CC BY
53
Таким образом, данную мутацию, подобно ранее описанным гаметофитным мутациям табака (Колесова, Еналеена, 2001) и ряда других видов (Drews et al., 1998), можно отнести к группе мутаций, проявляющихся как в женской, так и в мужской генеративных сферах.
Литература
Еналеева Н.Х. Внутривидовая изменчивость зародышевых мешков покрытосеменных растений: теоретические и прикладные аспекты (на примере Nicotiana tabacum L.): Автореф. дис.....д-ра биол. наук. С.-Пб., 2000. 41 с.
Еналеева Н.Х., Тырнов B.C., Хохлов С.С. Выделение зародышевых мешков покрытосеменных растений путем мацерации тканей И Цитология и генетика. 1972. Т. Ь, № 5. С 439-441.
Колесова А.Ю.. Еналеева Н.Х. Состояние мужского гаметофита у мутантов Nicotiana tabacum L. с уменьшенным числом элементов в зародышевых мешках // Известия СГУ. Серия биологическая. Вып. специальный. 2001. С. 184-189.
Drews G.N., Lee D., Christensen С. A. Genetic analysis of female gametophyte development and function // Plant Cell. 1998. Vol. 10. P. 5-17.
Enalccva N.Kh. Experimental production of gametophyte mutants//In: Proc. Of the XI Intern, symp. Embryology and seed reproduction. St.Petersburg "Nauka". 1992. P. 143-144.
УДК 581.143.6: 582.765.2
МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ СОМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ СКУМПИИ
СЛ. Тимофеева
Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, г. Саратов
Скумпия дубильная (Cotimisadans coqqiqria Scop.) из сем. Сум аховые (Anacardiciceae Lindl) является одной из перспективных культур для городского озеленения, что обусловлено сочетанием высокой декоративности па протяжении всей вегетации с неприхотливостью к условиям выращивания. Кроме того, скумпия используется для получения ценного медицинского препарата танина, эфирного масла, красителей для кожи и шерсти (Колесников, ¡974).
Несмотря на столь привлекательные хозяйственно-ценные признаки, скумпия является мало распространенной культурой в Саратовской области. Интродукция и дальнейшее распространение скумпии затруднены низким коэффициентом размножения традиционными методами. Семена характеризуются низкой всхожестью, а размножение черенками строго ограничено стадией онтогенеза.
Использование методов культуры клеток и тканей дает возможность преодолеть подобные ограничения. В этой связи нами были начаты работы по изучению морфогенетического потенциала различных органов и тканей и
выявлению факторов, оказывающих влияние на инициацию и развитие стеблевых меристем скумпии в культуре in vitro.
Материалы и методы
Донором растительного материала служило 10-летнее дерево в репродуктивной фазе развития, а также однолетние саженцы из коллекции дендрария Ботанического сада (ТУ.
В качестве первичных эксплантов использовали вегетативные почки одревесневших и зеленых побегов, сегменты молодых, но уже полностью сформировавшихся листьев, верхушки однолетних вегетативных побегов длиной 2-3 см.
Срезанные в полевых условиях ветки освобождали от листьев, смывали внешние загрязнения проточной водой. Одревесневшие побега помещали в раствор синтетического моющего средства «Апрель» (CMC) на 10-15 мин, затем промывали проточной водой в течение 20-30 мин. Поверхностную стерилизацию проводили в ламипар-боксе последовательно 70% этанолом (30 сек) и диацидом (15 мин). При стерилизации зеленых побегов раствор CMC заменили на мыльный, отменили промывку проточной водой, а также уменьшили время выдержки в диациде. Срезанные листья промывали водой, затем мыльным раствором, споласкивали несколько раз дистиллятом, пофужали па 30 сек. в 70% спирт, затем - в диацид на 10-30 мин, после чего промывали стерильной водой.
Изоляцию эксплантов проводили под бинокулярной лупой в стерильных условиях ламинара. Для получения апикальных меристем отрезали верхушки побегов длиной 2-3 см; апикальные и латеральные почки освобождали от покровных чешуи и подлежащих тканей; листья нарезали на сегменты размером от 0,8-1,2 х 1,0-1,6 см.
Эксиланты помещали на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу; тиамин, пиридоксин и ни коти новую кислоту по 0,5 мг/л, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л; мезоинозит - 100 мг/л; сахарозу - 20 г/л; агар - 7 г/л; рН- 5,8-6,1.В качестве фитогормонов использовали кинетии, 6-бензиламинопурин (БАЛ), а-нафтилуксусную кислоту (КУК) в разных концентрациях и соотношениях.
Эксиланты культивировали на свету при 14-часовом фотопериоде (t =25+1С). Листовые диски в первые 10 дней культивирования притеняли.
Инициацию ростовых процессов фиксировали на 10-14 день культивирования. Последующий анализ проводили с интервалом в 7-10 дней на протяжении 2-4 мес. культивирования. Пассирование на свежую питательную среду аналогичного или измененного состава осуществляли каждые 10 - 15 дней.
Результаты и обсуждение Культура изолированных почек
В первые дни культивирования наблюдали интенсивное почернение как тканей экспланта, так и питательной среды. Согласно литературным данным (Катаева, 1986), в основе этого процесса лежит активный синтез экснлантом веществ фенольной природы, которые вызывают потемнение тканей, снижают жизнеспособность, замедляют рост и развитие и приводят, в конечном итоге, к гибели культур. Для нейтрализации данного явления используют различные варианты предварительной обработки экспланта: введение в питательную среду антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, пролина, иол и винил пиррол и дона), частое пассирование (Джонс, 1987; Катаева, 1986). В нашей работе добавление аскорбиновой кислоты в питательную среду (1 мг/л) оказалось менее результативным, чем частое неоднократное пассирование (3-5 пассажей) на свежие питательные среды аналогичного состава.
Наиболее интенсивно синтезировали фенояьные соединения почки, менее - листья и верхушки побегов.
Культивирование изолированных почек па питательной среде без гормонов приводило к почернению и гибели эксплантов на 7-10 день культивирования. Добавление фитогормонов в питательную среду положительным образом повлияло на состояние эксплантов: спустя 5-7 дней после инокуляции начинался рост культур. Почки увеличивались в размерах, листовые примордии вытягивались, образуя листовые пластинки, и зеленели. В отдельных случаях листовые пластинки разрастались, образуя листочки типичной для скумпии овальной формы.
Первичная инициация культур и положительная динамика роста были отмечены во всех изученных вариантах. При культивировании на питательной среде, содержавшей 0,5 мг/л БАЛ, в результате активации и интенсивного роста пазушных меристем формировалась типичная розетка из множества мелких зеленых листочков треугольной формы (Рис.а).
Междоузлия развивающихся побегов были сближены и в процессе дальнейшего культивирования так и не вытянулись. Ширина основания розетки в 1,5-2 раза превышала ее высочу, поэтому визуально данный тип роста мы определили как «рост вширь».
В едшшчных случаях на данной среде наблюдали прямое развитие одиночного побега с редуцированными листьями, что, по-видимому, было обусловлено эпигенетическими особенностями экспланта.
Изначально более высокие концентрации БЛГ1 (2,5 или 5 мг/ л) в среде не приводили к увеличению коэффициента размножения. Только в этих вариантах отмечали ярко выраженную витрификацию тканей экспланта.
Одновременное наличие в питательной среде БАГ1 и кинетина (1:1) вызывало интенсивный рост экспланта, определяемый как «рост ввысь» (соотношение высоты к ширине в среднем 2,5:.1). В большинстве случаев наблюдали рост одиночного крупного побега интенсивной зеленой окраски; с вытянутыми узкими листьями, плотно обхватывающими побег. Реже фиксировали рост нескольких укороченных побегов, не таких мощных и
крупных по :лкже имеющих и|>к<> зеленую окраску без некротизирующих участков. Мри дальнейшем культивировании зги различия выравнивались: в случаях преимущественного роста одиночного no6eia актм визировались пазушные меристемы, образуя новые зоны роста, в результате чего формировалась розетка, а в случаях одновременного роста нескольких побегов преимущественно развивались 2-3 побега.
!'ис. Различные ишы морфогенеза в культуре соматических тканей скумпии .1 шептан розетка. ииразокавшаяии из вегсгатиииой почки ни среде М$, ЬАП 0,5 М1 .1 ' почка с рачвсрнунпшмисм .нкючкачи насрслс Мч. ЬАП 1.0 М1.'л. ПУК 0,5 мг/н. 1. ловки. апикальные мермечемы. развившиеся я результате пассирования первичных розеток па среду МХ. ЬАП 2.5 мг<\ч
I юбу чариая структура, сформировавшаяся на кромке листового диска на среде М$. БАП 1.Н мг/л," ПУК" 0.1 мг/л.
При культивировании почек на питательной среде, содержавшей БАП и ПУК (1,0 и 0,1 мг/л) в первые 2-3 недели наблюдали только незначительное увеличение размеров жепланта. 'Затем начинался стремительный рост нитрифицированных и аномальных листьев - узких и длинных (до 10 мм :. вол 11 исто - изогнуты х. буро-коричневых. Образованная розетка по форме напоминала морскую звезду. Дальнейшее субкультивирование в течение 4 месяцев не изменило размеры или форму розетки и только поддерживало существование культур без качественных изменений.
Рост и развитие почек на среде, содержавшей одновременно 1,0 мг/л БАП и 0.5 мг/л ПУК. в целом было аналогично таковому на среде, содержавшей только 0,5 мг/л ЬАП. Отличия проявились и более высокой интенсивности
ростовых процессов, а также - в развитии более крупных, округлых листьев. Это был единственный вариант, где листья имели типичную для скумпии обратнояйцевидную форму (Рис.б). Наряду с чтим ткани характеризовались оводненностью и рыхлостью структуры, быстрее некротизировали. Все это осложняло культивирование, так как при пассировании рыхлые ткани легко распадались на отдельные нежизнеспособные куски.
Кинетин в концентрации 1 мг/ л вызывал незначительное увеличение размеров экспланта и появление зеленой окраски в первые две недели культивирования. Эксплант имел вид небольшого зеленого конуса с участками некротизирующей ткани. Затем развитие остановилось, а в процессе дальнейшего культивирования экспланты либо не развивались вовсе, либо погибали.
Как правило, длительное субкультивирование на средах аналогичного состава в большинстве изученных вариантов приводило к прекращению роста и появлению витрификации или некроза культур.
Часть первичных культур, полученных в нулевом пассаже, была перенесена па среды измененного гормонального состава. Наиболее интересными оказались варианты, в которых возрастала концентрация цитокининов. При увеличении концентрации БАЛ с 0,5 до 2;5 мг/л формировались новые зоны роста (Рис.в). Добавление к БАГ1 (0^5 мг/л) кинетика (0^5 мг/л) также приводило к появлению новых зон роста и, одновременно с этим, к увеличению размеров листовых пластинок. Таким образом, в обоих вариантах удалось достигнуть следующего, после инициации, этапа мнкроклональной технологий - собственно микроразмножения. Следует отметить, что в данных экспериментальных условиях небольшие размеры побегов ограни ч и нал и последующие манипуляции с ними, что, по-видимому, потребует изучения и применения дополнительных приемов, стимулирующих рост и разви тие микропобегов.
Культура листовых дисков
Растительный материал (листья) брали как от «взрослого» 10-летнего дерева, так и от однолетних саженцев в стадии активного роста. В процессе последующего культивирования было выявлено, что возраст растения-донора влияет на скорость протекания морфогенетических процессов. Экспланты, полученные от однолетних саженцев, продуцировали структуры на 10-14 дней раньше, чем взятые от 10-летнего дерева. Не выявлено достоверной связи между временем инициации культур и регенерацией.
Для индукции морфогенеза использовали БАП, НУК и кинетин в разных концентрациях и соотношениях. Почти во всех изученных вариантах наблюдали быструю и ярко выраженную дегенерацию эксплантов. Листовые диски теряли естественную зеленую окраску, бурели или чернели, покрывались каплями конденсата и на 7-10 день окончательно некротизировали. Только в двух вариантах: (1) БАП, 1,0 мг/л, + НУК, 0,1 мг/л, и (2) БАП, 0,5 мг/л, + кинетин, 0,5 мг/л, первоначальная темно-зеленая окраска тканей листа сохранялась неизменной. Через несколько дней культивирования на данных
средах no кромке экспланта формировался раневой каллус в виде черного юфриронанного валика. В дальнейшем в зоне каллуса наблюдали возникновение меристематических зон роста и формирование небольших (1-2 мм ). округлых структур светло-зеленого цвета, представлявших собой, по-видимому, адвентивные почки (Рис.г). Один регенерирующий экспланг продуцировал, как правило, 5-7 почек. Этот показатель не зависел от типа и соотношения фитогормонов в питательной среде, хотя, как известно, цитокинины в сочетании с ауксинами более эффективно индуцируют развитие мочек и побегов.
Структуры были отделены от тканей экспланта и перенесены на питательные среды измененного состава, но дальнейшею развития адвентивных почек в побеги ни на одной из используемых сред мы не наблюдали. Возможно, причиной неудачи были небольшие размеры структур.
Культура верхушек побегов
При культивировании in vitro верхушек однолетних побегов была выявлена различная чувствительность эксплантов к фитогормонам. Наличие в питательной среде кипстина (0,5 или 1,0 мг/ji) вызывало появление зеленой окраски и увеличение размеров почек, однако после 2-х недель культивирования рост тормозился, листовые примордии не развивались, листья не разворачивались. Одновременно с этим наблюдали первые признаки некроза верхней части побега, а вслед за этим, спустя 3-4 недели, - общий некроз и гибель.
При культивировании верхушек побегов на питательной среде с 0,5 мг/'л БАП в течение 2-3 недель формировались небольшие (до 1,5 см длиной) зеленые побеги с 3-4 листьями. БАМ r указанной концентрации не снял доминирования апикальной меристемы: преимущественное развитие продемонстрировала только верхушечная почка, боковые побеги не развивались, почки лишь незначительно вытянулись. При увеличении концентрации БАГ1 до 2,5 или 5,0 мг/л количество побегов не увеличилось, побеги удлинялись незначительно, листовые пластинки были недоразвиты и скручены в трубочку. Чем выше была концентрация БАП, тем быстрее некротизировал побег. По-видимому, для развития большего количества почек требуется не повышение, а снижение концентрации БАП в питательной среде. Косвенным подтверждением данного предположения может служить развитие эксплантов на питательной среде без регуляторов роста, когда каждая почка, включая боковые, формировала побег с 2-3 хорошо развитыми листьями.
Выводы
Морфогенный потенциал всех типов эксплантов скумпии реализуется в основном в первые 2-3 недели культивирования, затем происходит быстрая дегенерация и некроз тканей экспланта.
Установлено, что определяющим индуктором морфогенеза для разных типов эксплантов скумпии является БАП. /(ля инициации процессов роста и
ростовых процессов, а также - в развитии более крупных, округлых листьев. Это был единственный вариант, где листья имели типичную для скумпии обратнояйцевидную форму (Рис.б). Наряду с этим ткани характеризовались оводненностью и рыхлостью структуры, быстрее некротизировали. Все это осложняло культивирование, так как при пассировании рыхлые ткани легко распадались на отдельные нежизнеспособные куски.
Кинетин в концентрации I мг/ л вызывал незначительное увеличение размеров экспланта и появление зеленой окраски в первые две недели культивирования. Экснлант имел вид небольшого зеленого конуса с участками некротизируюшей ткани. Затем развитие остановилось, а в процессе дальнейшего культивирования экспланты либо не развивались вовсе, либо погибали.
Как правило, длительное субкультивирование на средах аналогичного состава в большинстве изученных вариантов приводило к прекращению роста и появлению витрификации или некроза культур.
Часть первичных культур, полученных в нулевом пассаже, была перенесена на срсды измененного гормонального состава. Наиболее интересными оказались варианты, в которых возрастала концентрация цитокининов. При увеличении концентрации БЛН с 0,5 до 2>5 мг/л формировались новые зоны роста (Рис.в). Добавление к ЬАГ! (0^5 мг/л) кинетина (0^5 мг/л) также приводило к появлению новых зон роста и, одновременно с этим, к увеличению размеров листовых пластинок. Таким образом, в обоих вариантах удалось достигнуть следующего, после инициации, этапа микроклональной технологий - собственно микроразмножения. Следует отметить, чю в данных экспериментальных условиях небольшие размеры побегов отраничивали последующие манипуляции с ними, что, по-видимому, потребует изучения и применения дополнительных приемов, стимулирующих рост и развитие микропобегов.
К'улыпура листовых дисков
Растительный материал (листья) брали как от «взрослого» 10-летнего дерева, так и от однолетних саженцев в стадии активного роста. В процессе последующего культивирования было выявлено, что возраст растения-донора влияет на скорость протекания морфогснетических процессов. Экспланты, полученные от однолетних саженцев, продуцировали структуры на 10-14 дней раньше, чем взятые от 10-летнего дерева. Не выявлено достоверной связи между временем инициации культур и регенерацией.
Для индукции морфогенеза использовали БАП, НУК и кинетин в разных концентрациях и соотношениях. Почти во всех изученных вариантах наблюдали быструю и ярко выраженную дегенерацию эксплантов. Листовые диски теряли естественную зеленую окраску, бурели или чернели, покрывались каплями конденсата и на 7-10 день окончательно некротизировали. Только в двух вариантах: (1) БАП, 1,0 мг/л, + НУК, 0,1 мг/л, и (2) БАП, 0,5 мг/л, + кинетин, 0,5 мг/л. первоначальная темно-зеленая окраска тканей листа сохранялась неизменной. Через несколько дней культивирования на данных
средах по кромке экспланта формировался раневой каллус в виде черного гофрированного валика. В дальнейшем в зоне каллуса наблюдали возникновение меристематических зон роста и формирование небольших (1-2 мм ), округлых структур светло-зеленого цвета, представлявших собой, по-видимому, адвентивные почки (Рис.г). Один регенерирующий эксплант продуцировал, как правило, 5-7 почек. Этот показатель не зависел от типа и соотношения фитогормонов в питательной среде, хотя, как известно, цитокинины в сочетании с ауксинами более эффективно индуцируют развитие почек и побегов.
Структуры были отделены от тканей экспланта и перенесены на питательные среды измененного состава, но дальнейшего развития адвентивных почек ь побега ни на одной из используемых сред мы не наблюдали. Возможно, причиной неудачи были небольшие размеры структур.
Культура верхушек побегов
При культивировании in vitro верхушек однолетних побегов была выявлена различная чувствительность эксплантов к фитогормонам. Наличие в питательной среде кинетипа (0,5 или 1,0 мг/л) вызывало появление зеленой окраски и увеличение размеров почек, однако после 2-х недель культивирования рос т тормозился, листовые примордии не развивались, листья не разворачивались. Одновременно с этим наблюдали первые признаки некроза верхней части побега, а вслед за этим, спустя 3-4 недели, - общий некроз и гибель.
При культивировании верхушек побегов на питательной среде с 0,5 мг/л БАП в течение 2-3 недель формировались небольшие (до 1,5 см длиной) зеленые побеги с 3-4 листьями. БАП я указанной концентрации не снял доминирования апикальной меристемы: преимущественное развитие продемонстрировала только верхушечная почка, боковые побеги не развивались, почки лишь незначительно вытянулись. При увеличении концентрации БАП до 2,5 или 5,0 мг/л количество побегов не увеличилось, побеги удлинялись незначительно, листовые пластинки были недоразвиты и скручены в трубочку. Чем выше была концентрация БАП, тем быстрее некротизировал побег. По-видимому, для развития большего количества почек требуется не повышение, а снижение концентрации БАП в питательной среде. Косвенным подтверждением данного предположения может служить развитие эксплантов на питательной среде без регуляторов роста, когда каждая ночка, включая боковые, формировала побеге 2-3 хорошо развитыми листьями.
Выводы
Морфогенный потенциал всех типов эксплантов скумпии реализуется в основном в первые 2-3 недели культивирования, затем происходит быстрая дегенерация и некроз тканей экспланта.
Установлено, что определяющим индуктором морфогенеза для разных типов эксплантов скумпии является БАП. Для инициации процессов роста и
развития необходимы изначально низкие концентрации БАП в питательной среде (0,5-1,0 мг/л).
Для развития новых зон роста при культивировании почек необходимо в последующих пассажах увеличение концентрации БАП до 2,5 мг/л.
В культуре изолированных листьев органогенез реализуется через каллусогенез, а в культуре почек и верхушек побегов происходит прямая реализация органогенного потенциала почек одновременно с активацией клеток пазушной меристемы.
Литература
Джонс O.TI. Размножение хозяйственно-важных древесных растений in vitro // Биотехнология сельскохозяйственных растений, Москва, 1987, С. 139-154.
Катаева Н.В. Особенности микроразмножсния трудноукорекяемых сортов яблони // Сельскохозяйст венная биология. 1986. №4. С. 18-23
Колесников А.И. Декоративная дендрология. М., 1974. 517 с.
УДК 575.224.234; 581.48
ОСОБЕННОСТИ СЕМЕННОЙ РЕПРОДУКЦИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ПОЛУЧЕННЫХ ГЕНОМНЫХ И ХРОМОСОМНЫХ МУТАНТОВ NICOTIANA TABACUM L.
О.Л. Госенова, 10.Б. Евсеева
Саратовский государственный университет им. П.Г. Чернышевского, г. Саратов
Вид Nicotiana tabacum f.. является естественным аллополиплоидом, характеризуется высокой фертильностью и размножается исключительно половым путем. В силу ряда морфобиологических, физиологических и цитологических признаков (высокая регенерационная способность, обильное длительное цветение, крупные размеры цветков и цитоэмбриологичес-ких элементов, а также высокая семенная продуктивность) табак является удобным модельным объектом и широко используется во многих исследованиях (Nicotiana..., 1979; Шумный, 2001; Еналеева, 2003). Поскольку полиплоидия и анеунлоидия являются источником генетической изменчивости и факторами эволюции, включая эволюцию систем размножения (Грант, 1984; Otto, Whitton, 2000; Soltis et al., 2003), представляет значительный интерес получение и подробное изучение на модельном объекте мутаций этого типа.
Экспериментально полученные в отделе генетики и репродуктивной биологии Ботанического сада СГУ формы табака с увеличенным набором хромосом являются уникальным материалом для исследований в этих аспектах, и основная задача данной работы заключалась в анализе их некоторых репродуктивных особенностей.
Материал н методика Объектом исследования служили растения из самоопыленного потомства тетраплоида, полученного методом культуры тканей на основе Dsy I мутанта, и
