CC BY
77DOI:10.24412/1999-6780-2019-4-43-47
УДК 57.086.3:582.282.23
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК ИЗОЛЯТОВ MALASSEZIA FURFUR (C.P. ROBIN) BAILL
'Степанова A.A. (зав. лаб.)*, 1Богданова Т.В. (ассистент кафедры), 2Родченко Ю.В. (м.н.с.), 2Мелкумян А.Г. (зав. центром лаб. диагностики), 2Любасовская Л.А. (зав. отделом), Игнатьева С.М. (в.н.с.), 1Алексеев А.Ю. (студент), 1Гольцева И.С. (лаборант-исследователь), 1Босак И.А. (с.н.с.), 1Пчелин И.М. (н.с.)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: 1НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Санкт-Петербург; Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, Москва, Россия
В настоящей работе с помощью методов световой, трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии изучены особенности микроморфологии дрожжевых клеток 10 изолятов Malassezia furfur. Отличительной особенностью преобладающего числа зрелых дрожжевых клеток было наличие на поверхности клеточных стенок внеклеточного липидного «гало», ранее описанного для мульти-рези-стентного к флуконазолу штамма Candida auris.
Ключевые слова: Malassezia furfur, микроморфология, ультраструктура, электронная микроскопия, внеклеточное липидное «гало»
MORPHOLOGICAL PECULIARITIES OF THE ISOLATES YEAST CELLS MALASSEZIA FURFUR (C.P. ROBIN) BAILL
1Stepanova A.A. (head of the laboratory), 1Bogdanova T.V. (assistant of the department), 2Rodchenko J.V. (junior scientific researcher), 2Melkumyan А^. (head of the center of lab. diagnostics), 2Lyubasovskaya L.A. (head of the department), 1Ignatieva S.M. (leading scientific collaborator), 1Alekseev A.U. (student), 1Goltzeva I.S. (laboratory assistant), 1Bosak I.A. (senior scientific collaborator), 1Pchelin I.M. (scientific researcher) North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: 1 Kashkin Research Institute of Medical Mycology, St. Petersburg; 2National Medical Research Center of Odstetrics, Gynecology and Perinatology named after academician V.L. Kulakov, Moscow, Russia
In the present paper by the means of methods of the light, transmission and scanning electron microscopy the peculiarities of micromorphology of 10 isolates of M. furfur were studied. The characteristic property of the mature yeast cells of M. furfur were the existence of the extracellular lipidic "galo" on its surfaces which earlier was described for the multi-resistant to fluconazole strain of Candida auris.
Key words: Malassezia furfur, micromorphology, ultrastructure, electron microscopy, extracellular lipidic "halo"
Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, e-mail: amaliya.stepanova@szgmu.ru
ВВЕДЕНИЕ
Malassezia furfur (С. P. Robin) Bail. - это липофиль-ные и/или липидозависимые микромицеты, представители нормального микобиома кожи человека [1-3]. У людей этот вид дрожжей выделяется из соскобов эпидермальных чешуек разных эпитопов, ногтей, волос, из носовой полости, а также из крови, мочи, кала, чешуек скальпа, лица, рук, ног, а также из ногтей, глаз, носовой полости и др. Данный вид ассоциирован с се-борейным [4] и атопическим дерматитом, псориазом [5], кератитом [6], блефаритом [6], он также вызывает отрубевидный лишай [2], фолликулит [7], диссемини-рованные инфекции у пациентов с нейтропенией [8] и др. В последнее десятилетие довольно часто диагностируют гематогенные инфекции, обусловленные M. furfur. Этот микромицет может быть причиной кате-тер-обусловленной инфекции у иммунокомпромети-рованных пациентов [3].
Цель настоящей работы - изучить морфологию Malassezia furfur с помощью современных методов световой, трансмиссионной (ТЭМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследовали 10 изолятов (1-18, 2-18, 3-18, 4-18, 5-18, 6-18, 7-18, 8-18, 9-18, 10-18) Malassezia furfur (C.P. Robin) Baill, выделенных от 9 новорожденных, находившихся на лечении в реанимационных отделениях Центра акушерства и гинекологии им. В.Л. Кулакова в 2017-2018 гг. Из них четверо детей были из отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных и пятеро - из отделения хирургии, реанимации и интенсивной терапии. Все пациенты получали парентеральное питание липидными растворами. Изоляты были выделены из следующих биосубстратов: кал, моча, кровь, а также в одном случае - из аутопсийного материала (кал, кровь).
Изоляты выращивали в течение 7 суток на ага-ризованной модифицированной питательной среде Лиминга-Нотман (mLNA) при +32 °С. Видовую принадлежность определяли молекулярно-гене-тическим методом по протоколу CLSI M18. Выделяли ДНК по протоколу: в пробирку емкостью 1,5 мл с 450 мкл ли-зирующего буфера (20 мМ ТрисНС1 pH 8,0, 5 мМ ЭДТА pH 8,0, 100 мМ NaCl, 1% SDS) на кончике наконечника дозатора вносили небольшой участок колонии гриба, добавляли 2 стеклянных шарика (5 мм) и встряхивали на гомогенизаторе Bertin Precellys в течение 30 сек. Затем добавляли протеиназу К до концентрации 50 мкг/ мл и инкубировали при +65 °C два часа в термостате. К лизату добавляли равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), после чего перемешивали, инкубировали при комнатной температуре с периодическим встряхиванием на протяжении 10 минут и центрифугировали 10 минут при 9000 g. В новую пробирку отбирали верхнюю фазу и добавляли 0,1 объема 3 М ацетата натрия и 2 объема этилового спирта. После этого пробирку инкубировали в течение 2 часов при температуре - 20 °C. Далее ее центрифугировали 10 минут при 20000 g при +4 °С, осадок пипетировали (или вортексировали) для отмывки от солей в 0,5 мл 70% этилового спирта при +4 °С, центрифугировали 10 минут при +4 °С. Отмывку проводили повторно, а затем высушивали ДНК на воздухе. Осаждённую ДНК
Ï--
растворяли в 50 мкл H2O. Для определения вида гриба в термоциклере C1000 Touch (Bio-Rad, США) ам-плифицировали регион ITS рибосомной ДНК, а затем выполняли секвенирование ДНК на приборе ABI 3500 (Thermo Fischer Scientific, США).
Культуры гриба фотографировали в стереомикро-скопе Zeiss Stem 2000. Микроморфо-логию дрожжевых клеток изучали на флуоресцентном микроскопе Axio-images.Zl (Carl Zeiss) с использованием оптики Номар-ского.
Для изучения ультраструктуры гриба в ТЭМ применяли метод негативного контрастирования интакт-ных дрожжевых клеток фосфорно-вольф-рамовой кислотой (ФВК). Для этого микробиологической петлей небольшую часть колонии гриба перемещали в пластиковые пробирки для микропроб типа Эппен-дорф (1,5 мл) c физиологическим раствором (0,1 мл) на 10 минут. Затем на электронно-микроскопические медные сетки диаметром 3 мм, покрытые прозрачной формваровой подложкой-пленкой, с помощью дозатора наносили взвесь клеток культур в физиологическом растворе. Через пять минут контакта часть физиологического раствора отсасывали фильтровальной бумагой, при этом на подложке оставался анализируемый материал. Далее на сетки с материалом на 10 минут наносили 1,5% раствор ФВК (рН 6,7), который негативно окрашивал объекты в черный цвет и позволял четко выявить детали их ультраструктурной организации. Сетки после окрашивания ФВК промывали дистиллированной водой, перемещали на сухую фильтровальную бумагу, расположенную в чашке Петри, высушивали 10 минут и исследовали в ТЭМ Jem 100-SX (Jeol, Япония).
Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) фрагменты колоний гриба (штаммы 1-18, 2-18, 5-18, 7-18, 8-18, 9-18, 10-18) с питательной средой фиксировали в 3% растворе глутаральдегида 3 часа, затем пост-фиксировали в течение ночи в 1% растворе осмиевой кислоты, обезвоживали в серии спиртов, высушивали при критической точке на приборе HCP-2 15 минут, после чего образцы напыляли золотом и изучали в микроскопе JSM 35 (Джеол, Токио, Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследованные 10 изолятов были идентифицированы с помощью ДНК-секвенирования как Malassezia furfur.
Характеристика колоний. Рост колоний при посеве штрихом отмечали через 7 суток культивирования на среде Лиминга-Нотман при +32 °C (Рис. 1 а). Края колоний слегка приподнятые, мелко волнистые, цвет - кремовый, с оттенками желтого разной степени интенсивности.
Световая микроскопия. Размер (1,5-4,5 x 2,5-6,5 мкм) и форма (Рис. 1 б) дрожжевых клеток сильно варьировали. Отметим, что ввиду низкой разрешающей способности световой микроскопии воротничок дрожжевых клеток не выявлялся. Почкующиеся клетки встречались часто; почкование однополярное. Диаметр почки меньше такового материнской клетки. Ги-фальные элементы отсутствовали.
Трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия. Колонии M. furfur на малом увеличении сканирующего электронного микроскопа имели вид
многочисленных, невысоких, плотно расположенных «подушек» разной формы и размеров с четко очерченными краями (Рис. 2 а). Поверхность таких «подушек» ровная, плотность расположения дрожжевых клеток высокая (Рис. 2 е). Для зрелых дрожжевых клеток колоний исследованных изолятов M. furfur характерно сильное варьирование размеров и формы (Рис. 1 в, 2 е), что свойственно данному виду [1-3]. При использовании метода негативного контрастирования наблюдали, что дрожжевые клетки в изученных колониях могли располагаться одиночно, в небольших группах по 2-3 (Рис. 1 и, п) либо формировать более крупные скопления (Рис. 1 в). Последняя микрофотография наглядно демонстрирует существенные различия в размерах и форме зрелых дрожжевых клеток культуры изученного изолята. Форма клеток могла быть округлой (Рис. 1 г), эллипсоидной (Рис. 1 д), цилиндрической (Рис. 1 е), яйцевидной (Рис. 1 ж) и др. Рисунки 1 г-ж (метод негативного контрастирования) и 2 е (сканирующая электронная микроскопия) показывают разнообразие размеров и форм, диаметра рубчика, степени выраженности воротничка и его топографии в дрожжевых клетках, а также размеров и формы формируемых почек. У некоторых дрожжевых клеток при образовании почки отмечали сужение зоны аннеляции (Рис. 1 ж, стрелки).
При контрастировании ФВК отмечали, что на поверхности многих зрелых и почкующихся дрожжевых клеток M. furfur присутствовали скопления внеклеточного липидного «гало» умеренной электронной плотности. По степени развития последнего изоляты можно разделить на три группы. Первую группу составили три изолята (1-18, 8-18, 10-18, 30% от общего числа изученных), на поверхности клеток которых наблюдали наиболее обильные скопления внеклеточного липида (Рис. 1 з-к, стрелки; 2 б-г, стрелки). Толщина внеклеточного липидного «гало» варьировала от 0,6 до 0,9 мкм. Он мог равномерно покрывать поверхность клеточной стенки (Рис. 1 з-к; 2 в, стрелка) либо частично (Рис. 2 б, г, стрелки). Сканирующая электронная микроскопия показала, что поверхность внеклеточного липида могла быть гладкой (Рис. 1 в, г, стрелки) или иметь довольно многочисленные углубления (Рис. 2 б, стрелка). В почкующихся дрожжевых клетках он мог располагаться одновременно на материнской клетке и почке (Рис. 1 з, стрелки; 2 з, стрелки) либо только на последней (Рис. 1 л, стрелка).
Вторую группу также составляли три изолята (518, 6-18, 9-18, 30% от общего числа изученных), на поверхности клеток культур которых степень развития внеклеточного липида была умеренной. Обычно скопления внеклеточного липида на поверхности разновозрастных (Рис. 1 м, стрелки) и почкующихся (Рис. 1 н) клеток данных изолятов M. furfur имели вид отдельных дискретных очагов (Рис. 2 д, ж, стрелки) толщиной от 0,4 до 0,6 мкм.
И наконец, в третью группу вошли четыре изолята (2-18, 3-18, 4-18, 7-18, 40% от общего числа изученных). Степень развития внеклеточного липида на поверхности дрожжевых клеток здесь была наименьшей (Рис. 1 о, п, стрелки; 2 з, и, стрелки). Толщина внеклеточного липида варьировала от 0,2 до 0,3 мкм.
При изучении колоний изолятов M. furfur (малые увеличения сканирующего микроскопа) выявили на-
Рис. 1. а - колонии M. furfur (посев штрихом) после 7 суток роста на среде Лиминга-Нотман, б - дрожжевые клетки в световом микроскопе (оптика Номарского), в-п - трансмиссионная электронная микроскопия дрожжевых клеток. Условные обозначения: В - воротничок; ДК - дрожжевая(ые) клетки; МК - материнская клетка, Пч - почка. а, б - изолят 5-18, в, д, - изолят 5-18, г - изолят 2-18, е - изолят 3-18, ж, з - изолят 1-18, и - изолят 8-18, к - изолят 10-18, л - изолят 8-18,
м - изолят 6-18, н - изолят 9-18, о - изолят 4-18, п - изолят 7-18.
Рис. 2. M. furfur в сканирующем электронном микроскопе: а, б - изолят 1-18, в - изолят 8-18, г - изолят 10-18, д - изолят 5-18, е - изолят 2-18, ж - изолят 9-18, з - изолят 4-18, и - изолят 7-18.
личие специфической архитектуры их пространственного строения. Можно ожидать, что для колоний других видов этого рода будет характерна другая морфология колоний, подобно тому, как это впервые было показано нами на примере культур разных видов рода Candida [9].
По данным настоящей работы установлено, что для зрелых дрожжевых клеток M. furfur характерно присутствие внеклеточного «гало», развитого у разных изолятов в разной мере. Ранее аналогичная особенность была отмечена для зрелых дрожжевых клеток, ростковых трубок и хламидоспор мульти-резистент-ных штаммов Candida auris [10]. Для сравнения, в качестве контроля мы провели анализ снимков, представленных в ряде работ по изучению ультраструктуры дрожжевых клеток культур других штаммов M. furfur как методами сканирующей, так и трансмиссионной электронной микроскопии, который показывает отсутствие отложений внеклеточного липидного «гало» на поверхности их клеточных стенок [11 и др.]. При изучении клеточной стенки культуральных форм M. furfur обнаружили наличие у них толстой электронно-плотной многослойной клеточной стенки, неравномерно покрытой фибриллярным материалом, отложения внеклеточных липидов на представленных в данной работе микрофотографиях, отсутствовали. Пока неизвестно - характерно ли выявленное липид-ное «гало» исключительно для M. furfur либо при определенных обстоятельствах оно может быть атрибутом дрожжевых клеток других видов этого рода. Возмож-
но, что внеклеточное липидное «гало» представляет барьер как для проникновения метаболитов клеток макроорганизма, так и антимикотиков.
Наличие отложений внеклеточного липида существенно усиливает адгезивные свойства клеток и может приводить к формированию устойчивых биопленок. Вероятно, что при длительном хранении и пересеве культур изученных изолятов степень развития внеклеточного липида может существенно сократиться или полностью исчезнуть, тогда как в тканях или крови макроорганизма степень развития внеклеточного липидного «гало» будет намного выше.
Актуальным представляется продолжить начатые исследования с целью выяснения строения дрожжевых клеток использованных в настоящей работе изо-лятов M. furfur при культивировании их на твердых питательных средах с добавлением антимикотиков.
ВЫВОДЫ
1. При световой микроскопии M. furfur обнаружены преимущественно дрожжевые клетки с монополярным, перкурентным почкованием. Вегетативный мицелий отсутствует. Дрожжевые клетки имеют размеры 1,5-4,5 x 2,5-6,5 мкм. В основном форма клеток округлая, реже - удлиненная. В апексе дрожжевых клеток присутствует широкий рубчик, окруженный воротничком.
2. С помощью метода негативного контрастирования ФВК и СЭМ выявили на поверхности интактных клеток отложения внеклеточного липида, развитого в разной степени.
ЛИТЕРАТУРА
1. de Hoog G.S., Guarro J., Gene J., et al. Atlas of clinical fungi (e-version). Westerdijk Institute / Universitat Rovira i Virgili, 2019. Utrecht / Reus. www.clinicalfungi.org/
2. Boekhout T., Gueho E., Mayser P., Velegraki A. Malassezia and the skin. Berlin: Springer, 2010: 319 p.
3. doi.org/10.1007/978-3-642-03616-3
4. Богданова Т.В., Елинов Н.П. Морфолого-физиологические характеристики дрожжевых организмов - Malassezia species (Malassez, 1874) Baillon,1889 (обзор). Проблемы медицинской микологии. 2011; 13 (1): 3-12. [Bogdanova T.V., Elinov N.P. Morfologo-fiziologicheskie harakteristiki drozhzhevyh organizmov - Malassezia species (Malassez, 1874) Baillon,1889 (obzor). Problemy medicinskoj mikologii. 2011; 13 (1): 3-12 (In Russ)].
5. Wikramanayake T.C., Borda L.J., Miteva M., Paus R. Seborrheic dermatitis - looking beyond Malassezia. Exper. Dermatol. 2019; 28: 991-1001. doi.org/10.1111/exd.14006
6. Jagielski T., Rup E., Ziotkowska A., et al. Distribution of Malassezia species on the skin of patients with atopic dermatitis, psoriasis, and healthy volunteers assessed by conventional and molecular identification methods. BMC Dermatology. 2014; 14: 2-15. doi.org/10.1186/1471-5945-14-3
7. Ledbetter E.C., Jennifer K. Starr J.R. Malassezia pachydermatis keratomycosis in a dog. Med. Mycol. Case. Rep. 2015; 10: 24-26. doi.org/10.1016/j.mmcr.2016.01.001
8. Rubenstein R.M., Malerich S.A. Malassezia (pityrosporum) folliculitis. J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2014: 7 (3): 37-41. PMID: 24688625 PMCID: PMC3970831
9. Walsh T.J., Gamaletsou M.N. Treatment of fungal disease in the setting of neutropenia. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013; 1: 423-427. doi.org/10.1182/asheducation-2013.1.423
10. Елинов Н.П., Васильева Н.В., Степанова А.А. и др. Краткий атлас медицински значимых микромицетов рода Candida. СПб: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2013: 73 c. [Elinov N.P., Vasil'eva N.V., Stepanova A.A. i dr. Kratkij atlas medicinski znachimyh mikromicetov roda Candida. SPb: Izd-vo SZGMU im. I.I. Mechnikova, 2013: 73 c. (In Russ)].
11. Vasilyeva N.V., Stepanova A.A., Chilina G.A., at al. Cytological features of Candida auris yeast cells ex-plaining their multiresistance. Problems in med. mycology. 2018; 20 (3): 3-7. mycology.szgmu.ru/files/№3_2018.pdf
12. Kim S.-H., Kim K.-S., Ko H.-C., Kwon K.-S. The effects of detergents on the morphology and immunomodulatory activity of Malassezia furfur. Annals of Dermatology. 2009; 21 (2): 130-135. doi.org/10.5021/ad.2009.21.2.130
Поступила в редакцию журнала: 23.10.19 Рецензент: Т.С. Богомолова
