CC BY
76
УДК: 616-001.4-018+612.11]:615.849.19
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА И ЕГО КЛЕТОЧНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ ПОД ВЛИЯНИЕМ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАНЫ КОЖИ
Н.В. ЗОЛОТЕНКОВА*, М.В. МНИХОВИЧ*, В.А. ГРАЧЕВ**
В статье проведено исследование влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на состояния микроциркуляторного русла и его клеточного микроокружения в условиях экспериментальной резанной раны кожи. Исследование проводилось с помощью описательной морфологии, гистологического метода и трансмиссивной электронной микроскопии.
Ключевые слова: низкоинтенсивное лазерное излучение, клеточное микроокружение, морфология, гистология, микроскопия.
Теоретические основы учения о гистогенезе и регенерации позволяют полнее раскрыть сложные процессы, происходящие в области дефекта органа и в прилегающих областях, где возникает сложная по клеточному составу и изменяющаяся во времени гистологическая картина. Мало изучены проблемы межтканевых и межклеточных взаимодействий, пространственно-временная характеристика тканей на разных этапах заживления раны. Регенерация раны рассматривается как результат многофакторных событий. Развитие науки и медицины, позволяет все более детально изучать раневой процесс. Одним из важнейших факторов, открытых при этом является стадийность этого процесса [1,2,6]. Практически все репаративные явления проходят на фоне воспалительной реакции, в которой клетки крови и соединительной ткани играют определяющую роль. Воспалительную реакцию с точки зрения морфолога можно подразделить на лейкоцитарную, макрофагальную и фибробластическую стадии. Проблема роли каждого из упомянутых клеточных элементов в воспалении и последующей регенерации многообразна и требует экспериментального изучения по многим направлениям [2,4,5]. Соединительнотканные волокна и фибробласты играют важную роль в процессе заживления ран, создание опорно-механического каркаса и пространственном построении регенерирующей соединительной ткани [1,3,6,7]. Молодая соединительная ткань развивается за счет роста капилляров, которые, в свою очередь, продвигаются за фибробластами и не могут существовать без них. Фиб-робласт является клеткой наиболее устойчивой к гипоксии и миграция их происходит по гипоксическому градиенту [6].
Цель исследования - изучение связи состояния микроцир-куляторного русла и его клеточного микроокружения под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в условиях экспериментальной раны кожи.
Материалы и методы исследования. Работа проводилась на беспородных белых крысах весом от 100 до 150 граммов.
В области нанесения ран, на правой боковой поверхности тела предварительно выстригался, а затем выбривался участок волосяного покрова. Место нанесения экспериментального повреждения в каждом опыте у всех животных было постоянным. Раны наносились под эфирным наркозом в стерильных условиях. С помощью остроконечных ножниц удалялся лоскут кожи 2,0х2,0 см с подкожной клетчаткой.
В эксперименте в качестве источника лазерного излучения использовали аппарат на гелий-неоновой основе ЛГ-75 с длиной волны 0,63 мкм и мощностью на выходе 13 мВт / см2. Облучение проводили 2 раза в неделю в течение 10 минут. Диаметр фокусируемого пятна составлял в среднем 2,0 см.
По окончании экспериментов, в строго определенные сроки (5, 10, 15, 30, сутки) животных выводили из опыта согласно «Правил проведения работы с использованием экспериментальных животных» и приказу «О гуманном обращении с экспериментальными животными».
Материал проходил стандартную проводку, заливался в парафин. Парафиновые срезы окрашивались гематоксилином — эозином, по Ван-Гизону, резорцин-фуксином; ретикулярные волокна выявлялись по Футу, определялись РНК по Браше, ДНК по Фельгену, нейтральные PAS и кислые мукополисахариды.
* Кафедра патологической анатомии, Первого Московского медицинского университета им. И.М. Сеченова
Центральная патологоанатомическая лаборатория, Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН
Фрагменты ткани, полученные из различных участков раны были использованы для электронно-микроскопического исследования, при этом материал префиксировали в 2,5% растворе глу-тарового альдегида, рН 7,3-7,4 в течение 4 часов. Постфиксиро-вали в 1% растворе 0б04 на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Дегидратацию материала проводили в батарее с возрастающей концентрации этанола и ацетона. Образцы заключали в заливочную смесь аралдита, аралдита М и эпона-812. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца.
Для оценки гистологических препаратов использовались основные морфометрические методы: определение абсолютных величин отдельных структур с помощью микроскопической линейки, а также их относительного количества в единице площади с помощью окулярной сетки по Г.Г. Автандилову. При оценке гистологических препаратов определялись следующие морфометрические показатели: количество капилляров на 1 мм площади, диаметр капилляров с последующим расчетом степени капил-ляризации.
Результаты и их обсуждение. При изучении гистологической картины микроциркуляторного русла мы получили следующие результаты (табл. 1): как видно из таблицы подсчет количества капилляров на единицу площади к концу лазеротерапии в опытной группе показал существенное увеличение их абсолютного числа - на 49,6% по сравнению с контролем. Одновременно с этим выявлено некоторое уменьшение их диаметра, по сравнению с контролем на 21,5%, а также увеличение их суммарной площади на 27,8%. При этом радиус капиллярной диффузии уменьшался на 7,5%.
У животных контрольной группы, не получавших лазерного воздействия сосудистая сеть дермы и гиподермы в области нанесения раны увеличивалась за счет расширения капиллярной сети, при этом количество их практически не изменялось.
Достоверно изменяется и плотность капиллярной сети при воздействии лазеротерапии на кожную рану (табл. 2).
Такая реакция капилляров может быть вызвана опосредованным воздействием на сократительные компоненты некоторых клеток эндотелия, располагающихся в ветвлениях капиллярных петель и регулирующих местный кровоток в локальном отрезке этих сосудов.
Таблица 1
Морфологические показатели после прямого лазерного воздействия на экспериментальную кожную рану (30-е сутки после операции)
№ Морфологические показатели опыт контроль
1 Количество капилляров (на 1 мм) 595±43 318±23
2 Диаметр капилляров (в мкм) 6,9±0,05 8,8±0,03
3 Процент площади капилляров 46,6±1,2 38,4±3,0
4 Степень капилляризации 2,41±0,01 1,74±0,06
Таблица 2
Динамика изменения числа функционирующих капилляров при воздействии низкоинтенсивным лазерным излучением на экспериментальную кожную рану
№ Сроки показатели 10 сутки 15 сутки 30 сутки контроль
1 Плотность капилляров 433+86 638+79 945+52 322+55
2 Достоверность Рк >0,1 Рк >0,1 Рк <0,001 Рк <0,001
Микроскопически рана у контрольных групп животных на 5 сутки состоит из трех слоев: поверхностного лейкоцитарнонекротического, фиброзно-лейкоцитарного и слоя молодой грануляционной ткани. Лейкоцитарно-некротический слой содержит скопления фибрина, большое количество расширенных сосудов и сосудистых полостей, скопления лейкоцитов и лимфоцитов, а также очаги деструкции и некроза (рис. 1). Он отделен от молодой грануляционной тонким слоем фибробластов, под которым обнаруживаются поля, состоящие из лейкоцитов, лимфоцитов и фибробластов (Фб) различной степени зрелости (рис. 2).
Грануляционная ткань, выполняющая дно дефекта, состоит преимущественно из лимфоцитов и клеток фибробластического ряда (КФбР). В грануляционной ткани наблюдаются неравномерное расположение сосудов в различных участках, широкие сосудистые полости, в глубоких слоях грануляционной ткани сосуды имеют вертикальный ход. В стенках сосудов выявляются очаги плазматического пропитывания. Вблизи очагов пролиферации эпидермиса обнаруживаются сосуды мелкого калибра, располагающиеся в различных направлениях. В краевых отделах
раны наряду с участками десквамации некротически измененного эпидермиса имеются зоны с резко истонченным эпидермисом с сохраненным базальным слоем, представленные 1-2 рядами клеток, и небольшие очаги пролиферации эпителиальных клеток. Новообразованный эпидермальный пласт (ЭП) без четкого разграничения на слои проникает под лейкоцитарно-некротический слой грануляционной ткани.
Рис.1. Морфология раны на 5 сутки после нанесения. Контрольная группа животных. Окраска гематоксилином и эозином; Х 120
Рис. 2. Ультраструктурные элементы раны на 5 сутки после нанесения. Контрольная группа животных. Контрастирование цитратом свинца; Х 2500
В опытной группе уже на 10 сутки определялась отчетливая регрессия патологических изменений при высокой активности регенеративных процессов. Зоны предшествующего некроза замещались созревающей грануляционной тканью. Очаговые полиморфноклеточные инфильтраты с примесью нейтрофильных лейкоцитов обнаруживались преимущественно в составе разрозненных масс фибринозного экссудата на поверхности раны. В гиподерме резко сокращалась распространенность экссудативных и деструктивных изменений, приобретающих мелкоочаговый характер. Типичной была активация макрофагов и фибробластов, существенно редуцировалась сосудистая реакция. В формирующемся регенерате в центре раны в поверхностных и глубоких отделах между пучками коллагеновых волокон выявляются лимфоциты, макрофаги и КФбР (рис. 3). Небольшие очаги инфильтрации обнаруживаются и в прилежащей к дефекту дерме. Плотность расположения сосудов здесь высока, но в каудальной области раны она значительно ниже. Отдельные сосуды имеют вертикальный ход. Обнаруживаются также расширенные сосудистые полости (рис. 4).
Рис. 3. Ультраструктурные элементы раны на 10 сутки после нанесения. Опытная группа животных. Контрастирование цитратом свинца; Х 4500
Рис. 4. Полнокровие сосудов с очагами пролиферации эндотелия в опытной группе животных на 10 сутки. Полутонкий срез. Окраска азур 2-фуксином. Х 400
В контрольной группе раневой процесс отличался более вялой динамикой. Область гнойного воспаления была покрыта сплошным пластом экссудата и продуктов тканевого распада. Достаточно обширные очаги гнойной экссудации и тканевой деструкции выявлялись в различных областях раны, чередуясь с островками формирующейся грануляционной ткани. Обращала на себя внимание стабильность сосудистых расстройств: дилатация капилляров и венул, краевое стояние лейкоцитов, паравазальная гидратация интерстиция. Степень созревания грануляционной ткани была различной - очаги типичной «молодой» грануляционной ткани имели преимущественно поверхностную локализацию.
Раневая полость на 15 сутки у опытных животных заполнена грануляционной ткани. В краевых отделах раны формируется ЭП, наползающий на грануляционную ткань. Отличительной особенностью репаративного процесса является формирование полей соединительной ткани, представленной тонкими, хаотично расположенными пучками КВ. Плотность сосудов и сосудистых полостей остается по-прежнему высокой. В краевых отделах раны выявляются очаги с сохраненным, но резко истонченным эпидермисом, под которым обнаруживаются придатки кожи с высокой плотностью расположения формирующих ЭП эпителиальных клеток, прорастающие над грануляционной тканью в центральные части дефекта. В крупных артериях мышечноэластического типа и венах отмечали полнокровие. Артериолы также полнокровны, просвет их щелевидный (рис. 5). Проницаемость сосудистой стенки - умеренная, периваскулярный и интерстициальный отек незначительный. Мышечные волокна извитые.
В контрольной группе на 15 сутки патологические изменения были значительно пролонгированы. Поверхность раны контрольной группы животных была локально покрыта экссудатом, в гиподерме разрастание и созревание грануляционной ткани сочеталось с персистенцией очаговых воспалительнодеструктивных явлений. Выявлялись локусы некроза жировой ткани, скопления нейтрофилов. Особенности коллагеногенеза и архитектоники зрелой соединительной ткани, представленной преимущественно плотными фиброзными тяжами (рис. 6), свидетельствовали о риске развития впоследствии грубого рубца.
Рис. 5. Ультраструктура артериолы в гиподерме в опытной группе животных на 15 сутки эксперимента. Контрастирование цитратом свинца; Х 4500
Рис. 6. Хаотичное расположение соединительно тканных элементов в контрольной группе животных на 15 сутки опыта. Формирование рубца.
Окраска пикрофуксином; Х 240
Через 30 дней у животных опытной группы наступает полная эпителизация раны. На месте повреждения формируется соединительнотканный рубец, покрытый блестящими чешуйками. Рубец тонкий, подвижный и имеет гладкую поверхность. Новообразованная соединительная ткань состояла из нежных пучков коллагеновых волокон различных клеточных элементов (активных фибробластов, макрофагов, лимфоцитов и др.). Площадь, занимаемая грануляционной ткани, уменьшена. Практически только в центральной части раны сохраняются небольшие очаги с большим количеством капилляров, переполненных кровью. Между капиллярами выявляются круглоядерные клетки, большое количество периваскулярных форм тучных клеток (рис. 7) и в небольшом объеме - КФбр различной степени зрелости, расположенные хаотично. Волокнистая строма в краевых отделах раны представлена тонкими неупорядоченно расположенными коллагеновыми и ретикулиновыми волокнами. В более глубоких отделах грануляционная ткань содержатся более плотные пучки КВ, расположенные параллельно поверхности дефекта. КВ формирующегося регенерата проникают в виде пучков в подлежащую соединительную ткань кожи. Между КВ располагаются фибробласты с резко расширенными цистенрнами эндо-плазматической сети (рис. 8) и фиброциты, в основном ориентированные своей длинной осью параллельно пучкам коллагеновых волокон. В краевых отделах раны на значительном протяжении обнаруживается новообразованный утолщенный ЭП. Он четко
разделяется на слои и простирается над участками рубцовой ткани, отличающейся от таковой в предыдущих сериях эксперимента характером расположения КВ и цитоархитектоникой. КВ не формируют плотные пучки, между ними очагами располагаются КФбР и единичные сосуды.
4»
С 4 Ж
( »» * т %
Рис. 7. Периваскулярное расположение тучных клеток и полнокровие сосудов в опытной группе животных на 30 день опыта. Окраска гематоксилином и эозином; Х 240
Рис. 8. Ультраструктура фибробласта:резко расширенные цистерны ЭПС в гиподерме в опытной группе животных на 30 сутки эксперимента.
Контрастирование цитратом свинца; Х 25000
В контрольной группе эффект торможения регенерационного процесса достаточно выражен. Края раны сильно гипереми-рованы, значительно выдаются над окружающей кожей и имеют неровную поверхность. Образующийся струп имеет вид толстого фрагментированного слоя. Он неплотно прилегает к краям раны и из под него долгое время выделяется серозно-гнойный экссудат. В контрольной группе, образующийся рубец имеет неровную поверхность и значительно выступает над окружающей кожей, заметно деформируя ее. Микроскопически наблюдаются три процесса в регенерации полнослойной кожной раны: реорганизация грануляционной ткани, эпителизация, формирование и перестройка рубца. Дно раны выполнено грануляционной тканью с большим количеством сосудов, сохраняющих вертикальное расположение. Определяются участки без эпителизации с плотной фиброзной тканью, представленные пучками параллельно расположенных КВ, между которыми располагаются единичные Фб. Такие участки могут граничить с зонами новообразованного эпидермиса. Плотность расположения сосудов уменьшена. В краевых отделах раны на значительном протяжении обнаруживается новообразованный эпидермис с четким разделением на блестящий и базальный слои, простирающийся над участками соединительной ткани, состоящей из КВ, расположенных параллельно поверхности дефекта. К таким участкам прилежат пласты материнской кожи, имеющие истонченный эпидермальный слой, в дерме сохранены волосяные луковицы. В глубоких отделах дермы определяются расширенные сосуды, закупоренные плотными базофильными массами. Мышечная ткань вблизи зоны дефекта - с деструктивно измененными мышечными волокнами,
между которыми определяются тяжи новообразованной соединительной ткани.
Данные визуальных наблюдений находятся в соответствии с микроскопическими изменениями, происходящими в области повреждения.
Таким образом, морфологические исследования показали уменьшение экссудативных явлений, микроциркуляторных расстройств и нейтрофильной инфильтрации в области раны под действием НИЛИ в ранние сроки эксперимента. В более поздние сроки (начиная с 7 суток) НИЛИ способствует формированию полноценных грануляций, богатых новообразованными сосудами. Характерно, что созревание соединительной ткани под действием таких физиотерапевтических процедур происходит более равномерно по всей зоне дефекта, в то время как у животных, не получавших облучения НИЛИ, на периферии зоны поражения и подновообразованным эпителием расположена более зрелая соединительная ткань, а в центре и дне до 15 суток сохраняются очаги кровоизлияний, лейкоцитарная инфильтрация, отек, нарушения микроциркуляторного русла в виде застойного полнокровия, краевого стояния лейкоцитов, набухания клеток эндотелия. На 30 сутки эксперимента в грануляционной ткани и в дерме прилежащей интактной кожи у крыс основной группы перива-скулярно обнаруживается большое количество тучных клеток.
Нам представляется следующая схема ауторегуляции репа-ративного процесса, по которой сначала происходит резорбция макрофагами продуктов распада коллагеновых фибрилл; затем индукция коллагеногенеза путем клеточных контактов между макрофагами и фибробластами. По мере накопления коллагена происходит ингибиция фибриллогенеза, что и является заключительным этапом процесса ауторегуляции. В регуляции репара-тивных процессов велика роль межклеточных контактов и межклеточных взаимодействий. Очевидно, что от них во многом зависит течение и исход фибропластических процессов, сбалансированность коллагенообразования. Кроме контактов макрофагов с фибробластами, о которых уже говорилось, во все фазы регенерации обнаружены лимфоцитарно - фибробластические контакты и макрофагально - тучноклеточные ассоциации. Предполагается, что лимфоцитарно-фибробластические контакты имеют значение в пролиферативной активности фибробластов и служат одним из механизмов контроля правильного развития клеток фибробластического ряда. Во втором случае предполагается, что клетки в ассоциациях могут обмениваться своим содержимым. Кроме того, выявляются некоторые особенности изменений взаимоотношений клеток разных тканей при регенерационном гистогенезе. Рыхлая соединительная ткань кожи представляет собой многодифферонную структуру, в состав которой входят макрофаги, гранулоциты, тканевые базофилы, плазмоциты. Все они имеют разную степень дифференцировки и специфическую ультраструктурную организацию. Фибробласты составляют основной дифферон соединительной ткани. При заживлении ран устанавливается корреляция между клетками одной линии диф-ференцировки, а также между клеточными элементами различных дифферонов. Взаимодействия осуществляются путем межклеточных соединений, с помощью растворимых медиаторов (лимфокины, монокины, фиброкины и др.), нерастворимых структурных медиаторов (коллагеновые волокна, протеогликаны, гликопротеины), а также продукты распада клеток и промежуточного вещества. При заживлении ран клетки основного фиб-робластического дифферона постепенно занимают ведущее место в грануляционной ткани.
Таким образом, регенерация, как правило, происходит за счет основного клеточного дифферона ткани, однако в тесном взаимодействии с клетками дополнительных дифферонов. Известно, что разные средства стимуляции регенеративных процессов, по-разному изменяли продолжительность и выраженность его стадий, т. е. влияния на внутреннюю структуру процесса, клеточно-тканевой состав регенерата.
Заживление раны характеризуется комплексом процессов, специфичных для каждого уровня организации живого. В замещении кожно-мышечного дефекта участвует особая структура -«грануляционная ткань». Она является высокоорганизованной развивающейся системой с несколькими источниками происхождения ее клеточных дифферонов и органных структур (кровеносных сосудов). Это позволяет выделить ее в особый тип временно существующей органно-тканевой структуры, осуществляющей регенерацию по заместительному типу в специализированных
тканях. Регуляция развития «грануляционной ткани» обеспечивается не только местными клеточными и тканевыми, но и общеор-ганизменными факторами.
Репаративные процессы в резаной ране кожи под воздействием лазерного излучения проходят все классические стадии, однако продолжительность каждой из них значительно сокращается.
Под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения в ране кожи уменьшается нейтрофильная инфильтрация, что ведет к сокращению сроков очищения ран от некротических тканей.
Гелий-неоновый лазер стимулирует иммунитет через клеточные элементы системы мононуклеарных фагоцитов в кожномышечной ране.
Лазерная стимуляция изменяет реакцию микроциркулятор-ного русла, активизируя локальный тканевой кровоток в интакт-ных и регенерирующих тканях за счет включения в кровоток ранее не функционирующих капилляров и более раннего образования новых.
Литература
1. Гаршин В.Г. Морфология заживления ран / Гаршин В.Г., Аничков Н.Н, Волкова К.Г.- М, 1951.- 125 с.
2. Карлсон Б М. Регенерация / Карлсон Б. М..- Наука.- М., 1986.- 259 с.
3. Кузин М. И. Патогенез раневого процесса / Кузин М. И., Шимкевич Л. Л. // Раны и раневая инфекция / Под ред. М. И. Кузина, Б. М. Костюченка. М.: Медицина, 1990.- С. 90-124.
4. Полежаев Л.В. Регенерация и развитие / Полежаев Л.В., Лиознер Л.Д.. - М.- Наука, 1982.- С.167.
5. Современные проблемы регенерации.// Матер. П Всесо-юзн. школы молодых ученых и специалистов по современным проблемам регенерации /Под ред.Г.Л.Билича, В.Э.Коллы.- Йошкар-Ола, 1982.- 298 с.
6. Шехтер А.Б. Грануляционная ткань: воспаление и реге-нерацияю / Шехтер А.Б., Берченко Г.Н., Николаев А.В. // Арх. Патологии, 1984.- № 2.- С. 20- 29.
7. Astaldi G.,Verga L. 10. The glycogen content of the cells of lymphatic leukemia // Acta haematol. 1957. Vol. 17. N 3. Р. 129-136
MORPHOLOGICAL ASSESSMENT OF MICROCIRCULATORY BED AND HIS CELL MICROENVIRONMENT UNDER THE INFLUENCE OF LOW INTENSITY LASER IN EXPERIMENTAL SKIN WOUNDS
N.V. ZOLOTENKOVA, M.V. MNIKHOVICH, V.A. GRACHEV
The 1s Moscow Medical University after Ï.M. Sechenov, Chair of Anatomical Pathology, Central Pathologoanatomic Laboratory
The article presents studying the effect of low intensive laser radiation on the state of microcirculation and cellular microenvironment in experimental incised wounds. The research was carried out using descriptive morphology, histology method and inoculable electronic microscope.
Key words: low intensive laser radiation, cellular microenvironment, morphology, histology, microscopy.
УДК 616-006.327+612.49+599.323.4
ИЗМЕНЕНИЯ ФОЛЛИКУЛОВ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ИНФРАКРАСНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ПО ДАННЫМ КОРРЕЛЯЦИОННОГО АНАЛИЗА
Т. Е. КАЗАКОВА, Л.И. ПОЛЯНСКАЯ*
На экспериментальной модели изучены морфологические изменения секреторного аппарата щитовидной железы на 1, 10, 30 сутки после воздействия инфракрасного лазера. Выявлены структурные изменения в фолликулярном аппарате, свидетельствующие об усилении функции щитовидной железы на 1 и 10 сутки. На 30 сутки выявлена адаптация эпителия щитовидной железы к воздействию излучения.
Ключевые слова: щитовидная железа, морфология, низкоинтенсивное лазерное излучение.
Широкое применение лазера в медицине требует экспериментального обоснования использования его в клинике. В настоящее время имеется большое количество работ, посвященных изу-
* ГОУ ВПО ИвГМА Минздравсоцразвития России, г. Иваново, пр. Ф.Энгельса 8, ГОУ ВПО ШГПУ, г. Шуя, ул. Кооперативная, д.24; E-mail: [email protected]
