CC BY
7УДК 615.91:612.464:612.465:577.123.388
Герунов Т. В., Чигринский Е. А., Герунов В. И., Конвай В. Д.
Gerunov T. V., Chigrinski E. A., Gerunov V. I., Conway V. D.
МОРФОБИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК У КРЫС ПРИ ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ДЕЛЬТАМЕТРИНОМ
MORPHOBIOCHEMICAL EVALUATION OF RENAL INJURY IN RATS AT AN ACUTE INTOXICATION WITH DELTAMETRIN
Цель исследования - оценить характер и степень выраженности морфобиохимических изменений в почках у экспериментальных животных при остром отравлении синтетическим пиретроидом дельтаметрином.
Объектом исследования были 24 крысы-самца линии Вистар с массой тела 240±10 г Животные были разделены на две группы по 12 особей в каждой: 1 группа - контрольные крысы; 2 группа - животные, подвергнутые острой интоксикации дельтаметрином. Крысам 2-й группы однократно перорально вводили дельтаметрин в дозе 43,5 мг/кг массы тела (1/2ЛД50), а животным 1-й группы таким же путем вводили эквивалентный объем физиологического раствора. В ходе эксперимента использовали препаративную форму дельтаметрина под торговым названием «Butox 50» фирмы «Intervet International B.V.».
Интоксикация животных приводит к развитию в почках крыс острого нарушения метаболизма пуринов, характеризующегося накоплением мочевой кислоты, активацией свободно-радикальных процессов и возникновением выраженного дефицита аскорбиновой кислоты и токоферола, а также патоморфологических изменений, свидетельствующих о развитии дистрофических процессов и гемодинами-ческих расстройств. В целом результаты биохимических и патоморфологических исследований подтверждают потенциальную опасность развития почечной недостаточности, что необходимо учитывать в диагностике и патогенетической терапии отравлений животных синтетическими пире-троидами.
Ключевые слова: пестициды, синтетические пире-троиды, дельтаметрин, почки, пуриновый обмен, антиокси-дантная система.
Research objective is to estimate either character or degree of manifestation of morphobiochemical changes in kidneys of experimental animals at an acute intoxication with a synthetic pyrethroid deltametrin.
Test objects have been 24 male rats of the Vistar line with the body weight of 240±10 g. Animals under testing have been arranged into two groups - control and experimental each of 12 males. Experimental rats were exposed to an acute intoxication with deltametrin by means of a single administration of deltametrin in a dose 43.5 mg/kg per body wt (1/2LD50) pero-rally whereas control animals were treated with physiologic saline in equivalent volume in the same way. During experiment a preparative form of deltametrin under a trade name "Butox 50" produced by the firm "Intervet International B.V." was used.
Intoxication with deltametrin resulted in acute metabolic purine imbalance which is characterized by accumulation of uric acid, activation of free radical processes, development of pronounced ascorbic acid and tocopherol deficiency as well as pathomorphological changes that revealed dystrophic processes and haemodynamic disturbances. In general, results of biochemical and pathomorphological studies evidence potential for nephratonia that should be taken into consideration in diagnosing and pathogenetic therapy of animals poisoned with synthetic pyrethroids.
Keywords: pesticides, synthetic pyrethroids, deltamethrin, kidneys, purine metabolism, antioxidant status.
Герунов Тарас Владимирович -
кандидат биологических наук, доцент кафедры диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина» г. Омск
Тел: 8(3812) 230531 E-mail: vsed@mail.ru
Чигринский Евгений Александрович -
кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Омск
Тел: 8(3812)650577, E-mail: chigrinski@list.ru
Герунов Владимир Иванович -
доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой анатомии, гистологии, физиологии и патологической анатомии ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина» г. Омск
Gerunov Taras Vladimirovich -
Ph.D of Biology, Associate Professor at the Department of Diagnostics, Internal Non-Contagious Diseases, Pharmacology, Surgery and Obstetrics, Omsk State Agrarian University named after P. A. Stolypin, Omsk Tel: 8(3812) 230531 E-mail: vsed@mail.ru
Chigrinski Eugene Alexanderovich -
Ph.D of Biology,
Associate Professor at the Department
of Biochemistry, Omsk State Medical Academy,
Omsk
Tel: 8(3812)650577, E-mail: chigrinski@list.ru
Gerunov Vladimir Ivanovich -
DVM, professor,
Head of the Department of Anatomy, Histology, Physiology and Pathological Anatomy, Omsk State Agrarian University named after P. A. Stolypin, Omsk
в
Тел: 8(3812)23-03-40, E-mail: patan@omgau.ru
45
Конвай Владимир Дмитриевич -
доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры математических и естественнонаучных дисциплин ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина» г. Омск
Тел: 8(3812)25-04-09, E-mail: djerrikram@rambler.ru
Tel: 8(3812)23-03-40, E-mail: patan@omgau.ru
Conway Vladimir Dmitrievich -
MD, professor at the Department of Mathematical and Natural Sciences, Omsk State Agrarian University named after P.A. Stolypin Omsk
Tel: 8(3812)25-04-09, E-mail: djerrikram@rambler.ru
Почки относятся к жизненно важным органам, они выполняют экскреторную функцию, нарушение которой играет немаловажную роль в патогенезе любых интоксикаций. При отравлениях почки всегда вовлекаются в патологический процесс, что обусловлено высокой интенсивностью почечного кровотока и особой чувствительностью органа к гипоксии. В связи с этим почки представляют особый интерес как объект исследований при изучении токсикодина-мики различных химических соединений, в том числе пестицидов.
Цель исследования - оценить характер и степень выраженности морфобиохимических изменений в почках у экспериментальных животных при остром отравлении синтетическим пиретроидом дельтаметрином.
Материал и методы исследования. Объектом исследования были 24 крысы-самца линии Вистар с массой тела 240±10 г Животные были разделены на две группы по 12 голов в каждой: 1 группа - контрольные крысы; 2 группа - животные, подвергнутые острой интоксикации дельтаметрином. Крысам 2-й группы однократно перорально вводили дельтаметрин в дозе 43,5 мг/кг массы тела (У2 ЛД50) при помощи металлического зонда, а животным 1-й группы таким же путем вводили эквивалентный объем физиологического раствора. В ходе эксперимента использовали препаративную форму дельтаметрина под торговым названием «Butox 50» фирмы «Intervet International BV».
Спустя 24 часа после интоксикации проводили эвтаназию и патологоанатомическое вскрытие. Для биохимического исследования часть ткани почек подвергали гомогенизации в 0,15 М растворе хлорида калия (KCl) при 0-2оС. В гомо-генатах определяли содержание общего белка при помощи биуретового реактива, малонового диальдегида - по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой [4, с. 8], глутатиона - реакцией с 5,5-дитио-бис-(2нитробензойной) кислотой [8, с. 236]. Уровень мочевой кислоты оценивали спек-трофотометрически при длине волны 290 нм. Содержание токоферола в гомогенатах почек определяли по методу, основанному на восстановлении ионов железа в присутствии токоферола с образованием комплексного соединения с батофенантролином [6, с. 138]. Уровень аскорбиновой кислоты определяли при помощи титрования с 2,6-дихлорфенолиндофенолом [9, с. 527]. Активность супероксиддисмутазы (Кф
1.15.1.1) определяли по ингибированию реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде [5, с. 263]. Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли по методу, основанному на способности перекиси водорода образовывать стойкий окрашенный комплекс с солями молибдена [3, с. 16]. Активность глутатионпероксидазы (1.11.1.9) определяли по накоплению окисленного глутатиона [1, с. 19].
Оставшуюся часть патматериала фиксировали в 4 %-ном нейтральном растворе формальдегида. Обезвоживание проб проводили в спиртах восходящей концентрации, после чего материал заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм получали с парафиновых блоков на ротационном микротоме. Для визуализации изменений на клеточном уровне полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение и микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе Axio Scope 40 (Carl Zeiss) с встроенным TV-адаптером и цифровой видеокамерой Carl Zeiss Imager, A1.
Эксперимент был проведен в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Совет Европы № 123, Страсбург, 1985).
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрического ^-критерия Манна-Уитни. Результаты представлены как Ме - медиана, Q1 - нижний квартиль, Q3 - верхний квартиль. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение. Результаты биохимического исследования указывают на то, что в течение суток после введения дельтаметрина в организм экспериментальных животных в почках наблюдается накопление мочевой кислоты. Содержание данного метаболита в почках крыс 2-й группы было на 32% больше, чем в контроле (табл. 1). Это связано с тем, что дельтаметрин обладает способностью повреждать нуклеиновые кислоты [7, с. 512], запуская процессы их распада до мононуклеотидов. Кроме того, активизируется процесс острого нарушения метаболизма пуринов, описанный нами ранее, который характеризуется накоплением мочевой кислоты и активацией свободно-радикальных процессов вследствие конверсии ксантиндеги-дрогеназы в оксидазную форму [2, с. 45].
Избыточное количество активированных кислородных метаболитов, образовавшихся в
Таблица 1 - Влияние острой интоксикации дельтаметрином на содержание метаболитов в почках крыс,
Ме ^^з), п = 12
Показатель Группа Уровень значимости различий по сравнению с контролем
Контроль Острая интоксикация дельтаметрином
Мочевая кислота, нмоль/мг белка 181 (153-208) 239 (214-261) р11=0,0013
Малоновый диальдегид, нмоль/мг белка 43,3 (37,1-50,0) 79,7 (74,5-93,1) р11=0,0004
Аскорбиновая кислота, мкг/мг белка 8,23 (5,93-10,95) 5,28 (3,67-6,08) р11=0,0050
Токоферол, мкг/мг белка 2,05 (1,70-2,69) 1,43 (0,93-1,74) ри=0,0071
ксантиноксидазной реакции, инактивируется при помощи антиоксидантных ферментов. Одним из таких энзимов является супероксиддис-мутаза, превращающая супероксидный радикал в перекись водорода. В нашем исследовании отмечено повышение активности супероксид-дисмутазы в почках крыс 2-й группы на 50 % относительно контроля (табл. 2). Образующаяся в ходе супероксиддисмутазной реакции перекись водорода расщепляется каталазой, активность которой в почках крыс, подвергнутых острой интоксикации дельтаметрином, повышена на 45 % в сравнении с контролем.
Наряду со специализированными ферментами в борьбу с активированными кислородными метаболитами и продуктами свободно-радикального окисления включается неферментативное звено антиоксидантной системы почек. В нашем исследовании отмечен дефицит некоторых неферментативных антиок-сидантов - аскорбиновой кислоты и токоферола. Уровень первого метаболита в почках крыс 2-й группы снизился на 36, а второго - на 70 % по сравнению с аналогичными показателями в контроле (табл. 1). Снижение уровня аскорбата может быть связано с интенсивным вовлечением его в процессы инактивации активированных кислородных метаболитов, а также в реакции, связанные с превращением токоферилхинона в токоферол. Снижению уровня токоферола и накоплению токоферилхинона способствует уси-леная липопероксидация мембран клеток под действием активированных кислородных метаболитов, образующихся в результате острого нарушения метаболизма пуринов.
Чрезмерное образование активированных кислородных метаболитов в ходе острого нарушения метаболизма пуринов, а также дефицит неферментативных антиоксидантов ведут к повреждению мембранных структур почек и накоплению в них малонового диальдегида - промежуточного продукта перекисного окисления
липидов. Уровень данного соединения в почках крыс 2-й группы на 84 % выше, чем в контроле.
Патоморфологическая картина почек отражает глубину структурно-функциональных изменений и характеризуется наличием признаков острого химического стресса у экспериментальных животных (рис. 1 и 2). При вскрытии крыс, убитых через 24 часа после затравки, отмечали, что почки увеличены в объеме, их капсула легко снималась. На разрезе ткань почки выбухала за пределы капсулы, рисунок был сглажен, корковое вещество серо-коричневого цвета, мозговое - темно-красное.
Рисунок 1 - Вакуолизация цитоплазмы эпителиоцитов извитых канальцев почки крысы через 24 часа после острого отравления дельтаметрином в дозе 1/2 ЛД50. Окраска гематоксилином и эозином.Ув. хб00
Таблица 2 - Влияние острой интоксикации дельтаметрином на активность антиоксидантных ферментов
в почках крыс, Ме п = 12
Показатель Группа Уровень значимости различий по сравнению с контролем
Контроль Острая интоксикация дельтаметрином
Супероксиддисмутаза, Ед./мг белка 53,1 (49,0-62,1) 79,6 (64,6-93,6) р11=0,0032
Каталаза, Ед./мг белка 96,4 (84,8-104,1) 139,6 (117,9-161,3) р11=0,0017
в
47
Рисунок 2 - Гиперемия и кровоизлияния в корковом веществе почки крысы через 24 часа после острого отравления дельтаметрином в дозе 1/2 ЛД50. Окраска гематоксилином и эозином.Ув. х300
При микроскопическом исследовании почек отмечали следующие изменения. Клетки эпителия извитых канальцев несколько увеличены, набухшие, с эпизодически размытыми контурами границ, цитоплазма их мутная, зер-
нистая. Ядра некоторых эпителиоцитов пикно-тичны, хотя в отдельных клетках их диаметр увеличен по сравнению с контролем. В просвете канальцев видны фрагменты десквамирован-ных клеток, просветы канальцев сужены. При исследовании гистопрепаратов почек опытных животных в отдельных полях зрения отмечена вакуолизация цитоплазмы клеток эпителия канальцев. Некоторые сосудистые клубочки увеличены, гиперемированы, в просвете капсул нефрона содержится жидкость, иногда с примесью эритроцитов. Межканальцевые сосуды коркового вещества запустевшие. В мозговом веществе видны крупные и мелкие кровеносные сосуды, переполненные кровью. В межканаль-цевой соединительной ткани обнаружены мелкие кровоизлияния.
Таким образом, было установлено, что однократное введение дельтаметрина в дозе 43,5 мг/кг массы тела приводит к развитию в почках крыс острого нарушения метаболизма пуринов, характеризующегося накоплением мочевой кислоты, активацией свободно-радикальных процессов и возникновением выраженного дефицита аскорбиновой кислоты и токоферола, что обусловливает мембрано-токсическое действие дельтаметрина. Наряду с биохимическими признаками интоксикации отмечены патоморфологические изменения в почках, свидетельствующие о развитии дистрофических процессов и гемодинамических расстройств. В целом результаты биохимических и патоморфологических исследований подтверждают потенциальную опасность развития почечной недостаточности, что необходимо учитывать в диагностике и патогенетической терапии отравлений животных синтетическими пиретроидами.
Литература:
1. Власова С. Н., Шабунина Е. И., Пересле-гина И. А. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей // Лабораторное дело. 1990. № 8. С. 19-21.
2. Конвай В. Д. Острое нарушение метаболизма пуринов как фактор ишемического повреждения // Омский научный вестник. 2009. № 1. С. 45-48.
3. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г Метод определения активности ка-талазы // Лабораторное дело. 1988. № 1. С. 16-19.
4. Селютина С. Н., Селютин А. Ю., Паль А. И. Модификация определения концентрации ТБК-активных продуктов сыворотки крови // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. № 2. С. 8-10.
5. Сирота Т. В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45. С. 263-272.
References:
1. Vlasova S. N., Shabunina E. I., Pereslegina I. A. Aktivnost' glutationzavisimyh fermen-tov jeritrocitov pri hronicheskih zabolevanijah pecheni u detej // Laboratornoe delo. 1990. № 8. P. 19-21.
2. Conway V. D. Ostroe narushenie metaboliz-ma purinov kak faktor ishemicheskogo pov-rezhdenija // Omskij nauchnyj vestnik. 2009. № 1. P. 45-48.
3. Koroljuk M. A., Ivanova L. I., Majorova I. G. Metod opredelenija aktivnosti katalazy // Laboratornoe delo. 1988. № 1. P. 16-19.
4. Seljutina S. N., Seljutin A. Ju., Pal' A. I. Modi-fikacija opredelenija koncentracii TBK-aktivnyh produktov syvorotki krovi // Klinicheskaja labo-ratornaja diagnostika. 2000. № 2. P. 8-10.
5. Sirota T. V. Novyj podhod v issledovanii processa autookislenija adrenalina i ispol'zovanie ego dlja izmerenija aktivnosti superoksiddis-mutazy // Voprosy medicinskoj himii. 1999. T. 45. P. 263-272.
6. Desai I. D. Vitamin E analysis method for animal tissues // Meth. Enzymol. 1984. Vol. 105. P. 138-147.
6. Desai I. D. Vitamin E. Analysis method for animal tissues // Meth. Enzymol. 1984. Vol. 105. P. 138-147.
7. Hossain M. M., Richardson J. R. Mechanism of pyrethroid pesticide-induced apoptosis: role of calpain and the ER stress pathway // Toxicol. Sci. 2011. Vol. 122, № 2. P. 512525.
8. Assessment of reduced glutathione: comparison of an optimized fluorometric assay with enzymatic recycling method / T. Rousar, O. Kucera, H. Lotkova, Z. Cervinkova // Anal. Biochem. 2012. Vol. 423, № 2. P. 236-240.
9. Varley H. Determination of plasma ascorbic acid by 2,6-dichlorophenolindophenol titration method // Practical Clinical Biochemistry, 5th edition. CBS Publisher & Distributors. India, 2002. P. 927.
7. Hossain M. M., Richardson J. R. Mechanism of pyrethroid pesticide-induced apoptosis: role of calpain and the ER stress pathway // Toxicol. sciaence. 2011. Vol. 122, № 2. P. 512-525.
8. Assessment of reduced glutathione: comparison of an optimized fluorometric assay with enzymatic recycling method / T. Rousar, O. Kucera, H. Lotkova, Z. Cervinkova // Anal. Biochem. 2012. Vol. 423, № 2. P. 236-240.
9. Varley H. Determination of plasma ascorbic acid by 2,6-dichlorophenolindophenol titration method // Practical Clinical Biochemistry, 5th edition. CBS Publisher & Distributors. India, 2002. P. 927.
