CC BY
42
© А.М. ЗАЙДМАН И ДР., 2012
морфофункциональные
закономерности регуляции хондрогенеза пластинок роста тел позвонков и подвздошной кости
А.М. Зайдман, М.А. Садовой, Е.Л. Строкова, А.В. Корель, Т.В. Русова
Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна
Цель исследования. Сравнительный анализ закономерностей формирования и генетической регуляции хондрогенеза пластинок роста тел позвонков и подвздошной кости в норме.
Материал и методы. Объектом исследования служили пластинки роста тел позвонков и подвздошного хряща, полученные от 10 мини-поросят в периоды интенсивного роста. Использованы методы исследования: морфо-гистохимия, электронная микроскопия, иммуногисто-химия, экспрессия генов, биохимическое исследование протеогликанов и гликозаминогликанов, морфометри-ческий анализ.
Результаты. Структурно-функциональная организация клеток и матрикса, периодизация процессов пролиферации, дифференцировки и генетической регуляции (экспрессия аггрекана, люмикана, Рах1, Sox9, HAPLN1 и др.) в исследуемых образцах пластинок роста однотипны. Заключение. Процессы генетической регуляции хон-дрогенной дифференцировки хондробластов пластинок роста тел позвонков и гребня подвздошной кости синхронны.
Ключевые слова: пластинка роста, дифференцировка и пролиферация хондробластов, пластинка роста тела позвонка и подвздошного хряща.
morphofunctional laws regulating chondrogenesis in vertebral and iliac bone growth plates
A.M. Zaidman, M.A. Sadovoy, E.L. Strokova, A.V. Korel, T.V. Rusova
Objective. To perform comparative analysis of the laws of formation and genetic regulation of chondrogenesis in healthy vertebral growth plates and iliac bone growth plates. Material and Methods. Growth plates of vertebral bodies and iliac articular cartilage obtained from 10 mini-pigs in the period of intensive growth were investigated. The following studies were performed: morphohistochemistry, electron microscopy, immu-nohisochemistry, gene expression study, biochemical study of proteoglycans and GAGs, and morphometric analysis. Results. Structural and functional organization of cells and matrix, and periodization of the processes of proliferation, differentiation, and genetic regulation (expression of ag-grecan, lumican, Paxl, Sox9, HAPLN1, etc.) were similar in the examined growth plate specimens. Conclusion. The processes of genetic regulation of chondro-genic differentiation of chondroblasts in the growth plates of vertebral bodies and the iliac bone crest are synchronous. Key Words: vertebral growth plate, iliac cartilage growth plate, differentiation and proliferation of chondroblasts.
Hir. Pozvonoc. 2013;(3):68—80.
Заместительная клеточная терапия на наших глазах становится реальностью в лечении самых разнообразных заболеваний.
А.С. Соболева
В настоящее время хирургическое лечение деформаций позвоночника является единственным способом предотвращения тяжелых нарушений сердечно-сосудистой и легочной недостаточности и в значительной
степени корригировать косметический дефект [1, 4]. Методов патогенетического лечения сколиотической болезни не существует, что связано с отсутствием сведений об этиологическом факторе патологии. Общепри-
68
знанным и практически незыблемым является асимметрия роста позвоночника - патогенетический механизм формирования деформации. На основании этих данных возникает вопрос о возможности коррекции наруше-
ния роста методами, основанными на заместительной терапии патологически измененных зон роста. Подобным пластическим материалом могла бы быть пластинка роста (ПР) из гребня подвздошной кости, которая, по современным представлениям, является показателем потенции роста позвонка. Это так называемый симптом Risser, используемый ортопедами как прогностический признак прогрессирования сколиотической деформации. Эти данные являются основанием для настоящего исследования. Предпосылкой для подобной разработки является замещение хондротрансплантатом латеральной зоны ПР тела позвонка после дис-трукции ткани растущего животного раствором папаина. Было показано, что при введении хондротрансплан-тата в латеральную область ПР клетки хондротрансплантата встраиваются в метаболическую структуру ПР, дальнейшая дифференцировка трансплантированных хондробластов происходит в соответствии с закономерностями функционирования ПР в норме. Деформация позвоночника через 6 мес. после операции у животного не развивалась (по неопубликованным данным А.М. Зайдман, Ва Суз-далова, 2010).
Для реализации экспериментальной проверки возможности коррекции роста методом пластического замещения дефекта ПР тела позвонка трансплантатом, полученным из гребня подвздошной кости, представляется необходимым исследовать морфо-функциональное соответствие этих структур во временном аспекте.
Цель исследования - сравнительный анализ закономерностей формирования и генетической регуляции хондрогенеза ПР тел позвонков и подвздошной кости в норме.
Материал и методы
Объектом исследования служили ПР тел позвонков и подвздошного хряща, полученные от 10 мини-поросят в раннем онтогенезе (новорожденный, двухнедельный и месячный). Выбор
сроков наблюдения определен темпами роста животных. Ткани фиксировали в 10 % растворе формалина, костную ткань подвергали декальцинации в холодном трилоне «Б». На парафиновых срезах препараты окрашивали гистологическими методами (гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону и Маллори), гистохимическими (толу-идиновым синим при разных значениях рН, альциановой синью, Хейл-реакцией, Шик-реакцией - окраска реактивом Шиффа, реакцией Грина). Ко всем реакциям ставили соответствующие контроли. Ультраструктурные исследования проводили после фиксации в глютаральдегиде и дофик-сации в осмии. Препараты после проводки по спиртам заливали в аральдит. Готовили полутонкие и тонкие срезы на ультратоме «LKB», просматривали и фотографировали на электронном микроскопе «Hitachi-100».
Измерение диаметров и площадей клеток исследуемых препаратов, вычисление ядерно-цитоплазмати-ческих отношений, размер площадей, занимаемых слоями Пр, и статистическую обработку полученных результатов проводили методом мор-фометрического анализа при помощи программ «Axio Vision Le Rel. 4.3.» и «Morpho Images». Данные представлены в виде таблиц и графиков.
Биохимическими методами исследовали качественное и количественное содержание гликозаминоглика-нов (ГАГ) в тканях ПР тел позвонков и подвздошного хряща. Для выделения ГАГ ткань хряща обрабатывали раствором папаина по общепринятой методике [2]. В растворе аналитическими методами определяли содержание химических компонентов ГАГ - суль-фатированных ГАГ (СГАГ), гексуроно-вых кислот и гексоз. Содержание этих компонентов рассчитывали в микрограммах на миллиграмм сухого веса ткани. Качественный состав определяли методом электрофореза в 1 % геле агарозы в буфере 50 тМ ацетата бария рН 8,0. Для идентификации ГАГ использовали специфические глико-заминогликангидролазы - хондроити-
назы АС и АВС. Полученные результаты представлены в виде таблиц.
Для исследования экспрессии генов хрящевую ткань ПР тел позвонков и ПР подвздошной кости новорожденного, двухнедельного и месячного поросенка отмывали, измельчали и помещали в раствор коллагеназы на 22-24 ч при температуре 37 °С. Полученную суспензию клеток центрифугировали в течение 10 мин при 2000 об./мин. Из осажденных клеток выделяли РНК тризольным методом (TRI reagent). Выделенную РНК обрабатывали RNAse-free DNAse; кДНК получали в реакции обратной транскрипции с использованием фермента M-MLV Reverse Transcriptase в присутствии Oligo ^Т)15-праймера. Все процедуры проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Реакции без фермента использовали в качестве отрицательного контроля. Амплификацию фрагментов исследуемых генов проводили методом ПЦР на амплификаторе «TRIO-Thermoblock». В качестве контрольного гена использовался ген актин. ПЦР была выполнена с использованием Taq-полимеразы и ген-специфичных праймеров (табл. 1) при следующих условиях: 3 мин при 95 °C и 30 циклов (30 с при 95 °C, 30 с при 58-60 °C и 30 с при 72 °C). Анализ продуктов ПЦР проводили методом горизонтального гель-электрофореза в 1,5 % ага-розном геле.
Результаты
На ранних стадиях постнатально-го развития ПР тел позвонков и подвздошного гребня подвздошной кости новорожденных особей состоят из хондробластов и матрикса, формирующих четыре зоны в зависимости от степени дифференцировки (рис. 1).
Широкий слой камбиальных клеток в обеих исследуемых структурах свидетельствует о высокой потенции процессов роста. Хондробласты этой зоны мелкие, вытянутые, с круглым или овальным ядром и одним ядрышком. Цитоплазма окаймляет ядро и ограничена мембраной с коротки-
69
Таблица 1 Праймеры к исследуемым генам
Ген Праймер Последовательность праймера Концентрация МдС12, тМ Температура отжига, град. Размер целевого фрагмента, Ьр
Актин Актин f 5'-GCCGAGATCTCACCGACTAC-3' 3 59 360
Актин г 5'-CCCCAGAGAGGACGTTGTTA-3
Аггрекан Асап f 5'-GAAGCAGCAGTCACACCTGA-3' 3 59 505
Асап г 5'-GCTCCGCTTCTGTAGTCTGC-3'
Люмикан Lum f 5'-AGATCTCAAGGGTCCCCAAC-3' 3 59 357
Lum г 5'-GCAGCTGGTTGTAGGAGAGG-3'
Рах1 Рах1f м 5'-ACGTGGTCAAGCACATCCGGGACT-3' 4 58 508
Рах1г м 5'-AAGGCGGGTTTCTCGAGCCCATT-3'
SOX9 SOX9 ! 5'-ACGCGGAGCTCAGCAAGACTCTG-3' 4 60 370
SOX9 г 5'-TCTCGCTTCAGGTCAGCCTTGCC-3'
COL1A1 COL1A1 ! 5'-TGCTCCTCTTAGCGGCCACCG-3' 4 58 280
COL1A1 г 5'-ACCTCGCCTTCGGGGCAGAC-3'
COL2A1 COL2A1 ! 5'-CCCCGGAACTCCTGGCACGG-3' 4 58 365
COL2A1 г 5'-CGTCAGCACCGGGAGGACCA-3'
COL10A1 COL10A1 ! 5'-AAGCGGTCCCACCCGAAGGC-3' 4 58 415
COL10A1 г 5'-AGCCCGTTCGACCCAGCGTT-3'
НИ НИ ! 5'-TGGGGCAAAGGATGACGACTCCG-3' 4 58 384
НИ г 5'-TGGCCCGGGGAAAGGACCAC-3'
HAPLN HAPLN1 ! 5'-GGCTGGACTGGTGCAACGCT-3' 4 58 376
HAPLN1 г 5'-CTGCAGCGCCTTCTTGGCCT-3'
ММР9 ММР9 ! 5'-GACGGCCGCTCAGACGGCTA-3' 4 58 343
ММР9 г 5'-TGAGCGCCTCTGGCACGGTT-3'
TGFB1 TGFB1 ! 5'-TTCACGGCATGAACCGGCCC-3' 4 58 385
TGFB1г 5'-TGCTCCACCTTGGGCTTGCG-3'
1НН 1НН ! 5'-ACGTGCATTGCTCCGTCAAGTCCG-3' 3 59 314
1НН г 5'-GCGGGCAGCTGGTTCTGTGTGATT-3'
Рах9 Рах9 ! 5'-ATCAGCCGCATCCTGCGCAACAA-3' 4 58 596
Рах9 г 5'-AGCGACGCGGGAATGTCACAGTTG-3'
• -. •
а
.. - :-Г^Я
/Г .■
■ ^ - V
Р. ЯЖ * 1
Рис. 1
Пластинка роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) новорожденного поросенка; окраска гематоксилин-эозином, ув. 200
ми отростками. В цитоплазме выявляются низкополимерные ГАГ, хондроитинсульфат С, гиалуроновая кислота и гликоген. Ультраструктурная организация цитоплазмы клеток однотипна, характерна для малодифференцированных клеток. Ядро занимает практически все пространство клетки. Хроматин деконденсиро-ван, располагается на ядерной мембране, нуклеоплазма светлая; 1-2 ядрышка расположены эксцентрично. В цитоплазме многочисленные рибосомы и полисомы расположены как свободно, так и на мембранах эндоплазматического ретикулума, который представлен узкими цистернами, заполненными электронно-плотным веществом. Комплекс Гольджи расположен приядерно, представлен узкими цистернами и мелкими гладкими и окаймленными везикулами (рис. 2). Часть окаймленных визикул располагается вблизи плазмалеммы; мелкие везикулы примыкают к гладкому эндоплазматическому ретикулуму. Митохондрии мелкие, с хорошо контурирующимися кристами. В цитоплазме выявляются гранулы гликогена. Вокруг хондробластов выявляются цепочки про-теогликана (ПГ) и тонкие коллагеновые волокна.
б
70
Зона пролиферирующих клеток по классическому представлению может быть разделена на два слоя: округлые клетки и пролифераты, состоящие из 3-4 клеток, и колонковые структуры со строго упорядоченным расположением клеток в виде колонок, ограниченных узким матриксом. Необходимо отметить, что при одинаковой архитектонике этой зоны ПР тел позвонков и подвздошного хряща имеют выраженные отличия (рис. 3). В ПР подвздошной кости определяются более широкая зона колонковых структур и более плотное их расположение. Площадь, занимаемая колонковым слоем ПР подвздошного хряща, достоверно больше (244661,86 ± 18943,35 мкм2), чем таковая для ПР тела позвонка (52907,04 ± 1379,73 мкм2; табл. 2-5). В клетках и матриксе этих зон определяются высокополимерные ПГ (рис. 4), в цитоплазме диффузно расположены гранулы гликогена в виде редких гранул. Иммуногистохимическими методами выявляются аггрекан, ПГ, коллаген, преимущественно II типа (рис. 5).
Ультраструктура клеток обнаруживает высокую степень дифферен-цировки. Форма клеток преимущественно овальная, ядро располагается ацентрально и содержит 1-2 ядрышка. Структурная организация цитоплазмы значительно усложняется за счет комплекса органелл и их расположения в цитоплазме. Прежде всего, это развитая эндоплазматическая сеть с прикрепленными рибосомами и канальцы гладкого эндоплазмати-ческого ретикулума с расширенными цистернами, заполненными электронно-плотным содержимым. Комплекс Гольджи локализуется диффузно в цитоплазме и характеризуется визику-лярно-ламинарным типом строения, с большим количеством визикул, особенно на трансповерхности. Визику-лы, преимущественно окаймленные, с мелкогранулярным электронно-плотным содержимым, локализованы как в области плазматической мембраны, так и в мембранах эндоплазмати-ческой сети. Количество митохондрий в клетках пролиферирующего слоя
Рис. 2
Ультраструктура малодифференцированных хондробластов пластинки роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) новорожденного поросенка; ув. 5000
Рис. 3
Структурная организация зоны пролиферирующих хондроцитов пластинки роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) новорожденного поросенка; окраска гематоксилин-эозином, ув. 200
Таблица 2
Размер колонкового и гипертрофического слоев пластинки роста тела позвонка мини-поросенка
в возрастном аспекте, 2 мкм2
Возраст Колонковый слой Гипертрофический слой
Новорожденный 52907,04 ± 1379,73 61632,22 ± 3384,04
Две недели 93384,54 ± 2275,93 57851,98 ± 1480,66
1 мес. 82768,52 ± 3671,55 64361,51 ± 2605,18
Таблица 3
Размер колонкового и гипертрофического слоев пластинки роста подвздошного хряща мини-по-
2 росенка в возрастном аспекте, мкм2
Возраст Колонковый слой Гипертрофический слой
Новорожденный 244661,86 ± 18943,35 110980,21 ± 3964,42
Две недели 280150,47 ± 15055,35 135583,96 ± 14074,65
1 мес. 257424,90 ± 15900,28 179110,15 ± 13039,29
71
Таблица 4
Сравнение размеров гипертрофического слоя пластинки роста подвздошного хряща и тела позвонка мини-поросенка в возрастном аспекте
Возраст Подвздошный хрящ Пластинка роста тела позвонка
Новорожденный 110980,21 61632,22
Две недели 135583,96 57851,98
1 мес. 179110,15 64361,51
Таблица 5
Сравнение размеров колонкового слоя пластинки роста подвздошного хряща и тела позвонка мини-поросенка в возрастном аспекте
Возраст Подвздошный хрящ Пластинка роста тела позвонка
Новорожденный 244661,86 52907,04
Две недели 280150,47 93384,54
1 мес. 257424,90 82768,52
Рис. 4
Протеогликаны в хондробластах и матриксе пластинки роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) новорожденного поросенка; окраска альциановым синим, ув. 400
значительно увеличено. Определяются крупные митохондрии с хорошо выраженными кристами и мелкие с плотным матриксом (рис. 6). В цитоплазме определяются лизосомы и аутофаго-сомы, что свидетельствует об интенсификации обменных процессов в системе «клетка - матрикс». Ядер-но-цитоплазматические (я/ц) отношения (я/ц хондроцитов колонкового слоя ПР тела позвонка - 0,34 ± 0,14; я/ц хондроцитов колонкового слоя ПР подвздошного хряща - 0,35 ± 0,08; табл. 6-9).
В этот период отличие структурной организации ПР коррелирует с данными гистохимических исследований. В ПР подвздошной кости синтез высокополимерных ПГ в клетках и матриксе колонкового слоя значительно выше (рис. 4), что, несомненно, связано с количеством клеток, продуцирующих ПГ. Выявлены различия в экспрессии генов. В этот период в ПР тела позвонка интенсивно экспрес-сируется IHH - ген пролиферации и MMP9 - ген-регулятор остеогенеза (рис. 7). Эти данные свидетельствуют об интенсивном процессе пролиферации клеток, включающих синтезы и формирование органелл de novo, как этап остеогенной дифференци-ровки. В ПР подвздошной кости экспрессия генов, регуляторов остеоге-неза, снижена, что согласуется с морфологическими данными.
Гипертрофический слой ПР тела позвонка (табл. 2) фенотипически разнороден. Расположенные на границе с пролиферирующими клетками дифференцированные хондробласты сохраняют способность к репродуции,
|| 90 £ л - ' • а 6 :
Рис. 5
Иммуногистохимическая реакция с антителами к аггрекану (красный цвет) и к коллагену I типа (зеленый цвет) в пластинках роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) новорожденного поросенка; окраска альциано-вым синим, ув. 200
72
ц1;..^-.^-.1 ■ .г, . - У ЯГО."
рй
; б
^ у*
Рис. 6
Ультраструктура высокодиффе-ренцированных хондроцитов пластинки роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) новорожденного поросенка; ув. 5000
Таблица 6
Ядерно-цитоплазматические отношения хондроцитов колонкового и гипертрофического слоев пластинки роста тела позвонка мини-поросенка в возрастном аспекте
Таблица 7
Ядерно-цитоплазматические отношения хондроцитов колонкового и гипертрофического слоев пластинки роста подвздошного хряща мини-поросенка в возрастном аспекте
Таблица 8
Сравнение ядерно-цитоплазматических отношений хондроцитов колонкового и слоя пластинки роста тела позвонка и подвздошного хряща мини-поросенка в возрастном аспекте
Таблица 9
Сравнение ядерно-цитоплазматических отношений хондроцитов гипертрофического и слоя пластинки роста тела позвонка и подвздошного хряща мини-поросенка в возрастном аспекте
в них встречаются фигуры митозов, активный синтез высокополимерных ПГ. Вокруг клеток выявляются интенсивные реакции на высокополимерные ГАГ.
Клетки, прилежащие к зоне остео-генеза, находятся на конечной стадии дифференцировки. В этих участках матрикс и цитоплазма хондроцитов обнаруживают отрицательную реакцию на сульфатированные ПГ. Цитоплазма в некоторых клетках ваку-олизирована, ядро пикнотически изменено, встречаются безъядерные клетки и клетки в апоптозе. Происходят внедрение сосудов, лизис матрикса и формирование примитивной костной ткани. Ультраструктурно определяются так называемые черные хон-дроциты. Противоположная картина наблюдается в ПР подвздошной кости.
Широкий гипертрофический слой клеток ПР подвздошного хряща (площадь 110980,21 ± 3964,42 мкм2; табл. 3) с интенсивной метохрома-зией матрикса и цитоплазмы. Фенотип клеток однороден: это крупные округлые клетки с центральным ядром и объемной цитоплазмой (я/ц отношения для хондроцитов гипертрофического слоя ПР тела позвонка -0,23 ± 0,06; я/ц отношения для хон-дроцитов гипертрофического слоя ПР подвздошного хряща - 0,17 ± 0,06; табл. 6-9). В цитоплазме выявляются высокополимерные хондроитин-сульфаты АС и диффузные гранулы гликогена. В некоторых местах костные балки перекрывают пограничную зону. Ультраструктурно предгипертро-фические хондроциты - это актив-
73
ные, по морфологическим данным, клетки с крупным ядром, 1-2 ядрышками и диспергированным хроматином. На цитоплазматической мембране несколько коротких отростков, инвагинаты отсутствуют. В некоторых клетках наблюдается экзоцитоз в виде примембранных отшнурован-ных визикул. В цитоплазме - широкая эндоплазматическая сеть с рибосомами и полисомами. Цистерны эндоплазматического ретикулума расширены, заполнены гранулярным, электронно-плотным материалом. Комплекс Гольджи расположен равномерно, как приядерно, так и в центральных отделах клетки. Цистерны его с просветленным матриксом; на трансполюсе большое количество визикул, рассредоточенных в цитоплазме. Многочисленные делящиеся митохондрии с просветленным матриксом и хорошо выраженными кристами равномерно распределены в цитоплазме. Лизосомы в виде единичных вакуолей располагаются примембранно.
В этот период в обеих ПР синтезируются аггрекан и коллагены I и II типов (рис. 5).
В двухнедельном возрасте ПР тела позвонка и подвздошной кости сохраняют прежнюю архитектонику и деление на четыре зоны (рис. 8).
Как в предыдущем сроке, герминативный слой клеток все еще достаточно выражен, что свидетельствует о высокой потенции роста. В обеих ПР эти зоны одинакового размера, потенциальные возможности роста однотипны.
Малодифференцированные хон-дробласты этой зоны с узким ободком цитоплазмы и крупным ядром, в которой определяется экспрессия коллагена I типа. В матриксе определяются гиалуроновая кислота и хондрои-тинсульфаты АС. Ультраструктурная организация этих клеток соответствует первой постнатальной стадии развития (рис. 9).
Для зоны пролиферирующих клеток характерны усложнение синтезов, формирование гомогенного матрик-са, содержащего высокополимерный
Рис. 7
Сравнительный анализ экспрессии генов в пластинках роста (ПР) тела позвонка и подвздошной кости в разные периоды онтогенеза:
1 - ПР тела позвонка новорожденного поросенка;
2 - ПР подвздошной кости новорожденного поросенка;
3 - ПР тела позвонка двухнедельного поросенка;
4 - ПР подвздошной кости двухнедельного поросенка;
5 - ПР тела позвонка месячного поросенка;
6 - ПР подвздошной кости месячного поросенка; RT- - отрицательный контроль
'Л
I -
и "и„ Д. А - . »
да-я
V.
■ - . и _,_и_и
> > *д.'^-="5.-' л .
б
Рис. 8
Пластинка роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) двухнедельного поросенка; окраска гематоксилин-эозином, ув. 100
74
Рис. 9
Ультраструктурная организация малодифференцированных хондробластов пластинки роста тела позвонка (а) и подвздошного хряща (б) двухнедельного поросенка; ув. 5000
Рис. 10
Ультраструктурная организация высокодифференцированных хондробластов пластинки роста тела позвонка (а) и подвздошного хряща (б) двухнедельного поросенка; ув. 5000
* i
1
а
V м •
' . рч' ■
■ .V
. - .V . "V* ■:'- -
Л «Ч
:■ - ч -'Ъ'^ у-» г-. -. ■
. -К-. " /
4 Л ' 'г >
б
Рис. 11
Окраска альциановым синим пластинки роста тела позвонка, ув. 200 (а) и подвздошного хряща, ув. 100 (б) двухнедельного поросенка
аггрекан, связанный с коллагеном II типа. Накопление матрикса способствует рассредоточению клеток и формированию хондрометаболического
барьера. Экспрессия генов, синтез линк-белка и гиалуроновой кислоты указывают на фазу формирования высокополимерных ПГ, характерных
для более высокой степени структурной организации хрящевой ткани. В пользу продолжающегося процесса дифференцировки изогенных групп хондроцитов свидетельствует и экспрессия генов Рах1 и Рах9 (рис. 7).
Ультраструктурная организация клеток в этой зоне обнаруживает некоторое разнообразие. В верхнем слое клеток по-прежнему превалируют цитоплазматические органеллы, свидетельствующие об аутосинтетических процессах: примембранное расположение комплекса Гольджи с мелкими везикулами и более развитой цис-поверхностью. Эндоплазматическая сеть - широкая, но все еще в цитоплазме наблюдаются свободные рибосомы. Митохондрии с выраженными кристами и электронно-плотным содержимым рассредоточены по цитоплазме. Лизосомный аппарат единичен. В ядре 1-2 ядрышка и преимущественно примембранно расположенный хроматин (рис. 9). Подобная структурная организация характерна для малодифференцированных хон-дробластов. Наряду с этим, определяются хондробласты с более высокой ультраструктурной организацией. Ядерно-цитоплазматические отношения смещаются в сторону увеличения объема цитоплазмы (я/ц хондроци-тов ПР тела позвонка - 0,36 ± 0,10; я/ц хондроцитов ПР тела позвонка -0,38 ± 0,13; табл. 6-8). Вокруг таких клеток наблюдается накопление диф-фузно-расположенных ПГ, что свидетельствует о формировании лакун. Эухроматин в ядре расположен преимущественно равномерно. В центре ядра расположено два ядрышка. Увеличивается количество мембран и вакуолей комплекса Гольджи: часть из них прилежит к мембранам эндоплазма-тического ретикулума, некоторые - к клеточной мембране. Эндоплаз-матический ретикулум с широкими цистернами занимает значительную площадь цитоплазмы. Слой пролифе-рирующих клеток формирует проли-фераты от 4-6 клеток, расположенных в лакунах, с отчетливо контурирован-ным окололакунным пространством и выраженным хондрометаболиче-
75
ским барьером. В этот период наблюдается усложнение ультраструктурной организации клеток и матрикса. Ядро располагается ацентрально, содержит 1-3 ядрышка. Ядерная мембрана с инвагинатами; эухроматин рассредоточен по всей нуклеоплазме. В цитоплазме выявляются фагосомы; гладкая эндоплазматическая сеть широкая, цистерны расширены с электронно-плотным содержимым; большое количество вакуолей разного размера, контактирующих с плазматической мембраной. Комплекс Гольджи с большим количеством вакуолей, диффузно расположенными в цитоплазме (рис. 10).
Эти зоны по площади и морфологическому строению однотипны как для ПР тела позвонка, так и для ПР подвздошной кости.
Колонковые хондробла-сты занимают самую большую площадь ПР тел позвонков (93384,54 ± 2275,93 мкм2), но в ПР подвздошной кости этот слой значительно шире (280150,47 ± 15055,35 мкм2; табл. 2-4). Надо полагать, что процесс дифференцировки в пред- и гипертрофические хондроциты происходит более отсрочено, хотя сам процесс внутри ПР синхронизован, площади слоев ПР подвздошного хряща соотносятся с таковыми ПР тел позвонков. Хондроциты колонкового слоя по структуре не отличаются от хон-дроцитов ранних стадий постнаталь-ного развития, но наблюдается интенсификация синтетических процессов. Синтез высокополимерных ПГ, гликогена (рис. 11), формирование хондронной структуры на фоне экспрессии генов пролиферации Sox9, аггрекана, линк-белка (рис. 7) свидетельствуют о высокой степени диф-ференцировки и переходе от стадии «хондробласт» к стадии «хондроцит».
Гипертрофический слой клеток ПР подвздошного хряща в этот период значительно шире (135583,96 ± 14074,65 мкм2), чем в ПР тела позвонка (57851,98 ± 1480,66 мкм2; табл. 2-4). Интенсивность синтезов и молекулярные составляющие - хон-дроитинсульфаты АС, гиалуроновая кислота, гликоген (в препаратах обе-
их структур однотипный коллаген X, VI типов). Ядерно-цитоплазмати-ческие отношения гипертрофических хондроцитов ПР тела позвонка 0,21 ± 0,07 и гипертрофических хон-дроцитов ПР подвздошного хряща 0,18 ± 0,05 указывают на сохранение уровней дифференцировки клеток, которые регистрировались у новорожденных поросят (табл. 6-9).
Определяется интенсивная Хейл-реакция мембран хондроцитов и в окружающем матриксе, что свидетельствует о формировании высокополимерных ПГ. Клетки предги-пертрофического слоя - это стадия высокой степени дифференцировки и подготовки к процессу оссификации и апоптозу.
Клетки, прилежащие к зоне остео-генеза, - это крупные клетки с пикно-тичным ядром и вакуоляризирован-ной цитоплазмой, некоторые клетки находятся в состоянии апоптоза. Сосуды пенетрируют матрикс, вокруг них формируется примитивная костная ткань. Некоторые хондроциты окружаются костной тканью и, по морфологическим данным, сохраняют
свою структуру, другие - подвергаются апоптозу. Значительный интерес представляет тот факт, что часть клеток, окруженных костной тканью, сохраняет синтетические потенции, но происходит конверсия синтеза структурных компонентов, характерных для остеогенной дифференци-ровки. Синтез щелочной фосфотазы, коллагена I типа и ультраструктурная организация подтверждают возможность дифферецировки «хондроцит - остеобласт». Ультраструктурная организация высокодифференциро-ванных хондроцитов весьма разнообразна: типичные апоптозные тельца, безъядерные клетки, хондроциты, сохраняющие свою структуру и находящиеся на разной стадии дистрофии. В этих клетках нарушена целостность мембран эндоплазматической сети и заполнена электронно-плотным содержимым. Выявляются аутофаго-сомы, лизосомы и огромные жировые включения. Комплекс Гольджи и митохондрии не выявляются. Встречаются темные хондроциты.
В этот период экспрессируются коллагены I и II типа, аггрекан, Рах1,
Рис. 12
Пластинка роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) месячного поросенка; окраска гематоксилин-эозином, ув. 100
_76_
экспериментальные исследования
в ^ - '
,_^_^
* А * н* * * . «
' * * «*
' .Г # . . ч - ка:
Ж а ^^ ш ■ **
-
б
Рис. 13
Протеогликаны в пластинке роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) месячного поросенка; окраска альциановым синим, ув. 200
а
Рис. 14
Ультраструктура хондробласта пластинки роста тела позвонка (а) и подвздошной кости (б) месячного поросенка; ув. 5000
Рах9 и Sox9 (рис. 7). Интенсивные синтезы ПГ, ультраструктурная организация клеток ПР и ядерно-цитоплазма-тические отношения свидетельствуют об интенсивно происходящих процессах, характеризующихся пролиферацией, дифференцировкой и адекватным остеогенезом в области ПР тел позвонков и подвздошной кости.
У поросят месячного возраста соотношение слоев в ПР несколько меняется за счет расширения зоны остео-генеза, которая является превалирующей в обеих зонах роста, но в ПР подвздошной кости несколько шире (рис. 12). Значительно сужен слой камбиальных клеток в обеих ПР за счет увеличения зоны пролиферации. Колонковый слой ПР подвздошного хряща (257424,90 ± 15900,28 мкм2) имеет большую площадь, по сравнению с колонковым слоем ПР тела позвонка (82768,52 ± 3671,55 мкм2; табл. 2-4). Степень дифференцировки клеток колонкового слоя в обеих ПР одинакова (я/ц отношения колонковых хондроцитов ПР тела позвонка -0,36 ± 0,10; я/ц отношения колонковых хондроцитов ПР подвздошного хряща - 0,35 ± 0,13; табл. 6-8). Площадь, занимаемая гипертрофическим слоем ПР подвздошного хряща, значительно больше (179110,15 ± 13039,29 мкм2) площади, занимаемой гипертрофическим слоем ПР тела позвонка (64361,51 ± 2605,18 мкм2; табл. 2-5). По отношению к двухнедельному сроку я/ц отношения для гипертрофических хондроцитов обеих ПР несколько снизились (я/ц отношения гипертрофических хондроцитов ПР тела позвонка - 0,14 ± 0,05; я/ц отношения гипертрофических хондроцитов ПР подвздошного хряща - 0,10 ± 0,03; табл. 6-9). В цитоплазме и матриксе хондроцитов обеих ПР выявляются высокополимерные хондроитинсуль-фаты АС, кератансульфат (рис. 13).
К концу 1-го месяца в ПР тел позвонков и подвздошной кости мини-поросят сформирована хон-дронная структура с соответствующими морфологической и ультраструктурной характеристиками (рис. 14). Иммуногистохимически в обеих ПР
выявляются аггрекан и коллаген I типа (рис. 15). В обеих ПР на фоне экспрессии генов Sox9, аггрекана, люмикана, коллагенов I, II и IX типов экспресси-
руются ген гормона роста и трансформирующий фактор роста, что свидетельствует о включении гормональной регуляции процесса роста.
77
Биохимические данные. В обеих ПР новорожденных мини-поросят соотношение ПГ/ГАГ (табл. 10, 11) свидетельствует о низком полимерном состоянии ГАГ, представленных преимущественно хондроитинсуль-фатами АС. Высокая степень сульфа-тирования (соотношение сгаг/ук) указывает на присутствие дерматан-сульфата (ХС-В) в обеих ПР поросят при рождении (рис. 16, 17). В возрасте двух недель количество СГАГ в ПР тела позвонка повышается в 1,3 раза.
Таблица 10
Содержание химических компонентов гликозаминогликанов (ГАГ) в хряще пластинки роста тел позвонков мини -поросят, мкг чистого вещества
на мг сухой ткани
Возраст Сульфатированные ГАГ Уроновые кислоты Галактоза Н2О, »/о
Новорожденный 2,960 ± 0,230 0,600 ± 0,043 Следы 78,20 ± 3,82
Две недели 4,020 ± 0,590 0,810 ± 0,070 0,260 ± 0,023 65,30 ± 3,21
1 мес. 3,300 ± 0,210 2,323 ± 0,180 0,910 ± 0,030 67,70 ± 5,45
Таблица 11
Содержание химических компонентов гликозаминогликанов (ГАГ) в хряще пластинки роста подвздошного хряща мини-поросят, мкг чистого ве-
щества на мг сухой ткани
Возраст Сульфатированные ГАГ Уроновые кислоты Галактоза Н2О, /
Новорожденный 0,550 ± 0,004 0,110 ± 0,001 Следы 75,00 ± 1,28
Две недели 0,960 ± 0,008 0,200 ± 0,003 Следы 68,00 ± 5,43
1 мес. 1,200 ± 0,008 0,420 ± 0,036 0,330 ± 0,028 63,00 ± 6,05
Рис. 16
Электрофорез гликозаминогликанов (ГАГ) пластинки роста тела позвонка мини-поросенка в возрастном аспекте в геле агарозы в 0,1 М буфере ацетата бария рН 8,0: 1 - стандарт хондроитинсульфаты САВС + гепаран-сульфат; 2 - нативные ГАГ новорожденного поросенка; 3 - нативные ГАГ двухнедельного поросенка; 4 - нативные ГАГ месячного поросенка; 5 - ГАГ месячного поросенка после обработки хондроитиназой АС
Рис. 17
Электрофорез гликозаминогликанов (ГАГ) пластинки роста тела позвонка и подвздошного хряща месячного мини-поросенка в геле агарозы в буфере 0,1 М ацетата бария рН 8,0: 1 - стандартная смесь ГАГ; 3, 5 - исходные ГАГ из пластинки роста тела позвонка; 4 - исходные ГАГ из пластинки роста подвздошного хряща; 2, 6 - ГАГ и после обработки хондроитиназой АС из пластинки роста тела позвонка и подвздошного хряща
78
I Л Ж
Рис. 15
Иммуногистохимическая реакция с антителами к аггрекану (красный цвет) и к коллагену I типа (зеленый цвет) в пластинках роста тела позвонка и подвздошной кости месячного поросенка; ув. 200
i Рис. 18 Электрофорез гиалуроновой кислоты пластинки роста тела позвонка после выделения ее из смеси гликозаминогликанов (ГАГ) методом ионно-обменной хроматографии: 1 - стандарт смеси ГАГ; 2 - гиалуроновая кислота
В обоих хрящах накапливается гиа-луроновая кислота (рис. 18), появляются высокоагрегированные ПГ, что соответствует ультраструктурным данным: формирование хондронной структуры, связанной с хондромета-болическим барьером. Исследование ГАГ методом электрофореза показало присутствие в ПР тела позвонка новорожденных поросят хондроитинсуль-фатов АВС, а в двухнедельном возрасте обнаруживается кератансульфат. В течение 1-го месяца жизни ПГ ПР тела позвонка структурно перестраиваются: выявляются как агрегированные, так и неагрегированные формы ПГ, которые являются структурными компонентами хондрона.
Обсуждение
Современное представление о сколио-тической болезни может быть сформировано следующим образом:
- этиология - мутация в майор-гене, в отсутствии которой сколио-тическая деформация не развивается;
- патогенез - нарушение генетической программы дифференциров-ки хондробластов, морфологическим выражением которого является изменение структурной организации клеток и матрикса в латеральных зонах ПР тел позвонков, как следствие, развивается асимметрия роста;
- механогенез - на основе генетически обусловленной асимметрии роста формируется деформация позвоночника в соответствии с законом Гютера - Фолькманна.
В соответствии с возможностями хирургические вмешательства осуществляют только на III-IV заключительных стадиях развития сколиоза.
Возникает следующий вопрос: «При отсутствии сведений об этиологии болезни возможно ли профилакти-ровать развитие грубых деформаций позвоночника?» Наиболее прогрессивным является метод «Вептор» [5], предложенный и внедренный довольно широко в хирургическую практику. Этот метод дает возможность минимизировать нарастания сердечно-легочных изменений в раннем возрасте. Но прогрессирования деформации позвоночника со всеми сопутствующими общеклиническими последствиями, по всей вероятности, избежать невозможно, так как патологический субстрат остается неустраненным. Пренатальная диагностика и вмешательство на генетическом уровне -это в будущем. Каковы возможности в настоящее время? Если невозможно нейтрализовать мутацию в майор-гене, то одним из путей коррекции деформаций позвоночника может быть замещение патологически измененных клеток и матрикса латеральных отделов ПР тела позвонка трансплантатом, способным дифференцироваться в органоспецифическую структуру, и компенсировать нарушенную функцию роста. Предпринятое авторами исследование генетической регуляции хондрогенной дифференцировки и структурных особенностей гистогенезов хрящевой ткани разной локализации явилось основанием для выбора соответствующего пластического материала. Подобным пластическим материалом может быть аутотран-сплантат, который по структурно-функциональным и генетическим данным подобен ПР тела позвонка. Изъятие материала для аутотранспла-тата не должно нарушать рост донор-
ской костной ткани. Подобным трансплантатом для замещения может быть участок ПР, полученный из гребня подвздошной кости, по размеру соответствующий создаваемому дефекту. Основанием для последующих экспериментальных исследований возможности коррекции роста путем пластического замещения части ПР тел позвонков трансплантатом из гребня подвздошной кости являются настоящие исследования, посвященные сравнительным морфологическим, биохимическим и генетическим данным ПР тел позвонков и гребня подвздошной кости. В качестве экспериментальных животных были избраны мини-свиньи, полученные из вивария ИЦиГ. Эти животные генетически наиболее близки к человеку [3].
Как показали результаты исследования, структурно-функциональная организация клеток и матрикса, периодизация процессов пролиферации, дифференцировки и генетической регуляции (экспрессия аггрекана, люмикана, Рах1, Sox9, HAPLN1 и др.) в исследуемых образцах ПР однотипны. Некоторое отличие заключается в отсроченном остеогенезе в ПР подвздошной кости. Для пластинчатого замещения неполноценных зон роста этот факт может быть позитивным: наличие широкого слоя предгипер-трофических хондроцитов, синтезирующих щелочную фосфатазу, коллаген I типа, факторы роста сосудов. Активный синтез структурных компонентов, индуцирующих остеогенез, в период адаптации трансплантата позволяет синхронизовать остеогенез на всем протяжении тела позвонка. В дальнейшем предполагается экспериментальное исследование, которое позволит оценить возможность коррекции процесса роста путем трансплантации ПР из гребня подвздошной кости.
Заключение
Процессы генетической регуляции хондрогенной дифференцировки хон-дробластов ПР тел позвонков и гребня подвздошной кости синхронны.
79
Последовательность синтезов в исследуемых образцах: гиалуро-новая кислота, хондроитинсульфа-ты АС, кератансульфат и экспрессия генов, а также ультраструктурная организация на стадиях хондрогенеза - однотипны.
На фоне последовательности хон-дрогенной дифференцировки в исследуемых ПР выявлен отсроченный во времени остеогенез в ПР подвздошной кости. Симптом Risser не является абсолютным показателем потенций
роста и прогрессирования деформаций позвоночника.
Полученные данные являются основанием для экспериментальной апробации способа заместительной терапии для коррекции процесса роста.
Литература
1. Васюра А.С., Новиков В.В., Михайловский М.В. References
и др. Хирургическое лечение сколиоза с при-
менением метода транспедикулярной фиксации 1. Vasyura AS, Novikov VV, Mikhailovsky MV, et al. [Sur-
// Хирургия позвоночника. 2011. № 2. С. 27-34. gical treatment of scoliosis using transpedicular fixa-
2. Русова Т.В., Рыкова В.И., Корель А.В. и др. tion]. Hir Pozvonoc. 2011;(2):27-34. In Russian.
Гликозаминогликаны пластинки роста тела 2. Rusova TV, Rykova VI, Korel AV, et al. [Glycosami-
позвонков у больных идиопатическим сколио- noglycans of the vertebral body growth plate in
зом // Бюллетень экспериментальной биологии patients with idiopathic scoliosis]. Bulletin of Experi-
и медицины. 2005. Т. 139, № 6. С. 738-740. mental Biology and Medicine. 2005;139(6):738-740.
3. Тихонов В.Н. Лабораторные мини-свиньи: гене- In Russian.
тика и медико-биологическое использование. 3. Tikhonov VN. [Laboratory Mini-Pigs: Genetics
Новосибирск, 2010. and Medical Biological Using]. Novosibirsk, 2010.
4. Ali Fazal M, Edgar M. Detection of adolescent idio- In Russian. Адрес для переписки:
pathic scoliosis. Acta Orthop Belg. 2006;72:184-186. 4. Ali Fazal M, Edgar M. Detection of adolescent idio- Зайдман Алла Михайловна
5. Campbell RM, Smith MD, Mayes TC, et al. The pathic scoliosis. Acta Orthop Belg. 2006;72:184-186. 630091, Новосибирск, ул. Фрунзе, 17,
characteristics of thoracic insufficiency syndrome 5. Campbell RM, Smith MD, Mayes TC, et al. The charac- НИИТО,
associated with fused ribs and congenital scoliosis. teristics of thoracic insufficiency syndrome associated A2aydman@nniito.ru
J Bone Joint Surg Am. 2003;85:399-408. with fused ribs and congenital scoliosis. J Bone Joint Surg Am. 2003;85:399-408. Статья поступила в редакцию 15.05.2013
А.М. Зайдман, д-р мед. наук, проф.; М.А Садовой, д-р мед. наук, проф.; Е.Л. Строкова, науч. сотрудник; А.В. Корель, канд. биол. наук; Т.В. Русова, канд. биол. наук, Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна.
A.M. Zaidman, MD, DMSc, Prof.; M.A Sadovoy, MD, DMSc, Prof.; E.L. Strokova, researcher; A.V. Korel, PhD in Biology; T.V. Rusova, PhD in Biology, Novosibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopaedics n. a. Ya.L. Tsivyan.
80
