CC BY
65
© ДОБРЕЦОВ К.Г., КИРИЧЕНКО А.К., СТОЛЯР С.В., ИНЖЕВАТКИН Е.В., ЛАДЫГИНА В.П., ПРОНИНА Ю.В., ИЩЕНКО Л.А., СТОЛЯР И.А.
УДК 616-091:591.1:539.1-092.9
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОРГАНОВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВНУТРИВЕННОМ ВВЕДЕНИИ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ К.Г. Добрецов, А.К. Кириченко, С.В. Столяр, Е.В. Инжеваткин, В.П.
Ладыгина, Ю.В. Пронина, Л.А. Ищенко, И.А. Столяр Дорожная клиническая больница на станции Красноярск, гл. врач - Т.А.
Иокст; Институт физики СО РАН, директор - академик РАН В.Ф. Шабанов; Сибирский федеральный университет, ректор - академик РАН
Е.А. Ваганов.
Международный научный центр исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН, Красноярск, исп. директор - проф. д.ф.-м.н. Р.Г. Хлебопрос;
ООО «Лор-пеЪ>, директор - к.м.н. М.М Зырянов.
Резюме. Настоящее исследование посвящено изучению морфологических изменений органов экспериментальных животных при внутривенном введении магнитных наночастиц. В течение 10 дней, внутривенно через день в хвостовую вену крысам вводили 0,2мл магнитных наночастиц, растворенных в дистиллированной воде. В исследовании участвовало 10 животных. С целью выявления наночастиц в тканях использовалась специфическая реакция на наличие железа - реакция Перлса. Таким образом, внутривенное введение магнитных наночастиц лабораторным животным в течение 10 дней не вызывает патологические изменения в паренхиматозных органах (печень, почки, легкие). Кроме этого, исследование доказало полное выведение наночастиц из организма в течение суток, что характеризовалось отрицательной реакцией Перлса во всех тканях.
Ключевые слова: наночастицы, морфология.
Добрецов Константин Григорьевич - к.м.н., врач-ординатор ЛОР отделения Дорожной клинической больницы на станции Красноярск; e-mail: ekdobretsov@rambler.ru
Кириченко Андрей Константинович - д.м.н., проф., заведующий патологоанатомическим отделением Дорожной клинической больницы на станции Красноярск; e-mail: krasak.07@mail.ru.
Столяр Сергей Викторович - к.ф-м.н., докторант Сибирского федерального университета; e-mail: rauf@iph.krasn.ru.
На сегодняшний день стремительно развивающимся перспективным научным направлением являются нанотехнологии. Нанотехнология изучает свойства и возможности практического применения частиц крайне малого размера различной физико-химической природы (кремний, золото, цинк, железо, алюмосиликаты, ферромагнитные и диамагнитные материалы) [5, 4, 7, 11]. Такие материалы до недавнего времени были традиционными объектами исследования у специалистов, работающих в областях физики и химии твердого тела, материаловедения, электроники, электрохимии, а основными сферами их практического применения являлись различные технические области [2, 6]. В последние годы весьма активно изучается возможность применения наночастиц в нетрадиционных областях их использования таких, например, как биология и медицина. Широко обсуждаются возможности применения наночастиц, вероятные отдаленные последствия их использования и биологическая безопасность [3, 10, 9]. Этому способствует консолидация усилий специалистов разных научных дисциплин (медики, биологи, биохимики, биофизики, химики, физики), направленные на поиск новых материалов, пригодных для применения в области практической медицины.
Целью нашего исследования явилось изучение воздействия магнитных наночастиц ферригидрита на органы и ткани при внутривенном введении лабораторным животным
Материалы и методы
В Красноярском крае в 2006 году из сапропеля озера Боровое в результате культивирования бактерий Klebsiella oxytoca были получены магнитные наночастицы. В результате проведенных исследований выяснилось, что в процессе жизнедеятельности бактерии синтезировали наночастицы минерала ферригидрита 5Fe2O3*9H2O [8].
Для выделения синтезированных в культуре наночастиц, клетки бактерий разрушались ультразвуком 5 раз по 5 мин в водном буфере, затем проводилось центрифугирование лизата при 10000 g в течение 10 мин для удаления дебрисса клеточных стенок. Для более тщательного очищения железосодержащего вещества эта процедура проводилась несколько раз. Далее полученный осадок, для удаления жирных кислот, в течение получаса оставляли в ацетоне, затем ресуспендировали в буферном растворе и проводили сепарацию в сильном магнитном поле. После этого отцентрифугированный осадок диспергировали ультразвуком в 10% буферном растворе NaOH и инкубировали в течение часа. Собранный материал несколько раз промывали дистиллированной водой и диспергировали в дистиллированной воде ультразвуком до образования устойчивого золя в водном буфере с концентрацией 1,3г/л и PH 7,0.
Выделенные наночастицы осаждали из суспензий на металлические полированные подложки и высушивали. Затем на образцы напыляли вольфрам с использованием магнетронной системы подготовки подложек «МАГ-2000-ВУ», включающей вакуумный универсальный пост ВУП-4.
Полученный ферригидрит Fe2O3-nH2O относился к антиферромагнетикам с температурой магнитного упорядочения выше комнатной (TN=340K). Вследствие малого размера частиц магнитные моменты ионов Fe3+, находящиеся на поверхности, оказывались некомпенсированными и
формировали “паразитный” интегральный магнитный момент отдельной частицы. Измеренные показатели и регистрируемые квадрупольные дуплеты указывали на суперпарамагнитное состояние исследуемых частиц.
Для морфологической характеристики органов экспериментальных животных при внутривенном введении магнитных наночастиц были выбраны паренхиматозные органы лабораторных животных (крыс), выполняющие в организме крайне важные жизненные функции: печень - основная барьерная функция, легкие - основная функция газообмена, почки - основная выделительная функция.
В течение 10 дней, внутривенно через день в хвостовую вену крысам вводили 0,2 мл магнитных наночастиц, растворенных в дистиллированной воде. В исследовании участвовало 10 животных. Через 12 дней крыс забивали с соблюдением принципов эвтаназии (применение эфирного наркоза). Образцы органов фиксировали в растворе 10% формалина. Срезы, толщиной 3-5мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизону. Изучение срезов органов производилось при увеличении в 100, 200 и 400 раз. С целью выявления наночастиц в тканях органов использовалась специфическая реакция на наличие железа - реакция Перлса [1].
Результаты и обсуждение В результате морфологических исследований внутренних органов было выяснено, что синтопия органов брюшной полости не нарушена. Печень плотно-эластической консистенции, поверхность гладкая, на разрезе краснокоричневого цвета. Почки бобовидной формы, поверхность гладкая, на разрезе корковый и мозговой слои дифференцируются. Легкие обычной формы, выполняют обе плевральные полости, мягко-эластической консистенции, на разрезе серо-розового цвета.
При обзорной микроскопии гистологических препаратов печени отмечалось, что дольково-балочная структура органа сохранена. Печеночные дольки, синусоидные капилляры, сосуды и желчные протоки имели обычное строение у всех животных. Наблюдался умеренный полиморфизм гепатоцитов и их ядер.
Встречались клетки с крупными гиперхромными ядрами, крупными и мелкими пузырьковидными ядрами. Ядра содержали 1-2 мелких ядрышка. Цитоплазма клеток животных была окрашена равномерно. Купферовские и эндотелиальные клетки хорошо выражены, их гиперхромные ядра хорошо выделялись (рис. 1).
При реакции Перлса наличие железосодержащих наночастиц в печеночной ткани не наблюдалось у всех животных (рис. 2).
При микроскопическом исследовании почек отмечалось их низкое кровенаполнение. Почечные клубочки имели обычное строение, мономорфные. Капсула клубочков не утолщена. Капиллярные петли некоторых клубочков были спавшиеся, ядра вытянутые. Эпителий почечных канальцев имел обычное строение. У эпителиолцитов проксимальных канальцев наблюдалась четко выраженная щеточная каемка. Просвет канальцев имел обычную ширину. Собирательные трубочки были хорошо выражены, содержали темные и светлые эпителиоциты (рис.3).
Как видно на рис. 4, магнитных наночастиц в тканях почки, также как и в печени, обнаружено не было (рис. 4).
Таким образом, гистоархитектоника почек животных и отрицательная реакция Перлса свидетельствуют об отсутствии токсического влияния магнитных наночастиц.
При гистологическом исследовании легких животных было выявлено, что структура органа, как и в предыдущих случаях, сохранена (рис. 5) .
Бронхи были выстланы однослойным мерцательным эпителием. Перибронхиально отмечались скопления лимфоидных клеток с формированием солитарных лимфоидных фолликулов. Кровеносное русло легких малокровно. Альвеолы были расправлены, встречались небольшие очаги ателектазов. При реакции Перлса наночастиц в тканях легких не определялось (рис. 6).
Таким образом, внутривенное введение магнитных наночастиц лабораторным животным в течение 10 дней не вызвало патологических изменений в паренхиматозных органах (печень, почки, легкие). Отсутствие изменений в гистоархитектонике почек животных свидетельствовало об
отсутствии токсического влияния магнитных наночастиц. Кроме этого, исследование доказало полное выведение наночастиц из организма в течение 2 суток, что характеризовалось отрицательной реакцией Перлса во всех тканях.
MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE ORGANS IN EXPERIMENTAL ANIMALS AFTER INTRAVENOUS INJECTION OF
MAGNETIC NANO PARTICLES K.G. Dobretsov, A.K. Kirichenko, S.V. Stolyar, E.V. Inzshivatkin, V.P. Ladygina,
Yu. V. Pronina, L.A. Ishenko, I.A. Stolyar Railway clinical hospital on Krasnoyarsk station;
Institute of physics SB RAS, Krasnoyarsk; Siberian Federal university Krasnoyarsk; International scientific center of extreme states of organism, Krasnoyarsk;
“Lor-net” Krasnoyarsk.
Abstract. The paper presents study of morphological changes in organs of experimental animals after intravenous injection of magnetic nano particles. During 10 days we injected into 10 rat’s tail vein 0.2ml of magnetic nano particle dilute in distil water. Specific Pearls reaction of ferrous detection was used to reveal nano particles in tissues. So, intravenous injection of magnetic nano particle during 10 days did not cause pathological changes in parenchyma organs (liver, kidney, lungs). Besides, we proved that nano particle totally remove from the body in 24 hours. These findings were received by negative Pearls reaction in all tissues.
Key words: nano particles, morphology.
Литература
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.
2.Гуляев А.Е., Кивман Г.Я., Шерстов А.Ю. и др. Наночастицы, как лекарственная форма обеспечивающая направленный транспорт антибиотиков в фагоциты // Медицина и экология. - 1997. - №2. - С. 76-80.
3.Кивман Г.Я., Васильев А.Е. Наноносители для внутриклеточного транспорта лекарственных веществ // Тез. докл. I Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 1992. - С. 226.
4.Киршвинк Д. Биогенный магнетит и магниторецепция: Новое о биомагнетизме. - М.: Мир, 1989. - Т.1. - 352с.
5.Паписов М.И., Самохин Г.П., Смирнов М.Д. и др. Возможности использования ферромагнитных материалов для направленного транспорта лекарств // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 1984. - Т.98, №9. - С. 372374.
6.Петрова Е.В., Дресвянников А.Ф., Цыганова М.А. и др. Физикохимические свойства наночастиц гидроксидов и оксидов железа, полученных химическим и электрохимическим способами // Вестн. Казанского технологического университета. - 2009. - №2. - С. 24-32.
7. Сороковой В.И., Лускинович П.Н., Панфилов С.А. и др.
Нанотехнологии в хирургии: современное состояние вопроса и
перспективы // Эндоскопическая хирургия. - 2002. - №1. - С. 28-30.
8. Столяр С.В., Баюков О.А., Гуревич Ю.Л. и др. Железосодержащие наночастицы, образующееся в результате жизнедеятельности микроорганизмов // Неорганич. материалы. - 2006. - Т. 42, №7. - С. 1-6.
9. Kogan M.J., Olmedo I., Hosta L. et al. Peptides and metallic nanoparticles for biomedical applications // Nanomedicine. - 2007. - Vol. 2, № 3. - P. 288-306.
10. Kreuter J. Nanoparticles - a historical perspective // Int. J. Pharm. -2007. - Vol. 333, № 1-2. - P. 1-10.
11. Lu A.H., Salabas E.L., Schuth F. Magnetic nanoparticles: synthesis, protection, functionalization, and application // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. -2007. - Vol. 46, №8. - P. 1222-1244.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ-ККФН, грант 09-04-98038-р_сибирь_а и Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013гг.
