CC BY
34
Отже, в наших дослщженнях найбшьш ефективним був метод xiMicTepanii. Ефектившсть оздоровления при хiмютeрaпп зросла вщ 15,9 до 31,7% ropiBMro з використанням методу культури меристеми та вщ 6,6 до 22,4% порiвняно з методом термотерапи.
Ефeктивнiсть оздоровлення залежала не тшьки вiд мeтодiв оздоровлення, але й вщ сортових особливостей. Так, найвища eфeктивнiсть оздоровлення досягнута у сорту Левада.
З отриманими нами оздоровленими лшями проведено мшророзмноження для наступного молекулярно-бюлопчного aнaлiзу на предмет щентичносп сортiв.
Висновки
1. Згiдно з даними 1ФА, не виявлено жодного клону, вшьного вiд вiрусiв (M, S). Клоновий добiр як метод оздоровлення е малоефективним.
2. Встановлено, що aнтивiруснi сполуки (aмiксин, aцикловiр та РНК-аза) мають стимулюючу дда на морфогенез та рeгeнeрaцiю рослин. Найбшьшу кiлькiсть рeгeнeрaнтiв отримано на сeрeдовищi з aмiксином (94 лши зi 150 видiлeних меристем). У розрiзi сортiв нaйбiльшу кiлькiсть регенерованих та оздоровлених рослин отримали у сорту Левада.
3. Частота регенераци зросла при хiмiотeрaпil вiд 39,3 до 62,7%; при термотерапи становила 33,4%; при культурi меристем - 36%.
4. Найбшьш ефективним е метод хiмiотeрaпil. Ефектившсть оздоровлення при хiмiотeрaпil зросла вщ 15,9 до 31,7% порiвняно з використанням методу культури меристеми та вщ 6,6 до 22,4% порiвняно з методом термотерапи.
Список л^ератури
1. Оздоровлення вихдного мaтeрiaлу щсшнево! кaртоплi / Н.С. Кожушко, О.Г. Войтенко, В.1. Кришталь, Л.С. Торчицька // Вiсник Сум. НАУ. - 2006. - Вип. 11, № 12. - С. 9-12.
2. Бондарчук А.А. Виродження кaртоплi та прийоми боротьби з ним. - Бша Церква: БДАУ, 2007. - 103 с.
3. Методичш рекомендаци щодо проведення дослiджeнь з картоплею. - К.: Аграр. наука, 2002. - 32 с.
4. Оптимизация прийомов оздоровления, размножения и защиты семенного картофеля от вирусной инфекции: Метод. указания. - Минск: Бел. НИИЗР, 1996. - 16 с.
5. Слободян К.А., Олшник Т.М., Слободян С.О. Оздоровлення картопт вщ вiрусних хвороб з використанням методу хiмiотeрaпil // Геном рослин: Зб. наук. ст. V Мiжнaр. конф., 13-16 жовтня 2008 р. - Одеса: Ивденний бютехнолопчний центр в рослиннищга УААН, 2008. - С. 216-219.
Рекомендовано к печати д.б.н., проф. Митрофановой О.В.
МОРФОГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ДЛИТЕЛЬНО ПАССИРУЕМЫХ КАЛЛУСНЫХ
КУЛЬТУР NICOTIANA TABACUM
В.Н. РЕШЕТНИКОВ, доктор биологических наук;
Т.И. ФОМЕНКО, кандидат биологических наук;
А.А. КУЗОВКОВА, кандидат биологических наук, Л.Г. БЕРДИЧЕВЕЦ; М.К. МАЛЮШ ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси», Минск, Беларусь
Введение
Клетки длительно пассируемых каллусных культур in vitro характеризуются снижением или даже полной утратой способности к вторичной дифференцировке и регенерации растений [3, 7]. В пассируемом каллусе реализуется только генетическая программа функционирования дедифференцированных клеток и не осуществляется переход к программе дифференцировки при создании соответствующих условий [3, 4]. Поэтому при проведении исследований необходимо оценить морфогенный потенциал многократно пассируемого каллуса и установить временную точку, в которой каллусные клетки теряют способность к морфогенезу. Важным является и выяснение зависимости величины морфогенного потенциала длительно пассируемых каллусных клеток табака от типа первичного экспланта.
С этой целью нами были проанализированы каллусы табака стеблевого и листового происхождения (продолжительность культивирования - 3 года). Известно, что реализация программ развития растительных тканей сопровождается изменением экспрессии генов растений, однако до сих пор не выяснено, какие гены могут являться маркерами отдельных процессов развития. В связи с этим особое внимание было уделено семейству генов пероксидаз (ПО), экспрессия которых, как установлено рядом авторов, контролируется факторами развития [9, 12].
Объекты и методы исследования
Для опытов и анализа использовали листья и стебли 40-дневных растений табака, выращенных в колбах, в стерильных условиях на 1/2 среде Мурасиге и Скуга (МС), при температуре 22-25°С, освещенности 3-5 клк, фотопериоде 16 ч. Образование первичного каллуса индуцировали переносом эксплантов листового и стеблевого происхождения на среду МС, содержащую 1 мг/л ИУК и 0,1 мг/г БАП, с последующим пассированием каллусов через 3 недели на этой же среде. Морфогенез в каллусе инициировали и поддерживали на среде МС с 2 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИУК. Морфогенный потенциал оценивали по количеству эксплантов с адвентивными побегами (АП) (в % к общему числу эксплантов). Оценку экспрессии генов ПО проводили по активности их белкового продукта, а также анализирую изоферментные спектры. Активность пероксидазы (ПО) определяли по методу Бояркина [1]. Экстракцию изоформ основной ПО проводили по методу Сафоновых [6] с модификацией, используя 50 мМ трис-НО буфер (рН 7,6), содержащий 5 мМ аскорбата. Содержание белка в образцах определяли по Bredford [11]. Электрофоретическое разделение ПО проводили в 7,5% ПААГ в нативной щелочной системе. Активность ПО в геле обнаруживали бензидиновым методом в модификации Чаяновой и Хавкина [8], используя на всех этапах 0,1М ацетатный буфер рН 4,5. Уровень активности отдельных изоформ ПО оценивали с помощью программы SigmaGel по данным денситометрирования.
Результаты и обсуждение
Сравнительный анализ индукции морфогенеза эксплантов листа и стебля табака показал, что на 15 сут культивирования на морфогенной среде все листовые экспланты проявляли морфогенную реакцию, в то время как для ткани стебля этот показатель на 15 сут составил 43,8 и 93,8% - на 40 сут культивирования (табл. 1). Что касается первичных каллусов табака, то на 15 сут культивирования только у 28,6% каллусов листового и у 14,3% стеблевого происхождения отмечено адвентивное побегообразование, хотя к 40-м сут все экспланты независимо от их типа демонстрировали 100% морфогенную реакцию.
Таблица 1
Динамика морфогенной активности эксплантов и пассируемого каллуса из листа и стебля табака в процессе культивирования на среде для индукции морфогенеза
Число пассажей на среде для каллусооб-разования Тип экспланта Эксплантов с АП, %
Продолжительность культиви морфогенеза (1 эования на среде для индукции -й пассаж), сут
15 20 30 40
0 лист 100,0 100,0 100,0 100,0
стебель 43,8 81,3 81,3 93,8
1 лист 28,6 61,9 85,7 100,0
стебель 14,3 33,3 95,2 100,0
7 лист 0 14,3 66,7 81,0
стебель 0 0 23,8 57,1
19 лист 0 0 28,6 47,6
стебель 0 4,8 57,1 95,2
27 лист 0 0 9,5 38,1
стебель 0 0 0 0
В длительно пассируемом каллусе морф огенный потенциал значительно снижается,
например, к 30-м сут культивирования только у 9,5% каллусов листового происхождения, при 27
пассаже отмечена регенерация побегов, а к 40-м сут - у 38,1% эксплантов. При этом каллусы стеблевого происхождения после 27 пассажа вовсе не проявляли морфогенной реакции, хотя у тех же каллусов после 19 пассажей к 30-м и 40-м сут культивирования был зафиксирован высокий процент образования побегов.
Дальнейшее длительное пассирование каллусов из листа и стебля табака на среду, содержащую 1 мг/л ИУК и 0,1 мг/г БАП (40, 50 и 58 пассажи), существенно ослабляло их морфогенный потенциал, хотя следует указать, частота пролиферации у данных каллусов была выше, чем у каллусов 7, 19 и 27 пассажей. Только двукратная пересадка каллусов 40-го и 52-го пассажей на среды для инициации морфогенеза привела к побегообразованию (табл. 2).
Таблица 2
Динамика морфогенной активности длительно пассируемых каллусов из листа и стебля табака при культивировании на среде для индукции морфогенеза
Число пассажей на среде для каллусооб-разования Тип экспланта Число пассажей на среде для индукции морфогенеза
2 3
Эксплантов с АП, % Число побегов на эксплант Эксплантов с АП, % Число побегов на эксплант
40 лист 52,4 3,5±2.0 100 5,2±4,1
стебель 14,3 1,4±0,8 100 6,8±3,7
52 лист 47,6 4,2±1,9 100 16,0±3,1
стебель 19,0 3,8±1,4 100 9,5±4,9
58 лист 0 0 54,5 6,0±1,5
стебель 0 0 10,0 2,0±1,2
Интересно, что длительно пассируемый каллус 58 пассажа проявлял морфогенную реакцию лишь после трехкратной пересадки на среду с 0,1 мг/л ИУК и 2 мг/л БАП. По нашему мнению, такая ситуация обусловлена тем, что длительное пассирование на среду для индукции каллусообразования приводит к насыщению тканей ауксинами, способствующих активной пролиферации дедифференцированных клеток, поэтому однократного пассажа на среду для индукции морфогенеза недостаточно для его проявления в каллусах уже к 19 пассажу. Эксперимент показал, что только дальнейшее пассирование каллуса на данной среде реализует программу самого морфогенеза.
Следует отметить, что увеличение срока культивирования каллуса в условиях, индуцирующих адвентивное побегообразование, способствует увеличению количества побегов на эксплант. В связи с этим становится очевидным значение фактора времени в процессе детерминации развития индивидуального побега. Период, за который каллусные клетки приобретают это свойство, варьирует в довольно широких пределах, что особенно проявляется у длительно пассируемых каллусов.
Также нами установлена обратная зависимость между уровнем активности ПО каллуса и последующей выраженностью морфогенных процессов: чем ниже уровень активности пероксидазы, тем выше морфогенная активность длительно пассируемых каллусов (сравнение данных из табл. 2 и
3).
ПО в растениях кодируется семейством генов, экспрессия которых регулируется факторами окружающей среды и развития, вследствие чего в клетках выявляются несколько ее изоформ. Некоторые из этих изоформ рассматривают как маркерные ферменты ряда процессов развития растений [5].
Нами установлено, что для табака существуют изоформы, общие для процессов дифференциации и дедифференциации клеток, и изоформы - маркеры этих процессов: а) ПО с Я/ 0,14 и 0,21 - маркерные ферменты дедифференциации клеток табака; б) в длительно пассируемом каллусе стеблевого происхождения время начала экспрессии изоформы ПО с Я/ 0,50 не определяется возрастом дедифференцированных клеток; в) ПО с Я/ 0,11 является маркером инициации и развития морфогенных процессов только в листовой ткани табака; г) экспрессия ПО с
Я, 0,26; 0,51 и 0,65 - это особенность полностью дифференцированных тканей как листа, так и стебля табака; д) изоформы основных ПО с R/ 0,02; 0,17; 0,45; 0,47; 0,52 и 0,61 не имеют четко выраженной функции в реализации какой-то одной программы развития клеток табака; 3) существует обратная зависимость по количеству изоформ основных ПО между первичными и длительно пассируемыми каллусами.
Таблица 3
Пероксидазная активность эксплантов листового и стеблевого происхождения и пассируемых каллусов табака, культивируемых на среде, содержащей 1 мг/л ИУК и 0,1 мг/г БАП
Число Активность пероксидазы, у.е.
пассажей на Тип экспланта
среде для каллусооб- на г сырой на мкг белка
разования
лист 42,4 ± 0,6 3,0 ± 0,1
стебель 66,9 ± 0,3 10,4 ± 0,3
1 листа 29,6 ± 0,4 8,7 ±0,1
стебля 24,4 ± 0,4 8,0 ± 0,2
7 каллус из листа 41,2 ±0,5 22,2 ± 0,2
стебля 43,1 ±0,2 29,8 ±0,1
19 листа 31,0 ±0,4 20,2 ± 0,5
стебля 21,8 ±0,4 11,8 ±0,2
27 листа 45,7 ± 0,3 27,0 ± 0,2
стебля 77,6 ±0,1 54,2 ±0,1
В работах Бутенко, Румянцевой и др. [2, 5] показано, что для большинства видов не удается получить регенеранты в длительно пассируемой культуре. В этой связи необходимо отметить отзывчивость табака как культурального объекта.
Выводы
Индукция активного морфогенеза в каллусных культурах, пассируемых в течение длительного периода, возможна, хотя морфогенный потенциал значительно ослабевает в процессе пассирования. Это обусловлено тем, что переключение с программы длительной дедифференциации клеток на редифференциацию адвентивных побегов происходит труднее, чем перевод дифференцированных тканей к пролиферации каллуса, что сопряжено с: остановкой реализации ранее действовавшей программы дедифференциации тканей; перестройкой на новую программу развития - дифференциацию клеток - при создании соответствующих условий для прохождения морфогенеза и осуществлением программы дифференцировки. Представленные нами результаты показали различную морфогенную реакцию для каллусов листового и стеблевого происхождения, что подтверждает тезис о доминирующем значении генетической информации клеток экспланта. Установлена корреляция между морфогенной и ферментативной активностью каллусных культур. Так процессы морфогенеза в каллусах табака сопровождаются инициацией экспрессии специфических пероксидаз.
Список литературы
1. Большой практикум по физиологии растений. - М.: Высшая школа, 1978. - 392 с.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. - М.: ФБК-Пресс, 1999. - 160 с.
3. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 3. Каллусообразование in vitro II Биополимеры и клетка. - 1997. - Т. 13, № 5. - С. 362-371.
4. Моисеева H.A. Биология культивируемых клеток и биотехнология. -М.: Наука, 1991. - С. 166-185.
5. Особенности лигнификации клеточных стенок каллусов гречихи, различающихся по способности к морфогенезу / Румянцева Н.И., Валиева А.И., Самохвалова Н.А., Мухитов А.Р., Агеева М.В., Лозовая В.В. // Цитология. - 1998. - Т. 40, № 10. - С. 835-843.
6. Сафонов В.И., Сафонова М.П. Исследование белков и ферментов растений методом электрофореза в полиакриламидном геле // Биохим. методы в физиол. растений. - М.: Наука, 1971. -С.113-119.
7. Фролова J1.B. Особенности популяций культивированных клеток // Культура клеток растений. - М.: Наука, 1981. - С. 5-16.
8. Хавкин Э.Е., Забродина М.В. Наследуемые изменения в спектрах пероксидаз и эстераз у сомаклонов кукурузы // Физиология растений. - 1994. - Т. 41, № 6. - С. 859-867.
9. Хавкин Э.Е., Забродина М.В. Органоспецифичные спектры пероксидаз у кукурузы // Физиология растений. - 1995. - Т. 42, № 2. - С. 281-289.
10. Чаянова С.С., Хавкин Э.Е. Использование нейтрального полиакриламидного геля для изоферментного анализа пероксидаз и эстераз // Физиология растений. - 1990. - Т. 37. - С. 10371039.
11. Bredford M.M. A rapid sensitive method for the action of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.
12. Van den Berg B.M., Wijsman H.J.W. Genetics of the peroxidase isoenzymes in Petunia. Part 1: Organ specificity and general genetic aspects of peroxidase isoenzymes // Theor. Appl. Genet. - 1981. - V. 60, N2. - P. 71-76.
Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.
ХАРАКТЕРИСТИКА СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ РЕГЕНЕРАНТОВ МЯГКОЙ ЯРОВОЙ
ПШЕНИЦЫ
В.Ю. СТУПКО;
Н.В. ЗОБОВА, кандидат биологических наук
Красноярский научно-исследовательский институт Сибирского регионального отделения
Россельхозакадемии, Красноярск, Россия
Введение
В связи с повышенным спросом на продовольственное зерно яровую пшеницу в Красноярском крае возделывают во всех почвенно-климатических зонах, где зачастую солонцовые пятна занимают до 10% пашни [8], что сильно лимитирует ее урожайность. В борьбе с засолением сорт является самым дешевым и доступным средством роста урожайности [1, 3]. При традиционных методах селекции сорт приходит на поля лишь через 12-20 лет. Современные технологии, генная инженерия и культура тканей in vitro могут уменьшить этот срок. Однако методы генетической трансформации имеют рад недостатков, главный из которых - ограничение введения полученных таким образом растений в рацион человека из-за возможных, по мнению ряда ученых, опасных для здоровья побочных эффектов [5], а количественная оценка реакции на стресс генетически модифицированных растений проводится крайне редко [12]. Культура изолированных растительных тканей является экологически чистой технологией, ускоряющей создание адаптивных форм зерновых культур, использующей природные резервы сомаклональной изменчивости растений. Многие ее приемы уже успешно применяются селекционерами [10], в том числе в селекции пшеницы [9, 11, 14]. Однако повторение описанных в литературе биотехнологических протоколов не эффективно из-за зависимости регенерационных процессов в каллусе от вводимого в культуру генотипа.
Целью работы являлось создание в культуре in vitro на материале сибирской селекции солеустойчивых форм мягкой яровой пшеницы и их характеристика. Для этого было необходимо решить следующие задачи: оптимизировать гормональный состав питательных сред; подобрать уровни давления селектирующего агента и параметры эксплантов; провести лабораторными методами сравнительную физиологическую оценку солеустойчивости регенерантов и их родительских форм.
