CC BY
53МЕДИКО-БІОЛОГІЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ MEDICAL-BIOLOGICAL APPLICATION
Фізика живого, Т. 19, No 2, 2011. С. 31-34.
© Дзержинський М.Е., Пустовалов А С., Пазюк Л.М., Бузинська Н. О., Калиновський В. Є., Катькова О. В
Physics of the Alive -t
www.pa.science-center, net )
УДК 591.147; 612.45; 612.4.09
ДІЯ К^ПЕПТИНУ І МЕЛАТОНІНУ НА ГОНАДИ І КОРУ НАДНИРНИКІВ САМЦІВ ЩУРІВ
Дзержинський М.Е., Пустовалов А.С., Пазюк Л.М., Бузинська Н.О., Калиновський В.Є., Катькова О.В.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
Навчально-науковий центр «Інститут біології»
Е-таІ1:1иЬа.ра2ик@§таІ1.сот
Надійшла до редакції 14.05.2011
При введенні кІ88пептину щурам посилюється виключно функція клітин Лейдіга у сім’яниках. При цьому мелатонін викликав вірогідне зменшення діаметрів сім’яних канальців і пригнічував останні стадії сперматогенезу, але не змінював показники клітин Лейдіга. При одночасному введенні мелатоніну і кІ88пептину нами виявлено водночас посилення синтетичної активності клітин Лейдіга і зменшення діаметра сім’яних канальців. На підставі цього можна припустити існування двох ланок регуляції статевої функції: стимулююча ланка кІ88пептин - ЛГ- клітини Лейдіга - тестостерон, пригнічуюча ланка мелатонін - ФСГ - звивисті сім’яні канальні -сперматогенез.Разом з тим встановлено інгібіторний вплив окремо для мелатоніну і кІ88-пептину на синтетичну активність спонгіоцитів кори наднирників. При одночасному їх застосуванні, навпаки, у корі наднирників посилюється кортикостероїдогенез. Ймовірно отримані результати досліджень можна пояснити конкурентним впливом мелатоніну та кІ88пептину як на регуляторні системи головного мозку, зокрема гіпоталамус і аденогіпофіз, так і на ендокринні залози.
Ключові слова: кісспептин, мелатонін, сім’яник, кора наднирників.
ВСТУП
Відомо, що кісспептинові нейрони стимулюють функцію нейронів гіпоталамуса, що синтезують специфічний регулятор гонадотропної функції люліберин. До того ж кісспептинові нейрони експресують рецептори до андрогенів та естрогенів, які задіяні у негативному зворотному зв’язку між гонадами і гіпоталамусом. Існують дані про дію кісспептину на рівні дистальної частки аденогіпофіза. [1-5]. Інший гормон, що має неоднозначний вплив на репродуктивну систему - це мелатонін. Вважають, що мелатонін негативно впливає на статеву функцію як на рівні гіпоталамуса і гіпофіза, так і безпосередньо діючи на гонади. Його ефекти залежать також від різних факторів, зокрема години введення цього гормону, тривалості введення мелатоніну, дози введеного гормону, довжини фотоперіоду. Встановлено, що кісспептинові нейрони перебувають під впливом мелатоніну епіфіза [6-8]. Існують також припущення, що кісспептин і мелатонін ймовірно залучаються до контролю кортикостероїдогенезу [9,10].
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
У досліді використано статевозрілі самці щурів лінії Вістар двомісячного віку із віварію ННЦ
«Інститут біології». Експерименти планували таким чином, що у кожній групі піддослідних тварин було 5
- 7 особин. Під час проведення досліду всіх щурів утримували в умовах одного віварію на стандартному харчовому раціоні. щурів кожної серії досліду утримували в окремій клітці. Температура у віварії становила 22 - 240 С.
Контрольну групу складали щури, які одержували ін’єкції 0,5 мл ізотонічного розчину хлориду натрія. Наступні серії досліду проводили на тваринах, що одержували фармакологічні препарарати: мелатонін, кісспептин, мелатонін + кісспептин. Дози фармакологічних препаратів розраховували на 100 г маси тіла. У першій серії дослідів мелатонін вводили тваринам 14 діб перорально у дозі 100 мкг. Мелатонін
- це гормон, що продукується пінеалоцитами епіфіза. У другій серії дослідів кісспептин вводили за 1 добу до забою внутрішньошлуночково у дозі 10 мкг . Кісспептин - це пептид, який синтезується у нейронах гіпоталамуса. В третій серії дослідів одноразова ін’єкція кі88пептину внутрішлунково була зроблена тваринам на тлі хронічного введення мелатоніну.
Наприкінці дослідів щурів усіх груп декапітували. Матеріал для гістологічних досліджень (сім’яники і наднирники) фіксували у 10% розчині формальдегіда. Далі залози обробляли традиційними гістологічними методиками і виготовляли гістологічні препарати.
Дзержинський М.Е., Пустовалов А.С., Пазюк Л.М., Бузинська Н.О., Калиновський В.Є., Катькова О.В.
Зрізи завтовшки 5-6 мкм забарвлювали гематоксиліном Бьомера та еозином.
Функціональний стан клітин кори наднирників оцінювали за діаметром ядер спонгіоцитів, оскільки відомо про прямий зв’язок даного параметру із синтетичною активністю клітин. У сім’яниках вимірювали діаметр звивистих сім’яних канальців, який є одним з морфологічних еквівалентів сперматогенезу, і площу поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга, що синтезують тестостерон. Водночас візуально оцінювали стадії сперматогенезу.
Одержані гістологічні препарати всіх серій досліду аналізували на світловому мікроскопі. Мікрофотографії робили за допомогою установки System Microscope з відеокамерою Olympus BX 41 system, обладнаного цифровою фотокамерою Camedia C-5050 zoom і програмним забезпеченням Olympus DP 80 FT 3.2 на базі комп’ютера Pentium 4 з операційною системою Windows XP. Обробку мікрофотографій гістологічних препаратів отриманих на цифровому аналізаторі проводили за допомогою програми Medical Image Analyser (Version 1.0 (c) 2000 Powered by Ander).
Вірогідність різниці між морфометричними показниками контрольних та піддослідних груп птахів оцінювали за t-критерієм Стьюдента. Статистичну обробку здійснювали за допомогою програмного забезпечення STATISTICA for Windows 5.0.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
У відповідності з метою досліджень проведено морфофункціональний аналіз реакції сім’яників та
наднирників двомісячник щурів при введенні кісспептин і мелатоніну.
Встановлено, що сперматогенний епітелій у звивистих сім’яних канальцях сім’яників щурів контрольної групи представлений сперматогоніями, сперматоцитами І та ІІ порядку, сперматидами та численними зрілими сперматозоїдами.
Інтерстиціальні клітини Лейдіга утворюють скупчення поблизу капілярів. Вони мають округлі світлі ядра з добре помітними ядерцями. У щурів контрольної серії досліду середній діаметр звивистих сім’яних канальців становить 208,10+2,26 мкм, а середня площа перерізу ядер клітин Лейдіга -21,80+0,61мкм2 (табл.1). Виявлені морфометричні показники свідчать про помірну секреторну активність, а стадії сперматогенезу відповідають розвитку статевозрілих тварин.
За отриманими даними введення кі88пептину щурам викликало посилення функції клітин Лейдіга у сім’яниках, оскільки їх площа перерізу достовірно збільшувалась у порівняні з контролем, але діаметр звивистих сім’яних канальців зменшувався: середній діаметр сім’яних канальців становить 205,94+2,29 мкм порівняно з контролем 208,10+2,26 мкм, а площа перерізу ядра клітини Лейдіга сягає 26,43+ 0,55 мкм . У пінистій цитоплазмі клітин Лейдіга виявляли великі еухроматизовані округлі ядра з яскраво вираженими ядерцями, що вказує на посилення процесів стероїдогенезу. При цьому діаметр звивистих сім’яних канальців хоча зменшувався до 205,94+2,29 мкм, але в ньому були наявні у достатній кількості зрілі спермії (табл.1).
Таблиця 1
Морфометричні показники сім’яників у контрольних та піддослідних щурів
Серії досліду Діаметр звивистих сім’ яних • 2 канальців, мкм Площа перерізу ядер клітин Лейдіга, мкм2
Контроль 208,10+2,26 21,80+0,61
Кісспептин 205,94+2,29* 26,43+0,55*
Мелатонін 193,08+2,22* 22,15+0,45
Мелатонін+кісспептин 198,49+2,96* 24,21+0,45*
* - різниця між контрольною та піддослідною групами вірогідна при р < 0,05
Одержані результати збігаються з літературними даними про причетність кі88пептину до регуляції статевої функції у ссавців, і як ми вважаємо, через посилення синтезу ЛГ гонадотропоцитами аденогіпофіза, оскільки загальновідомо, що ЛГ стимулює секрецію тестостерона.
При цьому претендент на роль антагоніста функції гонад мелатонін викликав вірогідне зменшення діаметрів звивистих сім’яних канальців і уповільнював хід сперматогенезу, але не змінював показники клітин Лейдіга, ймовірно пригнічуючи лише синтез ФСГ гонадотропоцитами аденогіпофіза. Так встановлено, що діаметр сім’яних канальців різко звужувався до 193,08+2,22 мкм, а площа перерізу ядер
клітин Лейдіга відповідала розмірам 22,15+0,45 мкм2 близьким до контрольних значень. У складі звивистих сім’яних канальців виявляли сперматогонії, сперматоцити І і ІІ порядків та розрізнені малочисленні сперматозоїди. Клітини Лейдіга виглядали більш темними і мали округлі або витягнуті ядра, що говорить про посилення процесів депонування гормонів у цитоплазмі.
На підставі наведених даних можна зробити висновок про пригнічення останніх стадій сперматогенезу під впливом введення мелатоніну і появи морфологічних ознак зниження секреторної активності клітин Лейдіга.
ДІЯ К^ПЕПТИНУ І МЕЛАТОНІНУ НА ГОНАДИ І КОРУ НАДНИРНИКІВ САМЦІВ ЩУРІВ
Навпаки при сумісному введенні мелатоніну і кі88пептину нами виявлено, що діаметри звивистих сім’яних канальців зменшуються до 198,49+2,96 мкм порівняно з контролем, а площа перерізу ядер клітин Лейдіга збільшується до 24,21+0,45 мкм проти 21,80+0,61 мкм2 у контрольній серії досліду. Клітини Лейдіга мають світлу пінисту цитоплазму, де є округлі, світлі ядра з добре помітними ядерцями. У складі сперматогенного епітелію виявляються всі типи клітин, включаючи зрілі сперматозоїди.
Отже оскільки при одночасному введенні мелатоніну і кі88пептину нами виявлено водночас посилення синтетичної активності клітин Лейдіга і зменшення діаметра сім’яних канальців можна припустити існування двох ланок регуляції статевої функції: стимулююча ланка кі88пептин - ЛГ - клітини
Лейдіга - тестостерон, пригнічуюча ланка мелатонін -ФСГ - звивисті сім’яні канальці - сперматогенез.
Аналіз гістологічних препаратів наднирників показав, що при введенні тваринам kissпептину вірогідно зменшується функціональну активність спонгіоцитів пучкової і сітчастої зони кори порівняно з контролем (табл. 2), де виробляються переважно глюкокортикоїди і незначна кількість статевих гормонів. Ці клітини були темнозабарвлені, що вказує на зниження процесів секреції гормонів.
При цьому також встановлено інгібіторний вплив мелатоніну на синтетичну активність спонгіоцитів клубочкової, пучкової і сітчастої зон кори наднирників, про що свідчать морфофункціональні дані вимірювань і відповідний стан клітин, для яких було характерна більш темна гомогенна цитоплазма, без ознак накопичення стероїдів (табл. 2).
Таблиця 2
Морфометричні показники наднирників
Серії досліду Діаметри поперечного розрізу ядер спонгіоцитів кори наднирників, мкм
Клубочкова зона Пучкова зона Сітчаста зона
Контроль 4,70+0,05 5,52+0,05 4,94+0,05
Кісспептин 4,65+0,05 5,22+0,04* 4,58+0,05*
Мелатонін 4,57+0,05* 5,35+0,05* 4,09+0,04*
Мелатонін+Кісспептин 4,85+0,07** 5,55+0,05* 5,20+0,06**
* - різниця між контрольною та піддослідною групами вірогідна при р < 0,05
* - різниця між групами мелатонін і мелатонін + кісспептин вірогідна при р < 0,05
Разом з тим при одночасному введенні піддослідним тваринам мелатоніну і кі88пептину у корі наднирників переважно посилюється кортикостероїдогенез порівняно з введенням мелатоніну і контролем. Такі висновки нами зроблені на підставі достовірного збільшення площі поперечного перерізу ядер спонгіоцитів кори до 4,85+0,07 мкм у клубочковій зоні, до 5,55+0,05 мкм у пучковій зоні і до 5,20+0,06 мкм у сітчастій зоні. Спонгіоцити цих зон мають пінисту цитоплазму, що свідчить про наявність ліпідних крапель, округлі еухроматизовані ядра з чіткими ядерцями, що означає посилення секреторної активності.
Вважаємо, що отримані результати досліджень про вплив мелатоніну і кі88пептину на функцію наднирників можна пояснити їх конкурентним впливом на регуляторні системи головного мозку, зокрема гіпоталамус і аденогіпофіз, і складною системою взаємозв’ язку між цими гормонами в організмі.
ВИСНОВКИ
При введення кі88пептину щурам достовірно збільшується площа перерізу ядер клітин Лейдіга, що свідчить про посилення синтезу тестостерона. Одержані результати можна пояснити дією кі88пептину на синтез ЛГ аденогіпофіза, що є
специфічним регулятором стероїдогенезу. Введення мелатоніну пригнічує останні стадії сперматогенезу і посилює процеси депонування статевих стероїдів у цитоплазмі клітин Лейдіга. Одночасне введення kissпептину і мелатоніну підтверджує попередні висновки. Отже можна припустити існування двох ланок регуляції статевої функції: стимулююча ланка kissпептин - ЛГ- клітини Лейдіга (синтез тестостерона), пригнічуюча ланка мелатонін - ФСГ -звивисті сім’яні канальці (сперматогенез).
Разом з тим встановлено інгібіторний вплив окремо для мелатоніну і kissпептину на синтетичну активність спонгіоцитів кори наднирників. При одночасному їх застосуванні, навпаки, у корі наднирників посилюється кортикостероїдогенез. Ймовірно отримані результати досліджень можна пояснити конкурентним впливом мелатоніну та kissпептину як на регуляторні системи головного мозку, зокрема гіпоталамус і аденогіпофіз, так і на ендокринні залози.
Література
1. Colledge W. H. Kisspeptins and GnRH neuronal signaling // Trends Endocrinol. Metab. - 2009. - Vol. 20. -Р.115-121.
2. Irwig M.S., Fraley G.S., Smith J.T., Acohido B.V., Popa
S.M., Cunningham M.J., GottschM.L., Clifton D.K., Steiner R.A. Kisspeptin activation of gonadotropin releasing hormone neurons and regulation of KiSS-1 mRNA in the
Дзержинський М.Е., Пустовалов А.С., Пазюк Л.М., Бузинська Н.О., Калиновський В.Є., Катькова О.В.
male rat // Neuroendocrinology. - 2004. - Vol. 80. - Р. 264-272.
3. Decourt C., Tillet Y., Caraty A., Franceschini I., Briant C. Kisspeptin immunoreactive neurons in the equine hypothalamus interactions with GnRH neuronal system // J. Chem. Neuroanat. - 2008. - Vol. 36. - Р.131-137.
4. Gutmrrez-Pascual E., Martmez-Fuentes A.J., Pinilla L., Tena-Sempere M., Malag^m M.M., Castarn J.P. Direct pituitary effects of kisspeptin: activation of gonadotrophs and somatotrophs and stimulation of luteinising hormone and growth hormone secretion // Neuroendocrinol. - 2007.
- Vol. 19. - Р. 521-530.
5. Justyna Pielecka-Fortuna, R. Anthony DeFazio,Suzanne M. Moenter. Feedback regulation and kisspeptin action on gonadotropin-releasing hormone neurons in mice // Biol. Reprod. - 2011. - Vol. 85. - P. 987-995.
6. Пустовалов А.С. Вплив імунізації, введення мелатоніну, серотоніну та епіфізектомії на гіпоталамо-гонадну систему птахів (гістофізіологічний аналіз):
Автореф. дис. на здобуття вч.ст. канд. біол. наук: 03.00.11. - К., 2003. - 16 с.
У. Monica B. Frungieri, Artur Mayerhofer, Karina Zitta,
Omar P. Pignataro, Ricardo S. Calandra, Silvia I. Gonzalez-Calvar. Direct effect of melatonin on syrian hamster testes: melatonin subtype 1a receptors, inhibition of androgen production, and interaction with the local corticotropin-releasing hormone system // Endocrinology. -2005 -146: - P. 1541-1552.
8. Nicolette L. McGuire, Kristina Kangas, George E. Bentley. Effects of melatonin on peripheral reproductive function: regulation of testicular gnih and testosterone // Endocrinology. - 2011. - 152, N 9. - Р. 3461-3470.
9. Dungan H.M. , Clifton D.K, Steiner R.A. Minireview: Kisspeptin neurons as central processors in the regulation of gonadotropin-releasing hormone secretion // Endocrinology. - 2006. - Vol. 147, N 3. - P 1154-1158.
10. Oakley A.E. , Clifton D.K., Steiner R. A. Kisspeptin Signaling in the Brain // Endocrine Reviews. - 2009. - Vol. 30, N б. - P. 713-743.
ДЕЙСТВИЕ Ю^ПЕПТИНА И МЕЛАТОНИНА НА ГОНАДЫ И КОРУ НАДПОЧЕЧНИКОВ САМЦОВ КРЫС Дзержинський М.Е., Пустовалов А. С., Пазюк Л.М., Бузинська Н.О., Калиновський В.Є., Катькова О.В.
При введении kissпептина крысам усиливается исключительно функция клеток Лейдига в семенниках. При этом мелатонин вызывал достоверное уменьшение диаметров семенных канальцев и подавлял последние стадии сперматогенеза, но не изменял показатели клеток Лейдига. При одновременном введеннии мелатонина и kissпептина нами выявлено усиление синтетической активности клеток Лейдига и уменьшение диаметра семенных канальцев. На основании этого можно предположить существование двух элементов регуляции половой функции: стимулирующего (Ъ^пептин - ЛГ - клетки Лейдига - тестостерон) и подавляющего (мелатонін - ФСГ - извитые семенные канальцы - сперматогенез). В то же время установлено ингибиторное влияние отдельно для мелатонина і kissпептина на синтетическую активность спонгиоцитов коры надпочечников. При одновременном их введении, наоборот, в коре надпочечников усиливается кортикостероидогенез. Вероятно полученные результаты исследований можно объяснить конкурентным влиянием мелатонина и kissпептина как на регуляторные системы головного мозга, в частности гипоталамус і аденогипофиз, так и на эндокринные железы..
Ключевые слова: кисспептин, мела тонин, семенник, кора надпочечников.
ACTION OF KISSPEPTIN AND MELATONIN ON GONADS AND ADRENAL CORTEX OF MALE RATS Dzerzhinsky M.E., Pustovalov A.S., Pazyuk L.M., Buzinska N.O., Kalynovskyi V.E., Katkova O.V.
Kisspeptin administration activate Leudig cells on rat testis. Thus melatonin caused decrease of diameter of testis tubules and suppress last stages of spermatogenesis, but no effect on Leudig cells. It was shown that melatonin and kisspeptin combined administration caused activate Leudig cells function and decrease of diameter of testis tubules. It was suggested two-ways regulation of rat reproductive function. The stimulate way is kisspeptin-LH-Leudig cells-testosterone. The suppress way is melatonin-FSH-testis tubules-spermatogenesis.At the same time both melatonin and kisspeptin inhibit adrenal spongiocytes. On the contrary melatonin and kisspeptin combined administration increased steroidogenesis in the adrenal cortex. It is possible that melatonin and kisspeptin have rival interactions on brain regulation level (hypothalamus and adenohypophysis) and endocrine gland directly.
Key words: kisspeptin, melatonin, testis, adrenal cortex
