CC BY
52
УДК 599.323.4+591/577.+616.37
МОРФО-Б1ОХ1М1ЧН1 ОСОБЛИВОСТ1 П1ДШЛУНКОВО1 ЗАЛОЗИ ЩУР1В ЗА УМОВ
ОКЛЮЗП ПАНКРЕАТИЧНО1 ПРОТОКИ
У робот показано, що у експериментальних щурiв при короткочаснiй та тривалш оклюзи панкреатично! протоки патолопчне депонування колагену з подальшим розвитком фiброзу органу вiдбуваeться у другому випадку, що тдтверджуеться результатами комп'ютерно! морфометри (визначення спiввiдношення ф16розио'1 тканини до загально! площi бiоптату) та бiохiмiчного аналiзу (визначення маркерiв фiброзу - палуроново! кислоти, оксипролiну бшковозв'язаного (ОПб/зв) та оксипролiну вiльного (ОПв)). Одночасно визначено числовi iнтервали бiохiмiчних коефiцieнтiв кОПб/зв/кОПв для характеристики панкреатиту в гострш та хронiчнiй стадп при тривалiй оклюзи панкреатично! протоки: при запально-некротичнш стадп гострого панкреатиту - 1,09-1,43, при атрофiчно-префiбрознiй стадп гострого панкреатиту - 1,44-1,78, при фiбрознiй стадп хрошчного панкреатиту - 1,79 i >.
Ключов! слова: панкреатит, шдшлункова залоза, оклкшя, ф1броз.
Робота е фрагментом НДР «Вивчити мехашзми розвитку фiбротичних процеав при хротчному naHKpeamumi та удосконалити технологи 'ix xiрургiчноi корекци», номер держреестраци 0111U001065.
Хрошчний панкреатит - це безперервне або рецидивуюче запальне захворювання шдшлунково! залози багатофакторно! етюлогп, що характеризуемся прогресуючими та незворотшми морфолопчними змшами. Изня стад1я хрошчного панкреатиту характеризуемся прогресуючою втратою ендокринно! та екзокринно! тканини шдшлунково! залози i замщенням !! ф1брозною тканиною [11,12,27].
Пщшлункова залоза складаеться з ендокринних та екзокринних компартментiв. Ендокриннi часточки представлен а, ß, 5, s панкреатичними клiтинами, органiзованими в острiвцi, а екзокриннi -ацинусами, протоками та центроацинарними клiтинами. Ацинарнi кттини синтезують i секретують травнi ензими, що знаходяться в багатш бшарбонатами рiдинi, яка проходить через складну мережу каналiв. Термiнальнi або штеркальоваш протоки, зливаючись, утворюють внутрiшньодольковi протоки, яю, у свою чергу, формують мiждольковi протоки, що в результат входять в головну протоку шдшлунково! залози, яка вщкриваегься в дванадцятипалу кишку, доставляючи туди панкреатичний секрет [25].
На сьогодш механiзм розвитку хрошчного панкреатиту вивчений недостатньо. 1снуе декшька теорiй, що пояснюють патофiзiологiю даного захворювання: теорiя токсичних метаболтв, теорiя оксидативного стресу, теорiя обструкцп вивiдних протокiв, теорiя некрозу-фiброзу [9]. При ускладненш вiдтоку панкреатичного секрету, шдвищенш внутрiшньопротокового тиску, штра-панкреатичному рефлюксi дуоденального вмiсту, в якому мютяться активованi ентерокiназою протеолiтичнi ензими, жовчш кислоти, лiзолецитин, емульгованi жири та бактерп, може виникати ушкодження паренхiми шдшлунково! залози безпосередньо або через каскадну активацiю панкреатичних ензишв. Цi змiни вiдбиваються на функцюнальному станi шдшлунково! залози: знижуеться обсяг секрецп, дебiт ензимiв та бшарбонапв, причому виявляються вони вже на раншх стадiях захворювання [3]. Через неконтрольовану активащю трипсину вiдбуваеться перший етзод гострого панкреатиту. Виникае як первинна (гострофазова), так i вторинна (тзня) запальна вiдповiдь. Компоненти первинно! запально! вiдповiдi (нейтрофiли, лiмфоцити та цитокши) формують протизапальний клiтинний шфшьтрат. При вториннiй фазi гострого панкреатиту активуються профiбрознi клiтини, зокрема панкреатичш зiрчастi клiтини, що призводить до розвитку фiброзу. Якщо iнiцiюючi чинники усуненш, то клiтинний та функцюнальний стан шдшлунково! залози вiдновлюеться до норми. Подальший вплив цих чинниюв призводить до продукцп цитокiнiв, як безпосередньо активують панкреатичнi зiрчастi кл^ини, внаслiдок чого накопичуеться колаген, що призводить до формування периацинарного фiброзу, а в подальшому - до розвитку хрошчного панкреатиту [9].
Дослщження на опосумах, проведет M.M. Lerch, A.K. Saluja, M. Runzi зi ствавт. (1993) показали, що обструкцп панкреатично! протоки достатньо, щоб викликати панкреонекроз та ушкодження ацинарних кттин [20]. Дана модель хрошчного панкреатиту не е загальною, з чим i пов'язана невелика кшьюсть юнуючих дослiджень, присвячених вивченню морфологiчних i
© Макарчук В.А., Шакова Г.О., Бабш ОМ., сля оклюзИ лiгатУPою, накладеною на тажр^ТИгау прОТ°ку.
Шевченко Б.Ф., Ошмянська Н.Ю., 2014
Модель лнування дае змогу дослщжувати особливост розвитку хрошчного панкреатиту, вiдслiдковувати замiщення ацинарно! тканини органу фiброзною тканиною. При хрошчному панкреатитi екзокринна функцiя тдшлунково! залози зберiгаеться протягом тривалого часу навт на пiзнiх стадiях захворювання, тому що функцiональний резерв цього органу високий i симптоми екзокринно! недостатностi виникають тiльки тодi, коли бшьше нiж 90% паренхiми залози втрачаеться. Watanabe зi спiвавт. аналопчш результати спостерiгали у мишей, коли близько 60% вщтоку панкреатичного соку було блоковано шляхом лиування протоки тдшлунково! залози [11].
Ощнка ступеню фiброзу органу традицiйно проводиться за результатами бюпсн. Але цей метод мае ряд недолшв, в тому чи^ i iнвазивний характер, помилки при виборi мiсця взяття проби, малий розмiр бiоптату, суб'ективний фактор змш, якi зумовлюють вiд 15 до 65% варiабельностi результату, ризик ускладнень [8,15]. Бiльш чутливими лабораторними предикторами можуть бути речовини, безпосередньо задiянi в процеси фiброгенезу - циркулюючi компоненти позаклiтинного матриксу, в тому чи^ гiалуронова кислота [18], показники метаболiзму сполучно! тканини -оксипролш бiлковозв'язаний та вiльний (ОПб/зв та ОПв) [1,17,19,24,26].
Метою роботи був морфолопчний аналiз панкреатобiоптатiв, визначення дiагностично! цiнностi бiохiмiчних маркерiв фiброгенезу та розробка нового методу визначення ступеню фiброзно! трансформацн тдшлунково! залози за умов запалення, що викликано короткочасною та тривалою оклюзiею панкреатично! протоки в експериментi.
Матерiал та методи дослщження. Експериментальна модель хротчного панкреатиту. Експеримент проводили на бших лабораторних щурах-самцях (вiк - 6 мюящв, 190-220 г) згiдно Закону Укра!ни № 3447-IV вiд 21.02.06 р. «Про захист тварин вщ жорстокого поводження». Для моделювання панкреатиту тваринам шд наркозом (кетамiн пдрохлорид, 110 мг/кг) здiйснювали оклюзiю панкреатично! протоки у хвостовш частинi органу [23]. В залежност вiд використано! лiгатури щури були розподiленi на двi групи: I - короткочасна оклюзiя панкреатично! протоки (розсмоктуючою лнатурою «Кетгут», 4/0) з наступним виведенням тварин з експерименту на 6 (n=6), 15 (n=6) та 30 добу (n=6); II - тривала оклюзiя панкреатично! протоки (нерозсмоктуючою лнатурою «Prolene», 5/0) з наступним виведенням тварин з експерименту на 6 (n=6), 15 (n=6) та 30 добу (n=6). Псевдооперованих тварин виводили з експерименту на 6, 15 та 30 добу шсля оперативного втручання (n=18). Достовiрних вiдмiнностей мiж цими пiдгрупами не спостерiгалося, тому за доцшьне вважали об'еднати !х в одну контрольну групу. Для подальших дослiджень використовували пiдшлункову залозу та плазму кровi тварин.
Морфолог1чний анал1з. Для проведення комп'ютерно! морфометрн, з метою оцiнки фiброзних змш тдшлунково! залози при експериментальному панкреатит^ бiоптати, отриманi iнвазивним методом, фотографували та здшснювали вимiрювання за допомогою програми ImageJ 1.45S (розроблена в «National Institutes of Health», USA). Визначення маркерiв фiброзу. Концентрацiю палуроново! кислоти в плазмi кровi оцшювали за допомогою методу Голда, особливють якого полягае в тому, що лужний розчин (рН=8,6), який використовуеться для забарвлення несульфатованого глiкозамiноглiкану, палуроново! кислоти, мютить ацетат натрiю - 0,5 М та альщан блакитний - 0,1% [16]. Рiвень бiохiмiчних маркерiв активностi пролiферативних процесiв у сполучнш тканинi визначали за вмютом в плазмi кровi оксипролiну бшковозв'язаного (ОПб/зв) та вiльного (ОПв) за методом М.А. Осадчука, який полягае в тому, що оксипролш з реактивом Ерлiха дае рожеве забарвлення [5,6].
Визначення церулоплазмгну. Концентращю церулоплазмiну в плазмi кровi щурiв визначали за модифшованим методом Равiна, що базуеться на окисненш n-фенiлендiамiну при учасп церулоплазмiну [4].
Статистичний аналгз. Статистичну обробку результатiв дослiджень здшснювали методами варiацiйно! статистики з використанням стандартного пакета прикладних програм SPSS for Windows 9.0. При цьому для показника визначали вибiркове середне значення (M) та похибку середнього (m). Дослщжуваш спiввiдношення вважали достовiрними при р<0,05. Кореляцiйний аналiз проводили за Ирсоном (для даних, виражених в iнтервальнiй шкалi) [7]. Для розрахунку числових дiапазонiв бiохiмiчних коефщенпв використовували статистичнi методи [7].
Результати дослщження та Тх обговорення. При аналiзi результатiв комп'ютерно! морфометрн комп'ютерний i^^^ фiброзу (К1Ф, сшввщношення фiброзно! тканини до загально! площi бiоптату) для контролю становив 0,50±0,07 (рис. 1), на 6 добу експерименту, пов'язаного з короткочасною оклюзiею панкреатично! протоки, К1Ф дорiвнював 1,06±0,34 (i була встановлена запально-некротична стадiя гострого панкреатиту, рис. 2А), на 15 добу - 2,00±0,69 (i була
встановлена pегенеpaтоpно-пpолiфеpaтивнa стaдiя, p^. 2В), а на 30 до6у - 5,90±1,54 (i бyлa
Рис. 1. Пiдшлyиковa залоза шypa Рис. 2. Пдшлункова залоза шypa на б (А), 15 (В) та 30 добу (C) коpоткочaсноï оклюзи
контpольиоï гpyпи. Заб. за Ma^ropi в пaикpеaтичиоï пpотоки. Заб. за Мaллоpi в модифшацл Cлiичеико. х40. мод-цд Cлiичеико. х40.
Cлiд вiдзнaчити, що на 30 добу експеpиментy KIФ в 11,8 paзiв (p<0,01) пеpевишyвaв контpольне значення, в 5,б paзи (p<0,05) - аналопчний показник для б доби i в 3,0 paзи - для 15 доби (p<0,05) коpоткочaсноï оклюзи пpотоки пiдшлyнковоï залози.
У II rpym твapин на б добу експеpиментy KIФ доpiвнювaв 1,13±0,бб (встановлена запально-некpотичнa стaдiя гостpого пaнкpеaтитy, pис. 3А), на 15 добу - 3,11±2,03 (встановлена пеpехiднa, aтpофiчно-пpефiбpознa стaдiя гостpого пaнкpеaтитy, pис. 3В), а на 30 добу - 20,79±5,12 (встановлена фiбpознa стaдiя хpонiчного пaнкpеaтитy, pис. 3C).
А в С
Рис. 3. Пщшлункова залоза шypa на б (А), 15 (В) та 30 добу (C) тpивaлоï оклюзи пaнкpеaтичноï пpотоки. Заб. за Maллоpi в модифiкaцiï Cлiичеико. х40.
Овд вiдзнaчити, шо y II rpym твapин на 30 добу експеpиментy KIФ в 41,б paзiв (p<0,01) пеpевишyвaв контpольне значення, в 18,4 paзи (p<0,01) - aнaлогiчний показник для б доби i в б,7 paзiв -для 15 доби (p<0,01) тpивaлоï оклюзи пaнкpеaтичноï пpотоки. Також KIФ y цш гpyпi шypiв пpи фiбpознiй стадп хpонiчного пaнкpеaтитy пеpевишyвaв в 3,5 paзи (p<0,05) aнaлогiчний показник I фупи твapин на стади вщновлення. Oтpимaнi дaнi пiдтвеpджyвaлися pезyльтaтaми бiохiмiчного дослiдження, пов'язаними iз визначенням в плaзмi кpовi експеpиментaльних твapин вмюту покaзникiв фiбpогенезy. Так, y кpовi твapин з коpоткочaсною оклюзiею пaнкpеaтичноï пpотоки достовipних змiн вмiстy гiaлypоновоï кислоти на всiх етапах дослщження не було зapеестpовaно (pис. 4).
У II rpym шypiв з пеpехiдною, aтpофiчно-пpефiбpозною стaдiею гостpого пaнкpеaтитy (15 доба) спостеpiгaлося достовipне зpостaння концентpaцiï гiaлypоновоï кислоти на 25,0% (p<0,05) з 1,28±0,0б мкг/мл (конфоль) до 1,88±0,11 мкг/мл. Пpи фiбpознiй стади хpонiчного пaнкpеaтитy (30 доба) збшьшення вмiстy гiaлypоновоï кислоти поpiвняно з контpолем було ше суттевшим - зpостaло на 4б,9% (p<0,001) до 1,88±0,10 мкг/мл та вже достовipно пеpевишyвaло aнaлогiчний показник y твapин з зaпaльно-некpотичною стaдiею гостpого пaнкpеaтитy на 31,5% (p<0,01, б доба) фис. 4).
Змiнa вмкту в плaзмi кpовi OПб/зв та O№ pозглядaеться як показник метaболiзмy колагену i дае важливу iнфоpмaцiю пpо бiохiмiчнi та пaтологiчнi особливост фiбpозy пiдшлyнковоï залози. Так, y щypiв I гpyпи достовipних змш в концентpaцiï даних покaзникiв не спостеpiгaлося. За посилений aнaболiзм сполучноТ тканини y шypiв iз пеpехiдною, aтpофiчно-пpефiбpозною стaдiею гостpого пaнкpеaтитy свщчило зpостaння вмiстy OПб/зв на 23,7% (p<0,01) з 1бб,б9±9,24 мкмоль/л (конфоль) до 20б,1б±13,80 мкмоль/л, а за знижений кaтaболiзм - зменшення вмкту OПв на 22,1% (p<0,05) з 9,9б±0,б0 мкмоль/л (контpоль) до 7,7б±0,50 мкмоль/л. Дaнi пpоцеси поглиблювалися iз пpогpесyвaнням пaнкpеaтитy i фiбpозною тpaнсфоpмaцiею пiдшлyнковоï залози: концентpaцiя OПб/зв на 30 добу зpостaлa на 38,5% (p<0,001) вiдносно контpолю та на 25,7% (p<0,01) поpiвняно з цим же показником на б добу, а концентpaцiя знижувалася на 30,0% (p<0,01) вiдносно контpолю та на 25,5% (p<0,05) поpiвняно з цим же показником на б добу експеpиментy фис. 5 та p^. б).
Палуронова кислота
*:: I И
Рис. 4. Динамша змши вмiсту палуроново! кислоти у кровi щурiв з короткочасною та тривалою оклюзieю панкреатично! протоки;К - контроль - псевдооперованi тварини, п=18, * - р<0,05, *** - р<0,001 - у ж^внянш з контрольною групою, п=6; •• - р<0,01 - у порiвняннi з групою тварин iз 6 добовою оклюзieю панкреатично! протоки, п=6.
Рис. 5. Динамiка змiни вмкту оксипролiну бiлково-зв'язаного у кровi щурiв з короткочасною та тривалою оклкгаею панкреатично! протоки; К - контроль - псевдоопероваш тварини, п=18, * - р<0,05, *** - р<0,001 - у порiвняннi з контрольною групою, п=6; ••-р<0,01 -у порiвняннi з групою тварин з 6 добовою оклкгаею панкреатично! протоки, п=6.
Розраховувався коефщ1ент ОПб/зв (кОПб/зв) та коефщ1ент ОПв (кОПв) 1 загальний коефщент ф1брозу кОПб/зв/кОПв, що дозволяе характеризувати прогресування ф1брозних змш в шдшлунковш залоз1 в залежносп вщ визначено! нами морфолопчно! класифшаци стадшност перебпу експериментального панкреатиту для короткочасно! та тривало! оклюзи панкреатично! протоки. У щур1в I групи на 6 добу експерименту при запально-некротичнш стадп гострого панкреатиту коефщент сшввщношення кОПб/зв/кОПв дор1внював 1,12±0,06, на 15 добу експерименту при регенераторно-прол!феративнш стадп - 1,24±0,02, на 30 добу експерименту при стадп вщновлення коефщ1ент сшввщношення кОПб/зв/кОПв дор1внював 1,46±0,13 (при встановленш норм1 1). Слщ вщзначити, що коефщент сшввщношення кОПб/зв/кОПв у груш щур1в з1 стад1ею вщновлення (30 доба) був на 30,4% (р<0,05) вищим пор1вняно з групою тварин з запально-некротичною стащею гострого панкреатиту (табл. 1).
Таблиця 1
Концентрацiя бiохiмiчних маркер1в фiброзу в плазмi кров1 експериментальних тварин та розраховаш коефiцieнти сп1вв1дношення кОПб/зв/кОПв (в чисельнику показники I групи в
Показник Контроль (п=18) 6 доба (п=6) 15 доба (п=6) 30 доба (п=6)
6 доба (п=6) 15 доба (п=6) 30 доба (п=6)
Палуронова к-та, мкг/мл 1,28±0,06 1,30±0,04 1,37±0,06 1,44±0,07
1,43±0,06 1,60±0,12* 1,88±0,10*""
ОПб/зв, мкмоль/л 166,69+9,2 177,62±10,4 183,89±11,48 192,77±11,53
183,62+7,43 206,16+13,8* 230,81+8,8***"
кОПб/зв 1 1,07±0,06 1,10±0,07 1,16±0,07
1,10±0,04 1,24±0,08 1,38±0,05"
ОПв, мкмоль/л 9,96±0,60 9,58±0,56 8,86±0,44 8,18±0,84
9,69+0,62 7,76+0,45*# 6,97+0,39**"
кОПв 1 0,96±0,06 0,89±0,04 0,82±0,08
0,97±0,06 0,78±0,05* 0,70±0,04"
кОПб/зв/ кОПв 1 1,12±0,06 1,24±0,02 1,46±0,13^
1,17±0,11 1,63±0,18* 2,03±0,18"
Примаки: * - р<0,05, ** - р<0,01 та *** - р<0,001 - достов1ршсть вщмшностей м1ж групою контролю (п=18) та дослщними групами щур1в (п=6); # - р<0,05 - достов1ршсть вщмшностей м1ж показниками на 6 та 15 добу експерименту; • - р<0,05, •• - р<0,01 - достов1ршсть вщмшностей м1ж показниками на 6 та 30 добу експерименту.
У щур1в II групи на 6 добу експерименту при запально-некротичнш стадп гострого панкреатиту коефщент сшввщношення кОПб/зв/кОПв дор1внював 1,17±0,11, на 15 добу експерименту при перехщнш, атроф!чно-преф1брозшй стадп гострого панкреатиту - 1,63±0,18, що на 39,3% (р<0,05) вище, шж у щур1в на 6 добу, на 30 добу експерименту при ф1брознш стадп хрошчного панкреатиту - 2,03±0,18 (при встановленш норм! 1). Слщ вщзначити, що коефщент сшввщношення кОПб/зв/кОПв у груш щур1в з ф1брозною стащею хрошчного панкреатиту був на 73,5% (р<0,01) вищим пор1вняно з групою тварин з запально-некротичною стащею гострого панкреатиту (табл. 1).
Отримаш сшввщношення кОПб/зв/кОПв для щур1в II групи на 6, 15 та 30 добу експерименту дозволили визначити числов1 штервали коефщ1енпв, яю при штервал1 значень 1,09-1,43 характеризують запально-некротичну стад1ю гострого панкреатиту { вщсутшсть ф1брозних змш, при 1,44-1,78 - перехщну, атроф1чно-преф1брозну ставдю гострого панкреатиту, при 1,79 ! > - ф1брозну стадда хрошчного панкреатиту.
Вщомо, що piвень цеpyлоплaзмiнy в кpовi зpоcтae пpи гоcтpих та хpонiчних запальних пpоцеcaх, в тому чиcлi i ^и пaнкpеaтитi. Так, мaкcимaльне зpоcтaння концентpaцiï цеpyлоплaзмiнy cпоcтеpiгaлоcя в I та II ipyrnx щypiв з запально-не^от^ною cтaдieю гоcтpого пaнкpеaтитy: на 40,22% (p<0,05) з 475,13±40,38 мг/мл (контpоль) до 666,23±65,40 мг/мл та на 34,4% (p<0,01) до 638,58±26,84 мг/мл вщповщно. Доcтовipно виcоким 6ув вмют даного показника i y твapин II гpyпи з пеpеxiдною, aтpофiчно-пpефiбpозною cтaдieю тpaнcфоpмaцiï пiдшлyнковоï залози - збiльшyвaвcя на 25,5% (p<0,05) до 596,24±34,81 мг/мл. Як y I, так i II Tpymx твapин на 30 до6у екcпеpиментy зниження вмicтy цеpyлоплaзмiнy у поpiвняннi з 6 добою було доcтовipне: на 24,3% (p<0,05) та на 19,1% (p<0,05) вiдповiдно для двох титв оклюзiï пaнкpеaтичноï пpотоки (pиc. 7).
Phc. 6. Динaмiкa змiни вмюту окcипpолiнy вiльного у кpовi щypiв з коpоткочacною та ^талою оклкгаею пaнкpеaтичноï пpотоки; К - консоль - пcевдоопеpовaнi твapини, n=18, * - p<0,05, ** - p<0,01 - у поpiвняннi з кошpольною гpyпою n=6; • - p<0,05 - у поpiвняннi з ^упою твapин з 6 добовою оклкгаею пaнкpеaтичноï пpотоки, n=6.
Phc. 7. Динамша змiни вмшс1у цеpyлоплaзмiнy у плазмш кpовi щypiв з коpоткочacною та тpивaлою оклюзieю пaнкpеaтичноï пpотоки; К - консоль - пcевдоопеpовaнi твapини, n=18, * - p<0,05, ** - p<0,01 - у поpiвняннi з кошpольною гpyпою, n=6; • - p<0,05 - у поpiвняннi з Ipyпою твapин з 6 добовою оклкгаею пaнкpеaтичноï пpотоки, n=6.
Бiльше деcяти pокiв тому назад стало вщомо, що накопичення активованих пaнкpеaтичниx зipчacтиx клiтин вщ^ае ключову pоль в pозвиткy фiбpозy пiдшлyнковоï залози пpи xpонiчномy пaнкpеaтитi [21]. Незалежно вiд типу пошкоджуючого фaктоpy, ефект вiд ïx активаци однаковий -нaдмipнa пpодyкцiя компонент позaклiтинного мaтpикcy. У 1998 pоцi Bachem зi cпiвaвт. впеpше пpедcтaвили опиc пaнкpеaтичниx зipчacтиx клiтин шдшлунково1' залози. Вони pозтaшовaнi в пеpиaцинapнiй, пеpивacкyляpнiй i пеpидyктaльнiй чacтинi оpгaнy. Цi клiтини у cтaнi стокою та aктивовaнi вiдpiзняютьcя за cвоïми моpфологiчними xapaктеpиcтикaми, молекyляpними мapкеpaми та властивостями. Для активованих пaнкpеaтичниx зipчacтиx клiтин влacтиве збiльшене ядpо та в^ута^ть жиpовиx кpaпель [22]. Вони екcпpеcyють пpомiжнi фiлaменти, що xapaктеpизyють декiлькa типiв клiтин - деcмiн, який влacтивий мiоцитaм; глiaльний фiбpиляpний киcлий пpотеïн, що xapaктеpизye acтpоцити; неcтiн, що xapaктеpний для нейpоепiтелiaльниx cтовбypовиx клiтин. Гладком'язовий актин а - е мapкеpом для виявлення пaнкpеaтичниx зipчacтиx клiтин у дшянках фiбpозy в пiдшлyнковiй зaлозi, як у щypiв, так i у людини [9]. Вплив фaктоpiв, що ^овокують pозвиток xpонiчного пaнкpеaтитy, ^изводить до ушкодження aцинapниx клiтин, ^отошв та ендотелiaльниx клiтин i збшьшено1' пpодyкцiï лейкоцитiв. Ушкодженi клiтини тдшлунково1' залози здaтнi пpодyкyвaти та вившьняти багато цитокiнiв, фaктоpiв pоcтy, ангютензин II i ендотелiн 1, як активують пaнкpеaтичнi зipчacтi клiтини. В pезyльтaтi цього генеpyютьcя pечовини, яю можуть пpизводити до поcтiйноï активаци даних кттин. Активовaнi пaнкpеaтичнi зipчacтi клiтини можуть бути елiмiновaнi шляхом апоптозу, що було пpодемонcтpовaно в до^дах in vivo, або бути повеpненi в cтaн cпокою, що cпоcтеpiгaeтьcя лише на клiтинниx кyльтypax. Стiйкa aктивaцiя зipчacтиx клiтин, з шшого боку, пpизводить до пpогpеcyючого фiбpозy [22]. Фiбpоз пiдшлyнковоï залози - xapaRrepra ознака xpонiчного пaнкpеaтитy [21].
Екcтpaцелюляpний мaтpикc cклaдaeтьcя iз piзномaнiтниx компонентiв, якi пpиймaють участь у пiдтpимцi ноpмaльноï apxiтектонiки тканини залози та вщ^ають важливу pоль в бiологiчниx фyнкцiяx оpгaнiв [14]. Синтез, ^^ещя та дегpaдaцiя компонент позaклiтинного мaтpикcy динaмiчно змiнюютьcя в ^оцеш тканинного pемоделювaння. В оcновi фiбpозy оpгaнy лежить диcбaлaнc мiж cинтезом надлишку компонентiв позaклiтинного мaтpикcy клiтинaми-пpодyцентaми та зниженою дегpaдaцieю ^отешв позaклiтинного мaтpикcy цинк-залежними ензимами pодини мaтpикcниx метaлопpотеïнaз. Поpyшення бaлaнcy е^^ей мiж метaлопpотеïнaзaми та ïx тканинними iнгiбiтоpaми вiдбyвaeтьcя пpи xpонiчниx запальних пpоцеcax. npH xpонiчномy пaнкpеaтитi тдвищення пpодyкцiï тканинного iнгiбiтоpy метaлопpотеïнaзи-1 пaнкpеaтичними
з1рчастими кштинами сприяе ф1брозу шляхом запобпання деградаци колагену, тому його експрешя виявляеться обмежено в д1лянках наивного ф1брозу [10].
У поставленому нами експеримеип, суть якого полягала у здшсненш короткочасно! та тривало! оклюзи панкреатично! протоки, ф1брозна ставдя хрошчного панкреатиту у щур1в визначалася лише у другому випадку, що тдтверджувалося морфолопчними та бюим!чними дослщженнями. Це можна пояснити розсмоктуванням лпатури, накладено! на панкреатичну протоку, в перюд м1ж 6 та 10 добою експерименту, пов'язаного !з короткочасною оклюз1ею протоки шдшлунково! залози. I, таким чином, вщновлення прохщносп панкреатично! протоки сприяло усуненню або зниженню ступеню вираженосп патолопчних змш в шдшлунковш залоз!, регенераци панкреаципв та пщвищенш !х активност [3]. Достов1рне зростання КIФ у I та II груш щур1в спостерпалося на 30 добу експерименту в 11,8 раз1в (р<0,01) та в 41,6 раз1в (р<0,01) вщповщно. В свою чергу, даний показник при тривалш оклюзи панкреатично! протоки в 3,5 рази (р<0,05) перевищував аналопчний показник при короткочаснш оклюзи, що встановлюе значну ф1брозну трансформащю шдшлунково! залози саме у випадку тривало! оклюзи, а не при стадп вщновлення.
Зростання концентраци палуроново! кислоти в плазм! кров! обумовлене збшьшенням !! продукцп з!рчастими кл!тинами та порушенням деградаци палуронщазами через зменшення !х активносп [13,15].
Таким чином, можна припустити, що !з розвитком хрон!чного панкреатиту вщбуваеться дисбаланс в систем! «палуронова кислота - палуронщаза» в бш зб!льшення синтезу цього гл!козам!ногл!кана. Отже, палуронова кислота - це нешвазивний маркер ф!брозу, поява якого в плазм! кров! може мати важливе значення при ощнщ стад!! ф!брозу органу, в тому числ! ! п!дшлунково! залози. Наше досл!дження щур!в з короткочасною ! тривалою оклюз!ею панкреатично! протоки, п!дтвердило важлив!сть ощнки концентрац!! г!алуроново! кислоти в плазм! кров! для д!агностики ф!брозно! стад!! хрошчного панкреатиту. Ф!броз органу у експериментальних тварин дав змогу отримати краще уявлення про сшввщношення «палуронова кислота-ф!броз». При запально-некротичн!й стад!! гострого панкреатиту достов!рних зм!н концентрац!! даного показника пор!вняно з контролем не спостерпалося; при перех!дн!й, атроф!чно-преф!брознш стад!! трансформац!! п!дшлунково! залози визначалася концентращя г!алуроново! кислоти, що на 25,0% (р<0,05) перевищувала контрольний показник; при ф!брознш стад!! перебудови шдшлунково! залози, визначалася концентрац!я г!алуроново! кислоти, що на 46,9% (р<0,05) перевищувала контрольне значення. Достов!рних зм!н вмюту даного показника у кров! щур!в з короткочасною оклюз!ею панкреатично! протоки не визначалося, що також пов'язано з вщновленням кл!тинного та функцюнального стану п!дшлунково! залози п!сля розсмоктування лпатури.
Незважаючи на те, що метабол!зм сполучно! тканини широко вивчався, проте все ж !снуе недостатньо шформацп про в!дхилення та змши бюим!чних параметр!в ф!брозно! трансформац!! шдшлунково! залози при розвитку хрошчного панкреатиту. Ще один нешвазивний метод ощнки ф!брозу тканини - це визначення концентрац!! ОПб/зв та ОПв в плазм! кров!. Дослщження змш р!вня цих показник!в дае ц!нну шформащю про б!ох!м!чн! та патолог!чн! процеси ф!брозу в п!дшлунков!й залоз!. Пщвищення р!вня ОПб/зв св!дчить про посилений синтез, утворення молодого незр!лого колагену. ОПв - показник деградаци колагену [1,17,19, 24,26].
Результати дослщжень продукпв метабол!зму колагену дозволили встановити, що вмют ОПб/зв та ОПв в плазм! кров! щур!в достов!рно не змшювався протягом всього експерименту, пов'язаного з короткочасною оклюз!ею панкреатично! протоки. Отримаш дан!, а саме: тенденщя до п!двищення вм!сту ОПб/зв та зниження вм!сту ОПв, св!дчили про незначне колагеноутворення в п!дшлунков!й залоз! тварин дано! групи, яке супроводжувалося зниженою його деградащею.
Анал!з вмюту фракцш оксипрол!ну в плазм! кров! тварин з установленою атроф!чно-преф!брозною стад!ею трансформац!! п!дшлунково! залози при тривалш оклюзи панкреатично! протоки, показав пор!вняно з контролем статистично значуще шдвищення вм!сту ОПб/зв на 23,7% (р<0,01) ! зниження ОПв на 22,1% (р<0,05), що св!дчило про посилення ф!брогенезу та зменшення деградаци колагену в ураженому орган!. Максимальне п!двищення концентрац!! ОПб/зв на 38,5% (р<0,001) ! зниження вм!сту ОПв на 30,0% (р<0,01) на 30 добу експерименту означало, що на стад!! хрошзацп панкреатиту превалюють процеси активного коллагеноутворення над його деградащею.
В розвитку запального процесу або в попередженш його можливих ускладнень приймае участь близько 30 бшюв кров!, що мають загальну назву «гострофазш б!лки», до яких належить ! церулоплазм!н. Церулоплазм!н - це мщьвмюний а2-гл!попроте!н, який синтезуеться гепатоцитами та еп!тел!оцитами легень. При гострофазнш в!дпов!д! важливим джерелом церулоплазм!ну е моноцити.
Вш транспортуе мщь мщьвмюним ензимам в плаз1Ш кров^ володie антиоксидазною активнiстю, попереджуе окиснення лiпiдiв в мембраш кл^ин. Церулоплазмiн проявляе непрямий антимiкробний ефект. Вш входить в групу так званих шзшх реактантiв гостро! фази з помiрним ступенем збiльшення концентрацн при запаленнi, що вiдображае компенсаторно-пристосувальну реакцiю органiзму [2]. В результат нашого дослiдження було встановлено, що у щурiв як при короткочаснш, так i при тривалш оклюзп панкреатично! протоки рiвень церулоплазмшу на 6 добу експерименту достовiрно пiдвищувався на 40,2% (р<0,05) та на 34,4% (р<0,01) вiдповiдно. У II груш тварин достовiрно високою концентрацiя церулоплазмiну залишалася i на 15 добу при перехщнш, атрофiчно-префiбрознiй стадн гострого панкреатиту на 25,5% (р<0,05). А вже на 30 добу дослщження спостерiгалося достовiрне зниження вмiсту даного показника на 24,3% (р<0,05) та на 19,1% (р<0,05) вiдповiдно для короткочасно! та тривало! оклюзп панкреатично! протоки вiдносно груп щурiв з запально-некротичною стадiею гострого панкреатиту.
Таким чином, отримаш результати бiохiмiчного дослiдження стану сполучно! тканини та запальних процесiв в шдшлунковш залозi щурiв II групи на 6 добу експерименту характеризують запально-некротичну стадiю гострого панкреатиту та свщчать про вiдсутнiсть фiброзних змiн органу, на 15 добу експерименту характеризують перехвдну, атрофiчно-префiброзну стадiю трансформацп пiдшлунково! залози, на 30 добу експерименту - фiброзну стадда перебудови пiдшлунково! залози.
1. Результати комп'ютерно! морфометрii панкреатобюшапв показали, що при короткочаснiй оклюзп панкреатично! протоки розсмоктуючою лiгатурою вщбуваеться вiдновлення !! прохiдностi та зниження ступеню вираженостi патологiчних змiн в шдшлунковш залозi вже до кшця другого тижня пiсля оперативного втручання, а до кiнця четвертого тижня експерименту у зразках iз дослщжуваного органу вiдзначалися лише периваскулярнi та перидуктальш залишки фiброзноi тканини. При тривалш оклюзп панкреатично! протоки нерозсмоктуючою лiгатурою спостерiгаeться протягом експерименту поступове патолопчне депонування колагену з подальшим розвитком фiброзу пiдшлунковоi залози щурiв.
2. Неiнвазивний метод дiагностики ступеню колагеноутворення в пiдшлунковiй залозi щурiв при короткочаснiй та тривалiй оклюзп панкреатично! протоки, який заключався визначенням в плазмi кровi концентрацii палуроново! кислоти, оксипролiну бiлковозв'язаного та вшьного, пiдтвердив фiброзування ураженого органу лише у тварин з тривалою оклюзieю панкреатично! протоки, що повнiстю сшвпадае з результатами морфологiчного дослiдження. Отримаш штервали спiввiдношення кОПб/зв/кОПв для щурiв II групи на 6, 15 та 30 добу експерименту дозволяють характеризувати запально-некротичну стадда гострого панкреатиту, атрофiчно-префiброзну стадда гострого панкреатиту та фiброзну стадда хрошчного панкреатиту. Встановлене шдвищення вмiсту церулоплазмiну в плазмi кровi щурiв обох дослiдних груп вщображае активнiсть запального процесу в шдшлунковш залоз^ найбiльш вираженого на стадн гострого панкреатиту.
Перспективи подальших до^джень. В подальшому плануетъся дождження впливу хротчного панкреатиту, викликаного тривалою оклюзieю панкреатичноI протоки, на розподш нейроспецифiчних проте'Шв в тдшлунковш залозi та головному мозку щурiв за умов ендогенноI ттоксикаци.
1. Белобородова Е. В. Активность эластазо-, коллагеназоподобных протеиназ и их ингибиторов в плазме крови при метаболизме коллагена в условиях хронического течения заболеваний печени вирусной и токсической этиологии / Е.В. Белобородова, Э.И. Белобородова, О.Е. Акбашева [и др.] //Бюллетень СО РАМН. - 2010.- Т. 30, № 2. - С. 94-100.
2. Воробьёва А.А. Острофазные белки лактоферрин и церулоплазмин при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки / А.А. Воробьёва, А.А. Демидов // Вестник ВолГМУ. - 2007. - Т. 23, №3. - С. 62-64.
3. Звягинцева Т.Д. Дисфункция сфинктера Одди и хронический панкреатит / Т.Д. Звягинцева, И.И. Шаргород // Сучасна гастроентеролопя. - 2013. - Т. 71, № 3. - С. 75-82.
4. Камышников В.С. Методы клинических лабораторных исследований / В.С. Камышников. Изд. 4-е. - М.: «Медпресс-информ», - 2011. - 752 с.
5. Осадчук М.А. Метод1 исследования оксипролина в крови и моче / М.А. Осадчук // Лаб. дело. - 1979. - №8. - С. 456-458.
6. Осадчук М.А. Белковосвязанный оксипролин плазмы крови при остром вирусном гепатите / М.А. Осадчук, В.М. Капустин // Лаб. дело. - 1987. - №7. - С. 16-18.
7. Петри А. Наглядная статистика в медицине / А. Петри, К. Сэбин // - М.: Гэотар-Мед, - 2003. - 144 с.
8. Пентюк Н.О. Б1ох1м1чн1 маркери ф1брозу печшки у хворих на хрошчш гепатити та !хня д1агностична цшшсть / Н.О. Пентюк // Сучасна гастроентеролопя. - 2011. - T. 57, № 1. - C. 58-63.
9. С1ренко О.Ю. Панкреатичш з1рчаст1 кл1тини як морфолопчна основа розвитку ф1брозу тдшлунково! залози / О.Ю. С1ренко // Морфолопя. - 2010. - Т. 4, № 1. - С. 5-12.
10. Туманський В.О. lMyHoricToxiMi4Hi особливост експресп матриксно! металопроте'шази 9 та ii тканинного iHri6iTopa Т1МР-1 при хронiчному фiброзно-iндуративному панкреатитi / В.О. Туманський, 1.С. Коваленко // Патологiя. - 2012. - T. 24, №1. - C. 74 - 76.
11. Aghdassi A.A. Animal models for investigating chronic pancreatitis / A.A Aghdassi, J. Mayerle, S. Christochowitz and [et al.] // Fibrogenesis & Tissue Repair. - 2011. - 4: 26.
12. Bhanot U.K. Mechanisms of parenchymal injury and signaling pathways in ectatic ducts of chronic pancreatitis: implications for pancreatic carcinogenesis / U.K. Bhanot and P. Moller // Laboratory Investigation. - 2009. - Vol. 89. - P. 489-497.
13. Duterme C. Two Novel Functions of Hyaluronidase-2 (Hyal2) Are Formation of the Glycocalyx and Control of CD44-ERM Interactions / C. Duterme, J. Mertens-Strijthagen, M. Tammi [et al.] // The journal of biological chemistry. - 2009. - Vol. 284, № 48. - Р. 33495-33508.
14. Divoux A Architecture and the extracellular matrix: the still unappreciated components of the adipose tissue / A. Divoux and K. Clement // Etiology and Pathophysiology. - 2011. - Vol. 12. - P. 494-503.
15. El-Shabrawi M. Predictive accuracy of serum hyaluronic acid as a non-invasive marker of fibrosis in a cohort of multi-transfused Egyptian children with b-thalassaemia major / M. El-Shabrawi, M.Y. Zein El Abedin, N. Omar and [et al.] // Arab Journal of Gastroenterology. - 2012. - Vol. 13. - P. 45-48.
16. Gold E.W. The quantitative spectrophotometric estimation of total sulfated glycosaminoglican levels / E.W. Gold // Biochemica et Biophysica Acta. - 1981. - Vol. 673. - P. 408-415.
17. George J. Biochemical Abnormalities during the Progression of Hepatic Fibrosis Induced by Dimethylnitrosamine / J. George аnd G. Chandrakasan // Clinical Biochemistry. - 2000. - Vol. 33, № 7. - Р. 563-570.
18. Grippo P. J. Imaging the pancreatic ECM. Pancreatic Cancer and Tumor Microenvironment / Edited by P.J. Grippo and H.G. Munshi // - India: Transworld Research Network Kerala, - 2012. - P. 11-27.
19. Kliment C. R. A novel method for accurate collagen and biochemical assessment of pulmonary tissue utilizing one animal / C.R. Kliment, J.M. Englert, L.P. Crum [et al.] // Int J Clin Exp Pathol. - 2011. - Vol. 4, №4. - Р. 349-355.
20. Lerch M.M. Models of Acute and Chronic Pancreatitis / M.M. Lerch, F.S. Gorelick // Gastroenterology. - 2013. - Vol. 144. - P. 1180-1193.
21. Masamune A. Roles of Pancreatic Stellate Cells in Pancreatic Inflammation and Fibrosis / A. Masamune, T. Watanabe, K. Kikuta [et al.] // Clinical gastroenterology and hepatology. - 2009. - Vol. 7. - P. 48-54.
22. Madro A. Can we expect progress in the treatment of fibrosis in the course of chronic pancreatitis? / A. MadroSlomka, K. Celinski // Advances in Medical Sciences. - 2011. - Vol. 56. - P. 132-137.
23. Page B.J. An Immunocytochemical Profile of the Endocrine Pancreas Using an Occlusive Duct Ligation Model / B.J. Page, D.F. Toit, C. Muller [et al.] // Journal of the Pancreas. - 2000. - Vol. 4, 1. - Р. 191-203.
24. Pavlidis E.T. The effect of bevacizumab on colon anastomotic healing in rats / E.T. Pavlidis, K.D. Balla, N.G. Symeonidis [et al.] // Int J Colorectal Dis. - 2010. - Vol. 25. - P. 1465-1473.
25. Reichert M. Pancreatic ductal cells in development, regeneration, and neoplasia / M. Reichert, A.K. Rustgi // The Journal of Clinical Investigation. - 2011. - Vol. 121,12. - P.4572-4578.
26. Sabaa. Ellagic acid attenuates bleomycin and cyclophosphamide-induced pulmonary toxicity in Wistar rats / Sabaa, S. Khana, S. Parvez [et al.] // Food and Chemical Toxicology. - 2013. - Vol. 58. - P. 210-219.
27. Ulmasov B. Differences in the Degree of Cerulein-Induced Chronic Pancreatitis in C57BL/6 Mouse Substrains Lead to New Insights in Identification of Potential Risk Factors in the Development of Chronic Pancreatitis / B. Ulmasov, K. Oshima, M.G. Rodriguez [et al.] // The American Journal of Pathology. - 2012. Vol. 183, 3. - P. 692-708.
МОРФО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС В УСЛОВИЯХ ОККЛЮЗИИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ПРОТОКА Макарчук В.А., Ушакова Г.А., Бабий А.М., Шевченко Б.Ф., Ошмянская Н.Ю.
В работе показано, что у экспериментальных крыс при кратковременной и длительной окклюзии панкреатического протока патологическое депонирование коллагена с последующим развитием фиброза органа происходит во втором случае, что подтверждается результатами компьютерной морфометрии (определение соотношения фиброзной ткани к общей площади биоптата) и биохимического анализа (определение маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты, оксипролина белковосвязанного (ОПб/св) и оксипролина свободного (ОПсв)). Одновременно определены числовые интервалы биохимических коэффициентов кОПб/св/кОПсв для характеристики панкреатита в острой и хронической стадии при длительной окклюзии панкреатического протока: при воспалительно-некротической стадии острого панкреатита - 1,09-1,43, при атрофически-префиброзной стадии острого панкреатита - 1,44-1,78, при фиброзной стадии хронического панкреатита - 1,79 и более.
Ключевые слова: панкреатит, поджелудочная железа, окклюзия, фиброз.
Стаття надшшла 8.01.2014 р.
MORPHO-BIOCHEMICAL FEATURES OF THE RAT's PANCREAS UNDER CONDITIONS OF
PANCREATIC DUCT OCCLUSION Makarchuk V.A., Ushakova G.A., Babiy A.M., Shevchenko B.F., Oshmyanskaya N.Y. We prepared 2 experimental groups: rats with short-term (group 1) and prolonged (group 2) occlusion of the pancreatic duct. Abnormal deposition of collagen with subsequent development of fibrosis in pancreas occurs in group 2, as confirmed by morphometry (ratio of fibrous tissue to the total biopsy area) and biochemical analysis (determination of fibrosis markers - hyaluronic acid, protein-bonded hydroxyproline and free hydroxyproline). Furthermore, present study defines numerical intervals of biochemical coefficients "coefficient protein-bonded hydroxyproline / coefficient free hydroxyproline", which characteristically present in acute and chronic stages pancreatitis after prolonged pancreatic duct occlusion: inflammatory-necrotic stage of acute pancreatitis - 1,091,43; atrophic-profibrotic stage of acute pancreatitis - 1.441.78; fibrotic stage of chronic pancreatitis - 1.79 and more.
Key words: pancreatitis, pancreas, occlusion,
fibrosis.
Pe^roeHT TacroK A.n.
