CC BY
15
УДК 616.351-006.6-0,37-07
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗА ПРИ АНОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ
Зенюкова Т.В.
ФГБУ «Российский онкологический научный центр» им. Н.Н. Блохина, г. Москва, Российская Федерация
Аннотация. Статья посвящена проблемам диагностики и прогнозу онкологического процесса после современного комбинированного противоопухолевого лечения. В работе оценен лечебный патоморфоз по классификации Лавниковой Г.А. (1976), Dworak J (1997), определена экспрессия иммуногистохимических маркеров (Ki-67, p63, p53, CDX-2, цитокератинов: ЦКР 5/6, ЦКР 7, ЦКР 20), показатели общей и безрецидивной выживаемости. Статистическая обработка осуществлялась в программе Statistica 8 с применением многофакторного дисперсионного анализа, Кокс теста, построены кривые выживаемости без прогрессирования и общей выживаемости с использованием метода Каплан-Майера, логранговый критерий, таблицы сопряженности 2х2.
Ключевые слова: степень лечебного патоморфоза, комбинированное лечение, прогностическое значение, моле-кулярно-биологические маркеры.
Актуальность: На современном этапе противоопухолевого лечения возникла необходимость морфологической оценки опухоли после терапевтического воздействия [1,2]. Прежние классификации степени лечебного патоморфоза по Dworak J. 1997, Лавниковой А.Г., 1976, и Mondard A.M. et. al., 1994, учитывают только процентное соотношение доли опухолевых комплексов к площади гистологического среза, наличие лечебных форм, ядерный полиморфизм опухолевой клетки [4,5]. При этом не учитываются иммуноморфологические характеристики опухоли [3].
В РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН внедрена программа комплексного противоопухолевого лечения, включающей применение двух радиомодификаторов: локальной гипертермии СВЧ курсом 4-5 сеансов, 2 раза в неделю, при температуре 41-43°С, в течение 60 мин с интервалом 72 часа, в 3,4,5 дни лучевого облучения вместе с внутриректальным введением полимерной композиции метронидазола в дозе 10 гр/м2/сут, в 3 и 5 сеансы лучевой терапии и приемом кселоды в дозе 1300 мг/м2/сут, курсом 5 дней (протокол №1-03/84, 1984-1990гг [1].
В связи с этим настоящая работа посвящена решению этой проблемы, определению необходимости использования молекулярно-биологических маркеров в оценке степени лечебного патоморфоза
и их зависимости от морфологического типа опухоли.
Цель исследования: определить прогностическое значение молекулярных факторов в оценке степени лечебного патоморфоза в зависимости от морфологического типа опухоли.
Материалы и методы: Работа основана на ретро- и проспективном анализе гистологических срезов 106 больных, подвергшихся неоадьювант-ному лечению по поводу рака анального канала, в отделении колопроктологии в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава РФ. В исследование включены больные с впервые морфологически верифицированным диагнозом.
Микроскопическое обследование гистологических препаратов проводилось с помощью светооп-тической микроскопии с микрофотосъемкой объектов на микроскопе «Axiostarplus» (ZEISS, Германия) с увеличением объективов х5, х10, х20, х40.
Из них 63 больным проведено иммуногистохи-мическое исследование гистологических срезов с использованием белков клеточного цикла (Ki-67, p53, p63), транскрипционного фактора пролиферации и дифференцировки кишечного эпителия (CDX-2). семейства цитокератинов (ЦКР 5/6, ЦКР7, ЦКР20),
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
По основным клинико-морфологическим критериям сравниваемые группы были однородны. Среди 106 больных 39 (36,8%) мужчин и 67(63,2%) женщин, в возрасте от 34 до 82 лет. Средний возраст пациентов составил 57,3 ± 0,96 лет.
В 46,2% случаев (n=42) опухоль локализовалась на расстоянии 0,5-4,5 см от дистального края резекции прямой кишки, 30,8% случаев составили женщины (n=28) и в 15,4% случаев мужчины (n=14).
Морфологическая характеристика опухоли включала следующие параметры: размер, глубина инвазии опухоли, степень дифференцировки, макроскопическую форму роста. Аденокарцинома различной степени дифференцировки верифицирована у 65 пациентов (61,3%) случаев, плоскоклеточный рак - у 41 пациента (38,7% случаев), соответственно.
В зависимости от глубины инвазии опухоли в 47,1% (n=50), определялся критерий T3 с прорастанием серозной оболочки и регионарной жировой клетчатки, критерий T4 определен в 30,2% (n=32) с прорастанием в соседние органы и наружный сфинктер.
В зависимости от типа роста преобладали язвенно-подобный и язвенно-инфильтративный формы роста, составляющие 39,7% (n=42) и 51,8% (n=55), соответственно.
В структуре проведенного радикального хирургического лечения наиболее часто выполнялась брюшно-промежностная экстирпация - 53,8% (n=57), брюшно-анальная резекция - 35,9% (n=38), реже выполнялась трансанальная эндоскопическая операция - в 1,9% (n=2), эвисцерация малого таза с выведением мочи по Брикеру - в 0,9% (n=1), без оперативного вмешательства наблюдались 8 пациентов (7,5% случаев).
Статистическая обработка данных произведена с использованием разработанной базы данных программ Microsoft Excel 2007, IBM SPSS Statistics 8. Достоверность различий определялась по критерию хи-квадрант (%2), точному критерию Фишера и t-критерию Стьюдента. Критерий выживаемости оценивался по методу Каплана-Мейера, логранго-вому критерию. Для оценки доли влияния изучаемых факторов на показатели выживаемости, экспрессию индекса Ki-67, дискомплексацию желез применялся многофакторный дисперсионный анализ.
Результаты: анализируя степень лечебного па-томорфоза в зависимости от экспрессии Ki-67, выявлено, что отсутствие степени лечебного патомор-фоза определяется в 17,4% случаев (n=11) при высокой пролиферативной активности, Ki-67 выще
медианы, (>54%) и в 11,2% случаев (п=7) - с низким значением пролиферативной активности, Кь 67 ниже медианы (<54%), соответственно, р>0,05.
Риск определения значения Кь67 ниже медианы (<54%) в группе с наличием лечебного пато-морфоза в 1,1 раза выше, по сравнению с высоким Кл-67, однако разница между изучаемыми признаками статистически не значима, 95% ДИ 0,376-3,509, р>0,05.
При анализе зависимости экспрессии индекса пролиферативной активности и белков клеточного цикла (онкосупрессора р63) выявлена тенденция экспрессии этого маркера в группе больных с высоким значением индекса Кь67. Между экспрессией Кь67 и р63 коэффициент корреляции (^ ) составил +0,15, р> 0,05.
При анализе ядерной экспрессии регулятора клеточного цикла и апоптоза р53 в зависимости от значения Кл-67, экспрессия р53 выявлена, в группе больных со значением Кл-67 выше медианы (68%), составляя 22,2% случаев (п=4).
Зависимость экспрессии маркеров клеточного цитоскелета (цитокератинов) и пролиферативной активности (Кл-67), использованы ЦКР 5/6, ЦКР 7, ЦКР 20, Кл-67. Положительная цитоплазматиче-ская экспрессия ЦКР 5/6 наиболее часто определялась в группе со значением индекса Кь67 выше медианы (>68%), составляя 11,9% случаев (п=5), напротив, отсутствие экспрессии ЦКР 5/6 с Кь67 ниже медианы (<68%) определяется в 2 раза реже, составляя 4,7% случаев (п=2). Корреляционная связь между экспрессией индекса Кь67 и цитоке-ратинами ЦКР 5/6 составила, ^=-0,032, р> 0,05.
Анализ цитоплазматической экспрессии ЦКР 7 и ядерной экспрессии CDX-2 выявил, тот факт, что экспрессия ЦКР 7 и CDX-2 в группе больных со значением Кь67 выше медианы (>68%) и ниже медианы (<68%) определялась с одинаковой частотой, составляя 16,7% случаев (п=7) и 11,9% случаев (п=5), соответственно. Корелляционная зависимость между экспрессией Кь67 и ЦРК 7 составила, ^=+0,14, между экспрессией Кл-67 и CDX-2, г =-0,12, соответственно, р>0,05.
Цитоплазматическая экспрессия ЦКР 20 определена с одинаковой частотой в группах пациентов с индексом Кь67 выше (>68%) и ниже медианы (<68%): в 19% (п=8) и 16,7% случаев (п=7), соответственно, р>0,05.
Определение степени значимости изучаемого фактора на экспрессию индекса Кл-67 их 6-ти представленных, проводилось с помощью множественного линейного регрессионного анализа (см.табл. 1).
Таблица 1
Стандартизованные коэффициенты влияния экспрессии молекулярных факторов на экспрессию индекса Ki-67
Молекулярные факторы риска Beta -коэффициент р
CDX-2 (+) -0,39 0,13
ЦКР 20 (+) +0,34 0,22
p53 (+) +0,25 0,21
ЦКР5/6 (+) +0,16 0,53
р63 (+) -0,1 0,63
ЦКР 7 (+) +0,084 0,71
В результате проведенного многофакторного линейного регрессионного анализа наиболее высокие значения beta-коэффициента определялись в срезах с положительной экспрессией CDX-2, ЦКР 20, р53 ^а-коэффициент -0,39 +0,34 +0,25), соответственно р> 0,05.
Используя коэффициент корреляции Спирмана определена умеренная позитивная, корреляционная статистически достоверная связь между экспрессией ЦКР 7 (+) и СDX-2 (+), +0,42 ЦКР 20 (+) и СDX-2 (+), ге= +0,57, ЦКР 7(+) и ЦКР 20 (+),
+0,42, ЦКР 20 (+) и ЦКР 5/6 (+), Га= +0,47, р63 и ЦКР 5/6 (+), Га= +0,47, р <0,05.
Таким образом, определяется взаимосвязь нескольких цитоплазматических маркеров (ЦКР5/6, ЦКР7, ЦКР20) и ядерных молекулярных маркеров: CDX-2, р63. Однако между экспрессией изучаемых маркеров в группах со значением К1-67 выше и ниже медианы статистически значимой взаимосвязи не обнаружено.
Риск инвазии в группе пациентов со значением К1-67 ниже медианы (<68%) в среднем в 6,23 раза (ДИ 1,15-33,77) выше, чем у пациентов со значением К1-67 выше медианы (>68%, р <0,05) (табл.2).
Таблица 2
Относительные показатели риска критерия T3-4 в зависимости от значения индекса Ю-67 (п=42)
Отношение шансов Значение показателя риска 95% доверительный интервал
6,231 1,150-33,771
Риск инвазии для К1-67 выше медианы (68%) 0,244 0,060-0,999
Риск инвазии для Ю-67 ниже медианы (68%) 1,523 1,045-2,221
В группе пациентов со значением индекса Ki-67 выше медианы (68%) метастазы в лимфоузлах регионарной клетчатки встречались в 31,7% случаев (n=20), в группе пациентов со значением индекса Ki-67 ниже медианы -в 30,1% (n=19), соответственно. Корреляционная связь (rs) между наличием лечебного патоморфоза и статусом регионарных лимфоузлов составила rs =+0,016, р> 0,05.
К показателям эффективности противоопухолевого лечения относят уровень безпрогрессивной и общей выживаемости, количество умерших, после комбинированного противоопухолевого лечения.
В группе со значением К1-67 ниже медианы доля, выживших составляет 55% (п=11), по сравнению с высоким значением К1-67, составляющая 90,9% случаев (п=20), то есть в группе выживших в 1,8 раза чаще определяется высокая пролифератив-ная активность, по сравнению с низким К1-67, р<0,05.
На рисунках 1,2 определяются кривые выживаемости, методом Каплана -Майера, п=106 пациентов
Рисунок 1 - Кривая выживаемости без прогресси- Рисунок 2 - Кривая общей выживаемости пациен-рования, пациентов, страдавших раком анального тов, страдавших раком анального канала, метод канала, метод Каплана-Майера, п=106.__Каплана-Майера, п=106._
Средние показатели выживаемости без прогрессирования при аденокарциноме, в cравнении с плоскоклеточным раком, составили 57,87 мес и 65,5 мес, соответственно, р=0,003 (рис.3).
Безрецидивная выживаемость (метод Каплан-Майера) о Заверш. + Цезурир.
3 m
I 0,6
%
О—; -1 6
\ т 6.
о о—: -о-—- \
6 ....."1
■ -
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Срок жизни,мес
аденокарцинома плоскоклеточный рак
1,0
0,8
0,4
0,2
0,0
-0,2
Рисунок Э-Зависимость выживаемости без прогрессирования от морфологического типа опухоли, р = 0,003 логранговый критерий.
Выводы: В результате проведенного многофакторного линейного регрессионного анализа наиболее высокий beta-коэффициент определялся с положительной экспрессией CDX-2, ЦКР 20, p53 (beta-коэффициент составил-0,39+0,34+0,25), соответственно, p> 0,05.
1. Определяется взаимосвязь цитоплазматиче-ских (ЦКР 5/6, ЦКР 7, ЦКР 20) и ядерных молекулярных маркеров (CDX-2, p63). Позитивная корреляционная связь обнаружена, между экспрессией
ЦКР 7 (+) и СDX-2 (+), г8== +0,42 ЦКР 20 (+) и СDX-2 (+), гк=+0,57, ЦКР 7(+) и ЦКР 20 (+), г8= =+0,42 ЦКР 20 (+) и ЦКР 5/6 (+), гк==+0,47 p 63 и ЦКР 5/6 (+), гк==+0,47, р <0,05.
2. Риск инвазии в группе пациентов со значением Кь67 ниже медианы (68%) в среднем в 6,23 раза выше, чем у пациентов со значением й-67 выше медианы (68%) (ДИ 1,15-33,7), р <0,05.
3. Средние показатели выживаемости без прогрессирования при аденокарциноме, в cравнении с
плоскоклеточным раком, составили 57,87 мес и 65,5 мес, соответственно, р=0,003
ЛИТЕРАТУРА:
1. Барсуков Ю.А. Полирадиомодификация в комбинированном лечении рака анального канала. // Москва. -2009. -С.39-40.
2. Давыдов М.А. Аксель М.Е. Статистика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в 2000 году // М. -2001. - С. 136-137.
3. Зенюкова Т.В., Перевощиков А.Г., Барсуков Ю.А. Ядерный пролиферативный антиген и степень
лечебного патоморфоза в клетках аденокарциномы анального канала после комплексного лечения // Российский онкологический журнал. — Вып.№5- 2014-С.42-46.
4. Расулов А.О., Щелыгин Ю.А., и др. Прогностическая значимость регрессии рака прямой кишки после предоперационной химиолучевой терапии / А.О. Расулов, Ю.А. Щелыгини др.// Вестник рентгенологии и радиологии. -2011. - №5. - С. 28-33.
5. Dworak O., Keiholz L., Hoffman A. Pathological features of rectal cancer after preoperative radiochemo-therapy.Int J Colorectal Dis (1997)12(1):19-23. doc: 10.1007/s003840050072
THE МОRPHOLOGY AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY FACTORS OF THE DIAGNOSIS AND PROGNOSIS IN THE CANCER ANORECTALE REGION
Zenyukova T.V.
Blochin Cancer Research Center of Russian, Moscow, Russian Federation
Annotation. The article is devoted to problems of diagnosis and prognosis of the tumours progression after the combine modern antitumor treatment. The author evaluated the therapeutic classification of the tumour regression grade by Lavni-kovoy G.A. (1976), Dworak J. (1997), defined immunohistochemical, molecular-byological markers (Ki-67, p63, p53, CDX-2,citokeratins: CK 5/6, CK 7, CK 20,), such as indicators of overall and disease-free survival. Statistical processing was performed with program Statistica 8, using multivariate dispersion analysis of the variance, Cox test, and the survival curves are constructed using the Kaplan-Meier method, log-rank test, contingency tables 2x2.
Key words: tumor regression grade, combine chemoradiotherapy, predictive value, molecular-byological markers.
REFERENCES
1. Barcukov U.A. Polyradiomodification in combine treatment of the anal cancer // - Moscow -2009. -P. 39-40.
2. Davidov M.I., Axel M. E. Statistics of the morbil-ity and mortality cases from malignant tumours in 2000 year//M. -2001. - P. 136-137.
3. Zenukova T.V. Perevoschikov A.G., Barsukov U.A. Indicators proliferative activity of the tumours and
therapeutic responsiveness in adenocarcinoma of anal canal after combine therapy// Russian oncology Journal. 2014. - Vol(19). -№5.- P.42-46.
4. Rasulov A.O., Sheligin U.A. et al. Prognostic value of the tumour regression grade of the rectum cancer after preoperative chemoradiotherapy / A.O. Rasulov, U.A. Sheligin A.O.// Journal of Radiology. -2011. - №5. - C. 28-33.
5. Dworak O., Keiholz L., Hoffman A. Pathological features of rectal cancer after preoperative radiochemo-therapy.Int J Colorectal Dis (1997)12(1):19-23. doc: 10.1007/s003840050072
