balista P. A., Lopes-Aguiar C. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 2014;10:1693-1705. doi:10.2147/NDT.S50371
6. Shimada T., Yamagata K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J Vis Exp JoVE. 2018;(136):56573. doi:10.3791/56573.
7. Vasilev D. S., Tumanova N. L., Kim K. Kh. Transient Morphological Alterations in the Hippocampus After Pentylenetetrazole-Induced Seizures in Rats. Neurochem Res. 2018;43(8):1671-1682. doi:10.1007/ s11064-018-2583-y.
8. Löscher W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 2011;20(5):359-368. doi:10.1016/j.seizure.2011.01.003.
9. Grone B. P., Baraban S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 2015;18(3):339-343. doi:10.1038/nn.3934.
10. Van Erum J., Van Dam D., De Deyn P. P. PTZ-induced seizures in mice require a revised Racine scale. Epilepsy Behav. 2019;95:51-55. doi:10.1016/j. yebeh.2019.02.029.
11. Zimatkin S. M., Bon' E. I. Dark Neurons of the Brain. Neurosci Behav Physiol. 2018;48(8):908-912. doi:10.1007/s11055-018-0648-7.
12. Ahmadpour S., Behrad A., Vega I. F. Dark Neurons: A protective mechanism or a mode of death. J Med Histol. 2019;3(2): 125-131. doi:10.21608/ jmh.2020.40221.1081.
13. Ooigawa H., Nawashiro H., Fukui S. The fate of Nissl-stained dark neurons following traumatic brain injury in rats: difference between neocortex and hippocampus regarding survival rate. Acta Neuropathol (Berl). 2006;112(4):471-481. doi:10.1007/s00401-006-0108-2.
14. Kostyaeva M. G., Kastyro I. V., Yunusov T. Yu. Protein p53 Expression and Dark Neurons in Rat Hippocampus after Experimental Septoplasty Simulation. Mol Genet Microbiol Virol. 2022;37(1):19-24. doi:10.3103/ S0891416822010037.
