CC BY
41МЕДИКО-БІОЛОГІЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ MEDICAL-BIOLOGICAL APPLICATION
Фізика живого, Т. 19, No 1, 2011. С.25-29.
© Матвієнко М. Г., Пустовалов А. С., Бузинська Н. О., Дзержинський М. Е.
УДК 591.47:612.6
МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ В ТЕСТИКУЛАХ ЩУРІВ ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВІКУ ПІД ВПЛИВОМ КІССПЕПТИНА НА ФОНІ БЛОКАДИ ТА АКТИВАЦІЇ АЛЬФА-АДРЕНОРЕЦЕПТОРІВ I ПРИ ВВЕДЕННІ МЕЛАТОНІНА
Матвієнко М.Г., Пустовалов А.С., Бузинська Н.О., Дзержинський М.Е.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна Надійшла до редакції 29.01.2010
Установлена активація функції тестикул у щурів препубертатного віку після введення кісспептина як на фоні фізіологічного розчину, так і в комбінації з празозином і мелатоніном. Натомість, ін’єкції антагоніста кісспептинових рецепторів спричинили інактивацію гонад як на фоні фізіологічного розчину, так і в комплексі з мезатоном і мелатоніном.
Ключові слова: тестикули, кісспептин, мезатон, празозин, мелатонін.
ВСТУП
Кісспептин був відкритий 1999 року в місті Херші, штат Пенсільванія. В 2001 році його ідентифікували як ендогенний ліганд орфанового G-білок спряженого рецептора GPR54 [1]. Білок є продуктом гена Kiss1, який відомий як супресор метастазів [2]. Ліганд спочатку іменували метастином, та в даний час називають кісспептином. Продукт гена Kiss1 складається зі 145 амінокислот. Високі рівні експресії як рецептора, так і як пептида, спостерігаються в плаценті, більш низькі рівні - в мозку, зокрема, в гіпоталамусі та гіпофізі. мРНК Kiss1r (рецептора) в щурів була виявлена в таких регіонах мозку, як міст, середній мозок, таламус, гіпоталамус, гіпокамп, мигдалина, кора і смугасте тіло, а також у печінці та кишечнику [3]. Інші дослідження також підтвердили локалізацію Kiss1r мРНК у вищезазначених областях мозку, в тому числі діагональних смугах Брока, медіальних перегородках, медіальній преоптичній області, бічній преоптичній області, преоптичному ядрі гіпоталамуса [4]. Kiss1r мРНК також експресувалася в гіпофізі [5]. мРНК Kiss1 (кісспептина) була виявлена в центральній нервовій системі і, зокрема, в таких гіпоталамічних ділянках, як аркуатне ядро, антеровентральне
перивентрикулярне ядро і преоптичне ядро. [6]. Експресія мРНК Kiss1 також спостерігалася в гіпофізі, аркуатному, паравентрикулярному і
вентромедіальному ядрах гіпоталамуса [7].
Важливу роль кісспептина і його рецептора в регуляції репродуктивної системи було вперше зазначено в дослідженнях мутацій рецепторів кісспептина в деяких пацієнтів з ідіопатичним гіпогонадотропним гіпогонадизмом [8] і підтверджено
на моделі трансгенних мишей. Кісспептин відтоді визнаний основним регулятором гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної осі, що керує пубертатом, все в більшої кількості видів тварин. Кісспептин стимулює вивільнення гонадотропіну (ГнРГ). ГнРГ є прямим посередником цього ефекту, як було показано у мавп [9], овець [10], свиней [11] і кіз [12]. Антагоністи ГнРГ блокують кісспептин-індуковане вивільнення гонадотропінів [13]. Подальші дослідження встановили, що ГнРГ - нейрони експресують рецептори кісспептина [4, 10]. І ключові
експерименти з Kiss1r- і Kiss1-нокаутованими мишами показали, що функціональний рецептор кісспептина необхідний для секреції ГнРГ і викиду лютеїнізуючого гормону (ЛГ) та
фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) [8, 14].
Дослідження механізму комунікації між кісспептином і ГнРГ нейронами методом с-Fos імунореактивності виявили, що активність ГнРГ-нейронів збільшується під дією кісспептина [4], і що кісспетин деполяризує ГнРГ-нейрони [15].
Існує чимало доказів того, що кісспептин-рецепторна сигналізація необхідна для початку статевого дозрівання. Люди і миші з порушенням Kiss1r або гена Kiss1 не в змозі пройти через пубертат [8, 14]. Введення кісспептина щурам препубертатного віку індуковало передчасний пубертат, в той час як центральні ін'єкції антагоністом кісспептина затримували статеве дозрівання [16]. У пубертатний період зростає зв’язок між кісспептином і ГнРГ-нейронамии, що проявляється в збільшенні гіпоталамічної експресії мРНК Kiss1 і Kiss1r, збільшенні контактів між волокнами ГнРГ-нейронів і підвищенні чутливості ГнРГ-нейронів до
Матвієнко М.Г., Пустовалов А.С., Бузинська Н.О., Дзержинський М.Е.
кісспетина. Кісспетин також може діяти на рівні гіпофіза, хоча це остаточно не доведено і вимагає подальшого розслідування [i7]. Все більше даних свідчать про те, що система кісспетин-рецептор кісспетина інтегрує два метаболічних сигнали, з одного боку - харчування та обмін речовин [i8], з іншого боку - сигнали навколишнього середовища (в тому числі фотоперіод) [i9], та впливає на репродуктивну систему.
Гонадостимулюючий ефект альфа-адренергічної системи головного мозку загальновизнаний [20, 2i], але взаємодія механізмів кісспептинергічної та альфа-адренергічної активації гонад остаточно не вивчена. Тому метою даної роботи було дослідження впливу кісспетина на активність тестикул статевонезрілих щурів за умов активації та блокади альфа-адренорецепторів і при введенні мелатоніна. Оцінювалися зміни діаметра тестикулярних канальців та площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга, які є показниками функціональної активності репродуктивної системи в самців.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Експеримент проведений на 50 самцях білих нелінійних щурів Rattus norvegicus одномісячного віку масою 55-60 г. Відповідно координатам атласу мозку щура [22] у перебігу стереотаксичної операції досліджувався вплив інтрацеребрального введення кісспептина (метастин -(45-54)-амід, Sigma, США) на гонади, а також його комбінації з гормоном епіфізу мелатоніном (віта-мелатонін, ВАТ «Київський вітамінний завод», Україна) і альфа-адреноблокатором празозином (празозин-ратіофарм, Меркле Гмбх, Шмеччина). Також досліджувався вплив інтрацеребрального введення блокатора кісспептинових рецепторів (кісспептин-234-трифлюороацетат, Sigma, США), а також його комбінованого введення в комплексі з мелатоніном та альфа-адреноміметиком мезатоном (ТОВ «Дослідний завод «гаЦЛС», Україна).
Контрольну групу складали щури, які отримували ін’єкції по 0,5 мл 0,9 % ізотонічного розчину хлориду натрія (АТЗТ по виробництву інсулінів "Індар", Україна) один раз на добу. Ведення кісспептина здійснювалося протягом трьох діб до взяття матеріалу інтрацеребрально у лівий шлуночок мозку на стереотаксичному приладі за допомогою спеціально переобладнаного шприця у дозі 3 мкг/100 г ваги тіла один раз на добу. Блокатор кісспептинових рецепторів ін’єкувався протягом трьох діб до взяття матеріалу інтрацеребрально у лівий шлуночок мозку на стереотаксичному приладі за допомогою спеціально переобладнаного шприця у дозі 3 мкг/100 г ваги тіла один раз на добу. Мелатонін вводився перорально протягом 10 діб до взяття матеріалу в дозі 100 мкг/100 г ваги тіла один раз на добу. Празозин вводили перорально протягом 10 діб до взяття матеріалу у дозі 100 мкг/100 г ваги тіла один раз на добу. Мезатон вколювався парентерально протягом 10 діб до взяття
матеріалу у дозі 100 мкг/100 г ваги тіла один раз на добу.
Експериментальний матеріал оброблявся за стандартною гістологічною методикою. H мікротомі LKB Ultratom ME III TYP 888802 виготовлялися препарати гонад товщиною 5 мкм, які фарбували гематоксиліном та еозином. H гістологічних препаратах за допомогою мікроскопа Olympus BX51 і системи аналізу зображень Olympus DP-Soft 3.2 вимірювали площу поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга при збільшенні Х400 та діаметр тестикулярних канальців при збільшенні Х100. Отримані виміри аналізувалися за допомогою методів варіаційної статистики. Статистична вірогідність змін між морфометричними показниками контрольних та піддослідних груп щурів оцінювали за t-критерієм Стьюдента. Достовірною вважали різницю між контрольними та піддослідними серіями при р<0,05. Статистична обробка даних здійснювалася за допомогою програмного забезпечення Sewws Statistica 7.0. for Windows.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
У щурів контрольної групи (ФР), яким вводили лише фізіологічний розчин, площа поперечного
перерізу ядер клітин Лейдіга становить 10,33±0,09
2
мкм , а діаметр тестикулярних канальців -152,74±0,86 мкм. Площа поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга достовірно зменшилася в щурів після введення блокатора кісспептинових рецепторів кісспептин-234-трифлюороацетата на фоні фізіологічного розчину (ФР+Бл) (7,49±0,11 мкм2). Також у цій групі зменшився діаметр тестикулярних канальців (140,47±0,63 мкм), порівняно з контрольною групою. Щури, яким вводили
кісспептин на фоні фізіологічного розчину (ФР+Кіс), продемонстрували достовірне зростання показників площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга (15,64±0,09 мкм2) та діаметра тестикулярних
канальців (167,57±0,67 мкм), в порівнянні з тваринами групи ФР. Таким чином, зменшення морфометричних параметрів гонад піддослідних щурів пояснюється гальмуванням функції гонад після введення
антагоніста кісспептинових рецепторів. Hатомiсть, ін’єкції кісспептина на фоні фізіологічного розчину проявилися в достовірному збільшенні вимірюваних показників активності тестикул, що вказує на активацію репродуктивної функції, і це не суперечить отриманим експериментальним даним інших дослідників [13].
Щури, які отримували ін’єкції мелатоніном (Мел), проявили достовірне зростання за обома вимірюваними параметрами: площею поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга (12,26±0,08 мкм2) та діаметром тестикулярних канальців (160,66±0,47 мкм), порівняно з контрольною групою. Показник площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга зазнав статистично достовірного зменшення в групі щурів, які отримували блокатор кісспептинових
рецепторів на фоні мелатоніна (Мел+Бл) (8,73±0,06 мкм2), на відміну від тварин групи Мел. Діаметр тестикулярних канальців також достовірно зменшився в групі щурів після введення блокатора кісспептинових рецепторів (153,66±0,56 мкм), порівняно з групою тварин, яким вводили лише мелатонін. Група тварин, якій ін’єкувався кісспептин на фоні мелатоніна (Мел+Кіс), проявила достовірне зростання площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга (16,12±0,07 мкм2) та діаметра тестикулярних канальців (170,29±05 мкм), в порівнянні з щурами групи Мел. Загалом можна констатувати активацію функції тестикул під дією мелатоніна в досліджуваній концентрації. При введенні мелатоніна з кісспептином морфометричні параметри гонад показали ще більшу активацію, ніж при ін’єкціях одним мелатоніном.
Отримані дані свідчать про гонадостимулюючий вплив одочасного введення мелатоніна і кісспептина, що не суперечить попередньому висновку про кісспептинопосередкований характер
гонадостимулюючого ефекту мелатоніна в одномісячних щурів. Але після впливу блокатора рецепторів кісспептина на фоні мелатоніна площа поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга і діаметр тестикулярних канальців достовірно зменшувалися, що пов’язується з пригніченням функції гонад. Отже, блокада рецепторів кісспептина знімала активацію тестикул, що дає підставу припустити наявність певного гонадостимулюючого ефекту мелатоніна. Аналогічний ефект блокатора кісспетинових рецепторів спостерігали й інші автори [16].
Таблиця 1
Площа поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга та діаметр тестикулярних канальців
^—-^^Параметр Група Площа перерізу ядер клітин Лейдіга, мкм2, М±т Діаметр тестикулярних канальців, мкм, М±т
Фізіологічний розчин 10,33±0,09 152,74±0,86
Фізіологічний розчин+блокатор 7,49±0,11* 140,47±0,63*
Фізіологічний розчин+кісспетин 15,64±0,09* 167,57±0,67*
Мелатонін 12,26±0,08* 160,66±0,47*
Мелатонін+блокатор 8,73±0,06л 153,66±0,56л
Мелатонін+кісспептин 16,12±0,07# 170,29±05#
Мезатон 12,98±0,11* 166,30±07*
Мезатон+блокатор 8,83±0,08л 152,68±0,76л
Празозин 7,95±0,07* 140,43±0,68*
Празозин+кісспептин 11,89±0,08# 159,09±0,68#
- р<0,05, порівняно з групою ФР;
# - р<0,05, порівняно з відповідною групою без кісспептина; л - р<0,05, порівняно з відповідною групою без блокатора.
Група щурів після введення мезатона (Мез) показали достовірне зростання показників площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга (12,98±0,11 мкм2) і діаметра тестикулярних канальців (166,30±07 мкм), порівняно з контрольною групою ФР. Ці ж морфометричні показники достовірно зменшилися в тварин після введення блокатора кісспептинових рецепторів на фоні мезатона (Мез+Бл), в порівнянні з групою Мез. Площа поперечного перерізу ядер клітин
Лейдіга в щурів групи Мез+Бл становить 8,83±0,08
2
мкм , а діаметр тестикулярних канальців -152,68±0,76 мкм. Так, збільшення досліджуваних параметрів тестикул одномісячних щурів після введення мезатона в даному дослідженні відбулося в результаті стимуляції альфа-адренорецепторів та подальшої активації гонад. А зменшення площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга і діаметра тестикулярних канальців у групі тварин, яким вводили антагоніст кісспептинових рецепторів на фоні мезатона, пояснюється інактивацією функції тестикул. Отже, блокада кісспептинових рецепторів гальмувала прояв гонадостимулюючого ефекту мезатона, що також може свідчити на користь
кісспептинопосередкованої дії альфа-адренергічної системи на гіпоталамо-гонадну вісь.
Вимірювані параметри тварин, яким вводили празозин (Пр), зазнали статистично достовірного зменшення, в порівнянні з показниками щурів контрольної групи. Так, площа поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга в тварин групи Пр сягає 7,95±0,07 мкм2, а діаметр тестикулярних канальців -140,43±0,68 мкм. Після ін’єкцій кісспептина на фоні празозина (Пр+Кіс) достовірно збільшилася як площа поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга (11,89±0,08 мкм ), так і діаметр тестикулярних канальців (159,09±0,68 мкм), порівняно з щурами групи Пр. (Таблиця 1). Достовірне зменшення морфометричних параметрів гонад у щурів, які отримали празозин, демонструє зниження функції тестикул у досліджуваних щурів. Таким чином, блокада альфа-адренергічної системи призводить до гальмування репродуктивної функції гонад піддослідних тварин. Активуючий ефект кісспептина проявився в зростанні площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга і діаметра тестикулярних канальців, незважаючи на комбінований вплив празозина. З отриманих даних випливає, що активація гонад здійснюється за участі
Матвієнко М.Г., Пустовалов А.С., Бузинська Н.О., Дзержинський М.Е.
як альфа-адренергічної, так і кісспептинергічної системи одночасно. Блокада будь-якої з цих систем призводить до інактивації гонад.
ВИСНОВКИ
У щурів одномісячного віку введення кісспептина спричинило гонадостимулюючий ефект, який проявився в зростанні вимірюваних морфометричних параметрів гонад (площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга і діаметра тестикулярних канальців). Активація гонад під дією кісспептина спостерігалася навіть при комбінованому впливі празозина. Мезатон і мелатонін також вплинули на збільшення морфометричних параметрів гонад, що вказує на активацію функції останніх. Введення празозина спричинило інактивацію тестикул щурів, на що вказувало зменшення досліджуваних морфомет-ричних параметрів. Ін’єкції антагоніста кісспеп-тинових рецепторів гальмували активність тестикул у тварин, що підтверджувалося зменшенням відповідних морфометричних параметрів гонад. Блокада кісспептинових рецепторів гальмувала прояв гонадостимулюючого ефекту мезатона та знімала активацію тестикул внаслідок дії мелатоніна, що може свідчити про кісспептинопосередковану дію альфа-адренергічної системи на гіпоталамо-гонадну вісь. Активація гонад здійснюється за участі як альфа-адренергічної, так і кісспептинергічної системи одночасно. Блокада будь-якої з цих систем призводить до інактивації гонад.
Література
1. KotaniM, DetheuxM, etal. The Metastasis Suppressor Gene KiSS-1 Encodes Kisspeptins, the Natural Ligands of the Orphan G Protein-coupled Receptor GPR54 // J. Biol. Chem.- 2001. -Vol. 37, № 27б. - Р. 34631-34636.
2. Lee J.H., Miele M. E., et al. Kiss-i, a novel human malignant melanoma metastasis-supressor gene // J. Natl. Cancer Inst. - 1996. - Vol. 23, № 88. - Р.І73І-І737.
3. Lee D. K., Nguyenc T.,. et al. Discovery of a receptor related to the galanin receptors // FEBS Lett. - І999. - Vol. 446, № 5. - P. 103-107.
4. Irwig M.S., Fraley G.S., et al. Kisspeptin activation of gonadotropin releasing hormone neurons and regulation of KiSS-i mRNA in the male rat // Neuroendocrinology. -2004. - Vol. 4, № 80. - Р. 264-272.
5. .Richard N., Galmiche G., et al. KiSS-i and GPR54 genes are co-expressed in rat gonadotrophs and differentially regulated in vivo by oestradiol and gonadotrophin-releasing hormone // J. Neuroendocrinol. - 2008. - Vol. 3, № 20. - Р. 38І-393.
6. Adachi S., Yamada S., et al. Involvement of Anteroventral Periventricular Metastin/Kisspeptin Neurons in Estrogen Positive Feedback Action on Luteinizing Hormone Release in Female Rats // Journal of Reproduction and Development. - 2007. - Vol. 53, № 2. - Р. 367-378.
7. Brailoiu G.C., Dun S.L., et al. KiSS-1 expression and metastin-like immunoreactivity in the rat brain // J. Comp. Neurol. - 2005. - Vol.3, № 481. - P.314-329.
8. Seminara S.B., Messager S., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty // N. Engl. J. Med. -2003. - Vol. 23, № 349. - P. 1614 -1627.
9. Keen K.L., Wegner F.H., et al. An increase in kisspeptin-54 release occurs with the pubertal increase in luteinizing hormone-releasing hormone-1 release in the stalk-median eminence of female rhesus monkeys in vivo // Endocrinology. - 2008. - Vol.8, № 149. - P. 4151-4157.
10. Messager S., Chatzidaki E., et al. Kisspeptin directly stimulates gonadotropin-releasing hormone release via G protein-coupled receptor 54 // Natl. Acad. Sci. USA. - 2005.
- Vol. 102, №. 5. - P. 1761-1766.
11. Lents C.A., Heidorn N.L., et al. Central and peripheral administration of kisspeptin activates gonadotropin but not somatotropin secretion in prepubertal gilts // Reproduction.
- 2008. - Vol. 6, № 135. - P. 879-887.
12. Hashizume T., Saito H., et al. Characteristics of stimulation of gonadotropin secretion by kisspeptin-10 in female goats // Anim. Reprod. Sci. - 2010. - Vol. 1, № 118. - P. 37-41.
13. Navarro V. M.,. Castellano J. M, et al. Developmental and Hormonally Regulated Messenger Ribonucleic Acid Expression of KiSS-1 and Its Putative Receptor, GPR54, in Rat Hypothalamus and Potent Luteinizing Hormone-Releasing Activity of KiSS-1 Peptide // Endocrinology. -2004. - Vol. 145, №. 10. - P. 4565-4574.
14. Lapatto R., Pallais J. C., et al. Kiss1- Mice Exhibit More Variable Hypogonadism than Gpr54-/- Mice // Endocrinology. - 2007. - Vol. 148, № 10. - P. 4927-4936.
15. Zhang C., Roepke T.A., et al. Kisspeptin depolarizes gonadotropin-releasing hormone neurons through activation of TRPC-like cationic channels // J. Neurosci. - 2008. - Vol. 8, № 28. - P. 4423-4434.
16. Pineda R., Garcia-Galiano D., et al. Critical roles of kisspeptins in female puberty and preovulatory gonadotropin surges as revealed by a novel antagonist // Endocrinology. -2010. - Vol.2, 151. - P. 722-730.
17. Richard N., Corvaisier S., et al. KiSS-1 and GPR54 at the pituitary level: overview and recent insights // Peptides. -2009. - Vol. 1, № 30. - P. 123-129.
18. Castellano J. M., Navarro V. M., et al. Changes in Hypothalamic KiSS-1 System and Restoration of Pubertal Activation of the Reproductive Axis by Kisspeptin in Undernutrition // Endocrinology. - 2005. - Vol. 146, № 9. -P. 3917-3925.
19. Wagner G.C., Johnston J.D., et al. Redefining the limits of day length responsiveness in a seasonal mammal // Endocrinology. - 2008. - Vol.1, № 149. - P. 32-39.
20. Moger W.H., Murphy P.R. Beta-adrenergic agonist induced androgen production during primary culture of mouse Leydig cells // Arch. Androl. - 1983. - Vol. 1, № 10. - P. 135-142.
21. Mayerhofer A., Bartke A., Began T. Catecholamines stimulate testicular steroidogenesis in vitro in the Siberian hamster, Phodopus sungorus // Biology of reproduction. -1993. - Vol. 48, № 4. - P. 883-888.
22. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic
coordinates. - New York: Acad. Press, 1997. - 29 p.
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ТЕСТИКУЛАХ КРЫС ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КИССПЕПТИНА НА ФОНЕ БЛОКАДЫ И АКТИВАЦИИ АЛЬФА-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ И ПРИ ВВЕДЕННИИ МЕЛАТОНИНА
Матвиенко М.Г., Пустовалов А.С., Бузинская Н.А., Дзержинский Н.Э.
Установлена активация функции тестикул у крыс препубертатного возраста после введения кисспептина как на фоне физиологического раствора, так и в комбинации с нразозином и мелатонином. Шпротив, инъекции антагониста кисспептиновых рецепторов вызвали инактивацию гонад как на фоне физиологического раствора, так и в комплексе с мезатоном и мелатонином.
Ключевые слова: тестикулы, кисспептин, мезатон, празозин, мелатонин.
MORPHOFUNCTIONAL CHANGES IN PREPUBERTAL RAT TESTES UNDER KISSPEPTIN INFLUENCE AGAINST BLOCKADE AND ACTIVATION OF ALPHA-ADRENERGIC RECEPTORS AND MELATONIN ADMINISTRATION
Matvienko M.G., Pustovalov A.S., Buzynska N.O., Dzerzhinsky M.E.
Activation of testicular function is revealed in prepubertal rats after kisspeptin administration both comparing to phisiological solution and in combination with prazosin and melatonin. In contrast, injections of kisspeptin receptor antagonist resulted inactivation of the gonads both comparing to phisiological solution and in in complex with mezaton and melatonin.
Key words: testes, kisspeptin, mezaton, prazosin, melatonin.
