CC BY
52
Мтици искан иммуншіигин іт Т. 1, № 1 - 2, С. 47 - 58 ©1999, СПб РО РАЛКИ
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА НА ОСНОВЕ РЕПЕРТУАРА ИММУННОГО ОТВЕТА МЫШЕЙ ЛИНИИ 8ЛД1
Климович В.Б., Самойлович М.П., Грязева И.В., Крутецкая И.Ю., Пашкова С.Ф., Руденко И.Я.
Центральный научно-исследовательский рентгена-радиологический институт М3 РФ,
Санкт-Петербург
Стандартная техника создания гибридом-проду-шнтш моноклональных антител (МКАТ) основана І1.І применении культивируемых клеточных ЛИНИЙ, ііродсходящихот миелом мышей линии ВАІ.В/с 120, 301. Донорами иммунных лимфоцит ов при этом слу ■ л.п животные той же лпннн. Это обеспечивает го-мизшотаосгь получаемых гибридом и возможность идшфонапия их в виде асцитических опухолей па адОях того же генотипа. Преимущества этой схемы очишщны, однако она не компенсируют свойствен-тллеп недостатков.
Основной Щ них обусловлен тем, что иммунный '>П'П формируется преимущественно против иммупо-димиганїнш эпитонов п в своем развитии стрем т ої и пи]хладению в олигоклоначьвый [28]. В результате 0(.т создании гибридом как правило получают МКАТ против ограниченного числа эпитопов. Кроме того, рели]ггуар иммунного ответ а животных любой инбрсд-нмй лиши рсстршсгнрован генетически [37]. Это до-ишштт-льш сужает разносйразі іе получаемых М КАТ.
Лфес для переписки:
Кчимтшч Владимир Борисович -
: « , профессор, руководитель лаборатории
'^фодолшой технологии
Ц< і'Тірашіого научно-исследовательского
^ттп'радио.штвского института М3 РФ,
(шт-Петербург, Песочный-2, р Ънишрпдсках, 70/4,
Ч--нтрашый научно -исслвдоаател ьский " '.иіЛ'ьч-раоиолошчрский институт М3 РФ, лК'араіщмя гибридомной технологии, ки (81? >437-85-48 Фтг (612) 437-87-87 V-ті!- МщІ&таи.Ііпе.ги ----------------------------------------
В результате репертуар эпитопов, доступных дня изучения с помощью МКАТ, полученных на основе лимфоцитов мышей ВАТВ/с, оказывается искусственно ограниченным и далеко не исчерпывает разнообразия детерминант, присущих любому антигену. Наконец, третий недостат ок состой г В ТОМ, ЧТО ЖИЗ11 е.С1 юсобиость мышей ВА1-В/с невысока и потому их эффективность в качестве носителей гибридом и продуцетов асци гов оставляет желать большего.
Учитывая сказанное, представлялось целесообразным использовать при создании гибридом в качестве допоров иммунных лимфоцитов линейных жп вотных с иным репертуаром иммунного ответа, а для пассирования гибридом использовать меж лилейных гибридов, более жизнеспособных в силу эффекта гетерозиса.
При выборе линии мышей, альтернативной ВАТВ/с, были приняты во внимание следующие предпосылки.
1. Вероятнее всего, существенные отличия в репертуаре синтезируемых антител будут иметь животные, несущие иной, чем линия ВАТВ/с.комплекс антигенов гистосовместимости.
2. Линейные мыши-альбиносы более склонны к формированию и накоплению асептических асцитов и потому более полезны как носители гибридом []4]. Поэтому представлялось целесообразным ограничить выбор животными альбинос)шх линии,
3. Наконец, следовало учитывать, что мыши ВАТВ/с в отличие от многих других инбредных .ти-иип, генетически предрасположены к образованию и поддержанию роста миелом, продуцирующих гомогенные иммуноглобулины (1$) [34]. Это качество существенно облегчает пассирование гибридом, перевод их в форму асцитических опухолей и приготовление
моноклональных реаг&нгов Сходство пи этому признаку было важно учитывать при выборе животных альтернативной лпнии.
Таким образом. представлялось желательным, чтобы животные альтернативной липни пи ряду фенотипических признаков были сходны с BALB/c, по отличались бы от них репертуаром иммунного ответа.
Опенка мышей доступных иибредных штаммов с. унтом перечисленных критериев заставила обратить внимание на животных линии SJL/J, которые ранее использовались для создания гибридам лишь при решении узкоспециальных задач [33. 35].
Мыши линий SJL/J были введены в лабораторную практику как носители заболевания, сходного с лимфогранулематозом человека [31,15,24 J. Возникающие у них спонтанно опухоли сначала называли ретикуло-клеточпыми саркомами, ио позднее было установлено, что они относятся к В-клеточным лимфомам [39]. Мыши SJ L/J несут комлекс антигенов гиегрсовмесхи-мости 112'и синтезируют IgG алдотипа Igh1'. п то время как соответствующие аллош гшгены ВАГВ/с относятся к Н2‘* и Ighd 19. 191. Опубликованы данные о высоком уровне иммунного ответа мышеи SJL/J на иероксодазу из корней хрена (ПХ) [23J и об их чувствительности к индукции аутоиммунных заболева-гшй: тцреоидита 112[ и энцефаломиелита [ И [.
Для мышей линии SJL/J характерен ряд признаков аномально повышенной активности В-клеточно-П) звена иммунной системы, среди которых необходимо отметить следующие.
1. Инфильтрация ткани тимуса В-лимфоцитами [10[.
2. Плазматизация лимфоидных органов (8, 18J и сопутствующая развитию лимфом клональная пролиферация плазматически! клеток, продуцирующих гомогенные Ig [29, 431, что можно поставить в параллель с генетической предрасположенностью мы шей BALB/c к индукции плазмацитом [34J.
3. Синтез поли специфических аутоантител. реагирующих с ДНК, тиреоглобулииом (ТГ) н други ми аутоап шгенами [16,35].
4. Преимущественный синтез IgG после иммунизации, вызывающей у животных других линий синтез IgE [26].
5. Устойчивость к индукции неотвечаемостм к IgG человека и кролика [21 ]
Перечисленные данные позволили предположить, что в организме мышей SJL/J ослаблены ограничения экспансии клонов В-лимфоцитов и потому репертуар вырабатываемых ими антител может быть шире. В то же время некоторое сходство этих животных с линией BALB/c давало повод ожидать, что склонность последних к формированию асцитов и поддержанию роста плазмацитом не будет ослаблена генотипом SJ L/J, и это позволит использовать межлипейных гибридов Fj(SJL/JxBALB/c) в качестве носителей гнбридомньтх асцитов.
В настоящей публикации суммирован опыт получения на основе иммунных лимфоцитов мышей линии SJL/J гибридомных штаммов, продуцирующих МКАТ против ПХ, полппентидиых пеней Ig человека и против ТГ человека.
Материалы и методы исследования
Антигенами для иммунизации животных искрн-нинга гибридом служили:
1) коммерческий препарат ПХ с RZ = 0,3 фирмы Reanal;
2) белки Бенс-Джонса каппа- и лямбда-типов, изолированные из мочи пациентов, страдающих множественной миеломой;
3) Ig человека, выделенные из сывороток здоровых доноров и пациентов с миожестветюй миеломой или макроглобулинемией;
4) препарат ТГ из ткани щитовидной железы человека. очищенный с помощью гель-хроматографин
Использовали также коммерческие препараты ПХ фирм Sigma. Serva, Biolar (Олайне), Ig человека фирмы Calbiochem, ТГ быка и свиньи фирмы Sigma. Рефереис-образцамн при нссдедовапии энитопной специфичности служили препараты МКАТ, выпускаемые фирмой Sigma, а также полученные из л;юо-раторий Университетов Берна (проф. А. Де Век) п Бирмингема (проф. Р. Джефферис).
Мыши линий SJL/J и BALB/c происходили из колоний, которые поддерживаются в виварии института путем братско-сестринского скрещивания с одновременным отбором на плодовитость. Разведение межлипейных гибридов (Sj L/JxBALB/c)F, также осуществляли в виварии института.
В большинстве ОПЫТОВ ЖИВОТНЫХ ИММутшЗИрОВаЛИ путем введения первой дозы антигена (10 - 200 мкг), змуды’ированного в полном адъюванте Фрейнда, подкожно или внутрябрюшинно. Спустя 7 дней такое же количество антигена вводили в неполном адъюванте Фрейнда. На 12.14 и 16-й дни после первой инъекции 1(1 50 мкг антигена вводили виутрибрюшинпо в 0.5
мл физиологического раствора, В течение 15-го дня пробы сыворотки крови исследовали на содержание ангител искомой специфичности. Если титр антител составлял 1/2 ООО - 1/5 000, на 17-й день от мышей получали клетки селезенки и использовали их для гиб-рйдшации В случае низкого уровня ;и |тнтел iцткл пм-мунизаиии повторяли 1 или 2 раза с интервалом 3 6
педель. При получении МКАТ против слабоиммуно генных эпитопов Ig человека в ряде случаев использовали приемы подавления ответа па иммунодомпнант-пые эпитопы путем создания у иммунизируемых животных пассивного иммунитета с помошъю пнъек-цшм1 нолик зональных антител пли МКАТ е уже установленной эпитолной специфичностью [27].
Для выявления культур, содержащих гибридные клетки -продуценты МКАТ против ПХ. был применен
тест, осиовашшй на способности белка Л золотист ого стафилококка Cowan f спяаьшать Ig. не нарушая ик антиген -связывающей активности [25] В исследуемые пробы вносили раст вор Г1Х и после иикуба-цип D течение I часа при 37 °С добавляли взвесь клеток стафилококка («Стафилококковый реагент, содержащий белок А», НИИЭМ им. J1. Пастера), инкубировали I час и отмывали от несвязавшихся компонентов центрифугированием. Затем к осадку бактериальных клеток добавляли субстрат-хромо-,генную смесь, состоящую из перекиси водорода id.lM %) н орю-феиилендинмина (0,1 %)в0,1 М цитратом буфере срН - 4,5. Интенсивность развивающейся окраски оценивали визуально или (после переноса аликвот в плоскодонные планшеты) фотометрически на анализаторе «Мультискан» при длине волны 450 нм |3]. Очистку МКАТ осуществляли с помощью аффинной хроматографии на белок А-п-фарозе (Pharmacia). Для изучения параметров шшывання МКАТ и их специфичности в отношении изоферменгов ПХ препарат фирмы Reaual смешивали с очищенными МКАТ в количествах, обеспечивающих молярные отношения аппггело/аитиген >л 1/40 до 2/1, и после инкубашш из смеси удаляли ІІІПІП'ЄЛГі и иммунные комплексы с помощью белок Л-сефарозы,Затем пробы подвергали изоэлектричес-кчму фокусированию па пластинах полиакриламид-шпигеля «Servalyt-Precotes3-Ю» по инструкции из-гтоаитедл (Serva). Разделенные в геле изоферменты ішявлялії с помощью смеси перекиси водорода (О, (И Щ п 3,3-дмамшюбензидина (0,1 %).
Д ія скрининга гибридом-продуцентов МКАТ npotflu полипептидиых цепей lg и против ТҐисноль* ЗАВЙли непрямой вариант твердофазного иммуно-фгушп иного анализа (ИФА) с антигенами, иммо-Гт пиованныыи в лунках планшетов (Costar, Flow, Nunc нлй Labsystems). Выявляющими реагентами І служили конъюгаты 1IX со стафилококковым белком \ (щюиаиояство НИИЭМ і гм. Л. Пастера) или с при-пнпатешшми в лаборатории аффиино очишенны-
іфолНчьпми антителами против Ig мыши [51.
Лля изучения у пито п ной специфичности МКАТ | исполкйвали конкурентный вариант твераофазно-j ш ИФА, при котором оценивали влияние немече-1 лих МКАТ па связывание с антигеном меченых ПХ ЙЩТ, направленных против того же антигена [7J. и М<Мс*шг н немеченые МКАТ смешивали и вносили Ы1 планшеты с адсорбированными антигенами. Пос-їг 'шкубзщт н отмывания связанную с твердой фа-ЗДІ1 мтшкость пероксидазы выявляли с помошыо VVBCTpUT хромогенной смеси, содержащей о-фепи-ШДіШЯин и перекись водорода. Интенсивность раз-B'Bilfrrtea окраски определяли па планшетном фо-’"Метре при длине волны 450 им. Оптическую плог-hiiitu проб, не содержавших немеченых шиадпрушщих МКАТ, принимали за 100 %. Ин-ПіГ/ітрошшие связывания на 60 % и более считали
полным, на 30 60 % —• частичным, менее чем на
30 % — недостоверным.
МКАТ против ПХ
Сравнение уровней сывороточных антител у им муниэированных ПХ мышей трех линий показало, что наиболее сильно на этот антиген отвечали особи 5_| [_/] одна из которых и послужила донором лимфоцитов для гибридизации. При пер в и1 том скри нише было выявлено 17 культур, синтезирующих МКАТ искомой специфичности. Все они были подвергнуты клонированию. По мере нарастания числа [Снеток в части клонированных культур происходило паление интенсивности серологической реакции, что было расценено как проявление либо нестабшп, ноет я гибридом, либо выработки ими МКАТ, ингибирующих каталитическую активность ПХ. Для дальнейшей работы был выбран клон, размножение которого сопровождалось усилением серологической реакции. После повторного клонирования гомо генность клона достигла 100 %,титры МКАТ в куль» туральной жидкости превышали 10 4. а в асцитной жидкости достигали 10 й - 10 Ь.
Исследование свойств полученных МКАТ показало. что они от носятся к подклассу ^С2Ь и не подавляют активность ПХ. Каталитическая активность иммунного комплекса (ПАЛ-комплекс), приготовленного на основе МКАТ п препаратов ПХ перечисленных выше фирм, оказалась одинаковой, из чего следует, что эпитоп, распознаваемый МКАТ, представлен на разновидностях фермента, применяемых в лабораторной практике |3|.
Иаоэлектрическоефокусирование препарата ПХ Кеапа! позволило установить Наличие в нем широкого спектра молекулярных форм со значениями рТ 3.5 до 9,0 и различным уровнем каталитической активности (таблица 1). Добавление к ферменту М КАТ и последующее удаление из раствора антител и ПАП-комплексов с помощью белок А-сефаро-зы приводило к исчезновению из спектра вначале наиболее слабых, а по мере возрастания количества добавленных МКАТ— и наиболее сильных гаофер-ментнмх фракций. Эти результаты позволили заключить, что полученные МКАТ обладают специфичностью в отношении широкого спектра изоформ П X и потому могут быть полезны при приготовлении ПАП-комплексов на основе слабоочищенных препа-ратов фермента. При молярном соотношении МКАТ/ПХ = 1/1 в пзофокусировочном треке оста-валиеь следовые количества одной фракции, обладающей наибольшей каталитической активностью. При соотношении 2:1 исчезала и она. В результате этою своеобразного «титрования» было найдено, что фермент практически полностью включается в иммунный комплекс, когда на2 - 3 молекулы его приходится 1 молекула МКАТ.
Таблица 1. ИЗОФОРМЫ ПЕРОКСИДАЗА, ОСТАЮЩИЕСЯ В РАСТВОРЕ ПОСЛЕ СВЯЗЫВАНИЯ С МКАТ И УДАЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ АНТИТЕЛ И ПАП-КОМПЛЕКСА
р> Изоформы, выявляемые при соотношениях МКАТ/ПХ (м/м
0 1/40 1/30 1/20 1/10 1/4 1/2 1/1 2/1
3,5 +++ +++ +-Н- +++ +++ ++ + - —
++ -н- ++ ■Иг ++ - - -
4,0 ++++ +-М- +++ +++ +-Н- ++ ++ + -
4,7 ++ - - - - - - — —
++ -■ - - - - - - -
++ - - - - - - - -
5,9 ++ - - - - - - - -
++ - - - - - *■ - -
- - - - - - - -
6,9 +++ - - ' - - - - - -
7,7 -м-м- ++++ -Н-+ +++ +++ - - - —
++++■ +++ +++ +++ +++ - - - -
8,3 +++ ++ ++ ++ ++ - - - -
+ + + + - - - -
-н- ++ ++ ++ ++ - - - -
9,4 -и- ++ ++ ++ ++ - - - -
++ Ц.-І* ++ н- ++ - - - -
Примечание. Число знаков *+» отражает относительную активность изоферментов, знак к—» отсутствие выявляемой активности.
МКАТ против Ід человека
Из нескольких тысяч исходных культур в результате первичного скрининга и клонирования было отобрано 76 клонов-продуцентов МКАТ против легких и тяжелых цепей 1$ человека. Как показано в таблице 2, в большинстве случаев удалось получить семейства гибридом, послуживших материалом для дальнейшего отбора продуцентов МКАТ с требуемой совокупностью свойств.
Таблица 2. СЕМЕЙСТВА ГИБРИДОМ-ПРОДУЦЕНТОВ МКАТ ПРОТИВ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ 16 ЧЕЛОВЕКА
Специфичность МКАТ Число первичных клонов
к-Цепь 10
А.-цепь 12
а-цепь 19
у-цепь 10
у 1-цепь 1
у2-цепь 5
уЗ-цепь 2
у4-цепь 4
Е-цепь 9
|а-цепь 4
Критерии отбора МКАТ были определены тем. что основной сферой применения получаемых реагентов представлялась диагностика заболевании человека, при которой используется два варианта твер-дофазвого иммуноанализа — им му носо рбе нт п ы й метод выявления антител отдельных изотипов против определенного антигена и иммунометрическин двухдетерминантныи метод определения концентраций ^ отдельных классов и подклассов 1& В связи с этим отбор М КАТ предполагает:
• исключение из числа изотип-слецифических реагентов тех. которые распознают конфигурационные: эпитопы, ассоциированные со структурой легких цепей или неодинаково эффективно связывают молекулы разных подклассов 1^0;
• отбор МКАТ, распознающих консервативные эпитопы 1$
• отбор МКАТ, распознающих конформационио* устойчивые эпитопы, сохраняющие экспрессию при адсорбции на твердой фаае и после включения ^ в состав иммунного комплекса:
• определение антиген-связьшающеп способности МКАТ после иммобилизации па твердой фазе или присоединения ферментной метки:
• определение эпитопной специфичности МКАТ и выявление тех, которые направлены к топографически изолированным эпитопам.
1999, Т. 1, №1-2 Моноклональные антитела
I Iосколъку для иммунохимпческоги анализа наж но, чтобы используемые МКАТ были направлены против наименее изменчивых (консервативных) эпитопов fg, представлялось необходимым установить, в какой мере полученные реагенты отвечают данному критерию. Для этого исследовали связыва пне каждого из МКАТ с рядом иммобилизовшшых на твердой фазе индивидуальных миеломных бед-ков соответствующего типа, класса и подкласса. В качестве примера ниже приведены данные испытаний МКАТ против подклассов IgG (табл. 3).
Как следует из приведенных в таблице данных многие из полученных МКАТ реагировали с о всеми включенными в панель паранротеипами соответствующего подкласса и не взаимодействовали с альтернативными антигенами. В то же время были выявлены реагенты, которые либо реагировали не со всеми парапротеинами одного субизотипа, либо наряду с антигеном-мишеныо связывали тот или иной миеломный белок альтернативного подкласса. Можно предполагать, что некоторые из использованных парапротеинов л ибо экспрессировали дополнительно детерминанты, не свойственные данным субизотипам в норме, либо утратили один из специфичных маркеров.
Поскольку для скрининга гибридом использовали непрямой метод иммуноаиализа с адсорбированными на твердой фазе [g, существовала вероятность отбора МКАТ. которые распознают «артефактные» эпитопы конформашюнно измененных, а не нативных молекул 1421. Поэтому необходимым этапом селекции было выявление МКАТ, распознающих конформа-ционио-устойчивыеэпитопы и отбраковка тех, которые направлены против изменчивых детерм «таит Ig
Таблица3. СВЯЗЫВАНИЕ МКАТ ПРОТИВ ПОДКЛАССОВ IgG С МИЕЛОМНЫМИ ПАРАПРОТЕИНАМИ
Коды МКАТ Подклассы IgG и количество образцов Специфичность МКАТ
IgQI lgG2 lgG3 lgG4
GI-2CH 17(17) 0(5) 0(5) 0(8) v-i
G2-2A8 0(8) 9(9) 0(3) 0(6) 7-2
G2-3C7 0(8) 9(9) 0(3) 0(6) Y-2
G2-9F10 0(8) 9(9) 0(3) 0(6) y-2
G2-3ES 0(8) 2(5) 0(6) 0(4) У-2
G2-2H6 0(8) 2(5) 0(6) 0(4) У-2
1 G3-5G12 1(8) 0(8) 9(11) 0(8) y-3
G3-IC11 1(8) 0(8) 9(11) 0(8) y-3
G4-5C7 1(9) 0(9) 0(9) 14(14) y-4
64-4G6 0(8) 1(9) 0(9) 10(10) Y-4
G4-1H2 0(4) 1(4) 0(5) 4(9) y_4
G4-2B5 0(4) 0(5) 0(3) 6(6) y-4
Па^д скобками - количество образцов парапротеинов, связывающих МКАТ, в скобках - количество использованных образцов
2.5
2
1.5 1
0.5
■ JgGl
из
1Л
г; —
V.
O' < 1л
vO
Q
•«t
О
Рис. 1 Связывание с 1дй четырех подклассов (ом. обозначения штриховки) МКАТ, полученных в результате первичного отбора.
Связывание с адсорбированным антигеном выявлено с помощью меченых ПХ антител против 1д мыши.
Ось абсцисс - шифры МКАТ.
Ось вдинат - оптическая плотность при 450 нм.
При исследовании характера взаимодействия МКАТ с миеломными парапротеипами, несущими легкие цепи к- или А.-типа, были обнаружены реагины, которые проявляли предпочтительное связывание белков одного из альтернативных типов (дан-ппг не приводятся). Такие МКАТ исключали из •шсла подлежащих дальнейшему изучению.
При изучении МКАТ против изогип-спеинфич Пмх детерминант среди десяти первично выяв-пгмшых реагентов только пять связывали молекулы 1&С Вей четырех подклассов с одинаковой пли близкой эффектапндстыо (рис. 1). Эти МКАТ былиото-Оратл для дальнейших исследований.
і 2 5
0.5
О -
ь.
' ||
_ ї,
<*П 04 \С> С'*
у й- < о а
^ <Л -Я- го
• • І і * О О & о о
— с ос г-
г; г < и
Ч Й: гч
с4 О *
Г4!
— С*1
О о
о О
11-І 0-2
_| I
Г-*
а
о о
<о
С!
тґ
і
О
г-~
О
т
а
Рис. 2. Связывание МКАТ против класс-и подкласс-специфичных эпитопов 1д0 с гомологичными антигенами в растворе
Меченые ПХ МКАТ смешивали с раст ворами 1дв (1) или ФСР (2). Смеси инкубировали на твердой фазе с адсорбированными 1д6 и выявляли связавшиеся МКАТ. Ось абсцисс - специфичности и шифры МКАТ.
Ось ординат - оптическая плотность при 450 нм.
Рис. 3. Изотипические спектры аутоантител против ТГ в сыворотках крови человека.
Выявляющими реагентами служили меченые ПХ МКАТ проіив ІдМ, Ідв или подклассов ІдЄ Ось X - шифры образцов сыворотки.
Ось У - изотипы аутоантжел против ТГ.
Ось 2 - обратные титры аутоантител (хЧО3).
СЗ-ІСІІ
03-5012
0-5Г-2
(5-5ЕЗ
0-5А9
0-303
03-6050
■ оз-ю і
03-5012
04-406 I 04-5С7 Р
І04-5С7 104-406
30
60
90
120
Рис. 4. Ингибирование связывания меченых МКАТ против подклассов 1дв (коды — в рамках) с гомологичными антигенами в присутствии немеченых МКАТ (вертикальная ось).
МКАТ 8С16, 6050.6014,6009,6008. 6200, 6025,6011, 6023 и 6013 - референс-образцы.
Горизонтальная ось - степень ингибирования в %%
Таблица 4. ЭПИТОПНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ МКАТ ПРОТИВ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ lg ЧЕЛОВЕКА
Специфичность и коды немеченых МКАТ Коды меченых МКАТ
против Х-цепи против к-цепи
2G9 5Е5 4F4 4G7 ЗА4 4С11
2G9
4F5
Х.-цень 5ВЗ шшш»
свободная 5Е5
и 1ВЗ
связанная ЗН4 || |
1В7
ЗВ12
4F4
^-цепь 1F1 ш)
свободная ЗА1
3D12
4G7
к-цель свободная ЗН5
и связанная 5D4
ЗА4
4С11
4Н4 L‘ v » ..‘і
к-цепь 1СЗ
свободная 4С5
ЗС6
1EJ1
Заштрихованными полями обозначено полное ингибирование связывания, пенями без штриховки - отсутствие достоверного ингибирования связывания
Р'мгейШ. относящиеся к последней категории, были о£мшружты среди МКАТ против изотопических маркеров IgG (рис. 2) и TgM [4]. Аналогичным образом были исследованы МКАТ против остальных изотн-nj)U lg. lire МКАТ против подкласс-сиецифичных «дркгрш! IgG распознавали ко нф ор мани окно- у стой -нишелштопы.
Сохранение экспрессии эпитопов, расиоэьавае-чщ МКАТ, при формировании комплексов нссле-(>.' с антигеном, гоняется предпосылкой при-Ш'Псгшя МКАТ в нммуиосорбентпих тестах лясюшнспецифических антител. Отбор МКАТ по now, куш гI'надо проводили в тестах выявления ан-Tlraf противпнфекцио!шых агентов 12,4. 61 и ауто-лпгител против ГТ(рис.З). Среди изученных МЮ\Т и1 !Ж,1Л1Л0П| продуктов, направленных против уча-■тт.'Р, акриштруемых при образовании иммунных Лввдосов.
При исследовании МК.АГ против легких цепей баллвьишлс-пы реагенты двух типов: один связывали дагкнс цепи п целостные Ig, другие вэаимодей-
ствовали только со свободными легкими цепями. Из этого следовало, что МКАТ второй группы распознают эпитопы, скрытые в структуре целостных молекул lg и экс лессированные только на свободных легких цепях [1].
Анализ зпитопной специфичности (табл. 4) ио казал, что МКАТ против к-ценн распознают не ме-нее 3-х. а МКАТ против ^-цени —■ не менее 5-ти аи тиренных участков.
Изучение связывания МКАТ против класс-спе-цифичных маркеров IgG с проТеолитическими фрагментами показало, что три распознаваемых эпитопа локализованы в пределах Fc-областн. тогда как два других находятся, вероятно, в районе разрушающегося при протеолизе шарнирного участка [5]. М КАТ против нзотил-спсцифнчпых детерминант IgG и ре-фе.ренс-реагекты из других лабораторий были использованы для картирования эпитопов, распознаваемых М КАТ против подклассов IgG [2,6]. Данные, полученные с [шмощиЮ конкурентного метода им муноанализа (рис. А), позволил и заключить, что:
• эпитоп С1-2СР1 расположен в Ре области вблизидетерминанты,связывающей МКАТС-303 и рефереис-реагент 8С16 (5^та);
• МКАТ против ^02 и 1)^СЗ реагируют с эпи гопами, близкими к шарниру и отличаются по эп итогшой специфичности от использованных референс-образцов;
■ эпитоп, связывающий МКАТ против ^04, находится в Рс-области в удалении от эпитопа О-303 а идентичен участку, к которому направлено МКАТ НР-6025.
Совокупность результатов позволила построить схему расположения класс- и подкласс-спегшфич-ных эпитопов 1^С;, распознаваемых М КАТ (табл. 5).
Таблица 5. СХЕМА РАСПОЛОЖЕНИЯ КЛАСС- И ПОД-
КЛАСС-СПЕЦИФИЧНЫХ ЭПИТОПОВ Ідв
Эпи- топы Области гамма-цепи
РаЬ Шарнир Рс ррс’
1дб 5Р25НЗ 5А9 303
№1 2С11
(двг ЗС7 9Я10
ідЄЗ 1С11 5012
ІдС54 5С7466
Исследование апитопной специфичности МКАТ против 1йР (тайл. 6), показало, что они распознают четыре антигенных участка, из которых один идентичен эпитопу, связывающему МКАТ 1Т (IгшщтоТесЬ)
Се2 С£3 С {-4
Рис 5. Схема локализации эпитопов, связывающих МКАТ против 1дЕ
п сближен с участком, распознаваемым другим рефе-ренс-лрепаратом ВЯУ/. Ни одно МКАТ не шггерфе-рировало с референс-препаратом Ре-27.
Три эгштопных кластера не связывали референс образцы, из чего следует, что направленные против них МКАТ не имеют аналогов среди наиболее распространенных реагентов. Дополнительная информация о расположении связывающих МКАТ эпитопов стала доступна благодаря применению рекомбинантных полипептидов, воспроизводящих фрагменты первичной структуры г-цепи [37]. Сумма полученных сведений позволила построить схему расположения эпитопов^ связывающих исследуемые МКАТ (рис'5).
В цепом изучение «титовкой специфичности по зволило сгруппировать М КАТ, распознающие идеи -тичпьге или пространственно сближенные детерминанты молекул І& а также выявить реагеи гы. направленные против топографически удаленных участков, что необходимо для конструирования имму помет-
Таблица 6. ИНГИБИРОВАНИЕ НЕМЕЧЕНЫМИ МКАТ ПРОТИВ 1дЕ СВЯЗЫВАНИЯ МЕЧЕНЫХ МКАТ С АДСОРБИРОВАННЫМ НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ АНТИГЕНОМ
Коды меченых МКАТ
Коды немече ных МКАТ
Штриховкой обозначена степень ингибирования связывания метки в процесах от позитивного контроля.
- О - 30 %
Ні -60-100% 3 - 30 - 60 %
Таблица 7. ПАНЕЛЬ МКАТ ПРОТИВ Ід ЧЕЛОВЕКА
№ КОДЫ МКАТ Специфичность МКАТ Применение в тестах иммуноанализа
Двухдвтерминантном Иммуиосорбентном
Тф1 МР2
1 K-4G7 Ід к-типа + + +
2 К-4С11 к-цепь + — —
3 1-269 1д Х-типа + + +
4 X-3D12 Л-цепь + — —
5 А-ЗВ7 а-цепь + — —
6 A-IH9 а-цепь - + +
7 А-2В5 а 1-цепь + + +
В G-3D3 у-цепь — + +
9 G-5E3 у-цепь •f — -
to G-5A9 у-цепь - + +
11 G-2C11 у1-цепь + + +
12 G-9F10 у2-цепь — + +•
13 G-3C7 у2-цепь + - -
14 G-5G12 уЗ-цепь + + +
15 G-5C7 у4-цепь + + +
16 E-5D4 е-цепь + - -
17 E-4F4 е-цепь — + +
18 М-2В9 (а-цепь + + +•
I - ТФ-МКАТ сохраняют активность после иммобилизации на геердой фазе. 2- МР-МКАТ используются в качестве выявляющего реагента в ИФА.
Русских (двуздегерминднтиьсх) систем иммуноапл-ІПГ1Я 117],
В результате отбора по перечисленным критерием была сформировала панель М КАТ (табл. 7). по-•’"тиинцпхс помощью прямого, непрямого и имму-чпиггойческого вариантов иммуноаналта выявлять 'ції типы, ичотипы и субизотмпы І£ человека кроме
шЬ
МКАТ против ТГ человека
I Первичный отбор гибридомных культур с помо-И!.'*0|Кпрямоти ИФА и последующее клонирование \ ЬіШолнлп цулучить 15 штам мов-п роду це и то в МЮ\ Г. которые распознавали ТГ человека, по не иміШДействпііалнтісТЗ, ішсТ-і. Изучениевидо-і»гНш'ша|шчносги МКАТ показало, что два МКАТ рРЦ 26$реагировали перекрестно сТГбыка и еви-*и,,Щт51:9.5Р5) —сТГбыка йодно С5А6) - с ТГ Огталъише десять реагентов вза имодейс гво-ы-Ш ийьш с ТГ человека. Исследование эиитоиной іиецифичіюгпі показало (габл. 7) что все МКАТ «'•лаю рпзлелптъ пал! группы.
Ниерпую включены девять МКАТ, каждое из ко п/рщ ілаікурирует только с одноименным КОНЪЮ •
гатом м. следовательно, направлено к одному н.кит-роваииому эпигону. Среди этих реагентов два (2И2 и 208) распознают эпгггапы, экспрессированные на ТГ человека и животных двух видов, а одно -(5А6) - на ТГ человека и свиньи. Вторая группа объединяет два МКАТ (1С11 и ЗВ7), взаимно шип-бируюших связывание с ТГ и распознающих один пли два сближенных эпитопа. Третью группу образовали четыре конкурирующих реагента, пз которых два (5Г9 п 5Г'5) связываются с эпитопом, общим для ТГ человека и быка, а два дру ги х (ч’ Р4 н5РЗ) -суча-стком, представленным только на .молекуле Т! чело-пека. Из этого можво сделать вывод о том, что третья группа МКАТ распознает два топо! рафичееки близких эпитопа ТГ человека. Таким образом полученное семейство распознает на молекуле ТГ человека не менее двенадцати эпитопов.
Изучение конфирмационной изменчивости эпи-голов, связывающих МКАТ. показало, что присутствие ТГ в растворе частично (на 30 - 60 %) подавляло связывание трех МКАТ (IС11. 3В7 и ЗАВ), на связывание одного МКАТ (5С8) не оказывало влияния, а взаимодействие всех остальных подавляло более чем на 60 %. Это позволяло заключить, что три эпи топа ТГ при адсорбции на твердой фазе изменяют
Таблица 8. ГРУППЫ ВЗАИМНОГО ИНГИБИРОВАНИЯ НЕМЕЧЕННЫМИ МКАГ СВЯЗЫВАНИЯ МЕЧЕНЫХ МКАТ ПРОТИВ ТГ С АДСОРБИРОВАННЫМ АНТИГЕНОМ
КОДЫ нативных МКАТ Коды меченых моноАТ
2Р2 269 5А6 5Р9 5Р5 4Р4 5РЗ шо 1611 ЗВ7 5А4 5Е6 4В12 565 568
2Р2
269
5А6 йин
5Р9 { г~* 'V-:
4Р4 *» ;
5РЗ х . ■ ' . ,-;у=
5Р5 ,
1Р10
1611
ЗВ7
5А4
5Е6
4В12
565
568 .
МКАТ, связывающие ТГ даух или трех видов МКАТ, связывающие только ТГ человека
Штриховкой обозначено ингибирование связывания на 60 - 100 %; отсутствие штриховки - отсутствие достоверного ингибирования связывания
Таблица 9, ИНГИБИРОВАНИЕ АУТО-АНТИТЕЛАМ И СЫВОРОТОК ПАЦИЕНТОВ
отсутствие ингибирования полное ингибирование (60 %-100 %)
конформацию частично, участок, связывающий МКЛТ 508, представлен только на молекуле адсор (тированного ТГ. остальные эпитоны на иммобили-втешлом п растворенном ТГ экспрессированы одинаково,
1 Для изучения интерференции полученных МКЛТ с аутоантителами и выяснения эпитопной специфичности последних было исследовано влияние сывороток пациентов с аутоиммунными заболеваниями шитовидной железы (таблица 8) ыа взаимодействие МКЛТ с ТГ. Сыворотки больных с аутоиммунным тиреоидитом (Л1ТТ) и диффузным . токсическимзобом (ДТЗ) не влияли на взаимодействие 14-тв МКАТ с ТГ, но полностью подавляли связывание МКАТ 1П (1, из чего следует, что последнее распознает эпитоп, связывающий аутоапти-тела сывороток пациентов, страдающих АИТ и ДТЗ.
Заключение
Мыши линии 1\]Б/,), предложенные исходно как «шедь экспериментальной онкологии (24], в далъ-игйшем стали использоваться для изучения ряда проблем иммунологии и иммунопатологии [13. 21. 26}. Исследования иммунного статуса и особенное-тей иммунной реактивности мышей выявили дефекты аптиген-презеитнругощей и регуляторной функции микрофагов 113, 41] и участие этих клеток и процессе неопластической трансформации лимфо-адшцткани [ 151. Была обнаружена преимуществеи-щйЖПресеня у этих животных генов \2- и ХЗ-це-1!гй в сшиппе от М-генов, функционирующих у иниши большинства инбредных линий [36, 22 [.
1’анее мыши 8|Ь/] находили применение при 1 одучолт гибридом лишь для решения узкоснени-I (Шгегх задач. Так, на основе нормальных лимфоип-п.ш мышей и] была получена серия гибридом и №’ И'доваиа снособносп. синтезируемых ими МКЛТ Р^иррвать с ДНК, гнетонамн, ТГ и другими ауто ШГГПГсипымикомпонентами различных тканей мы-I шей rn.il Аллосипические отличия |£ мышей Б.! \~/] РОЗи^Ш-'Ш. иммунизируя их 1§С2а мышей ВАЦВ/с, I качучу серию МКАТ против детерминант алло-пт ^Ь“. 11 изучить локализацию этих эпитопов на ЧШрапротс-инах. синтезируемых мышиной м иелом ой МРС-11, происходящей от линии ВАТВ/с [33].
■ Вти ял: время совокупность данных об особен П^ГГМх регуляции иммунного ответа и экспрессии ГШшв 1д позволяли предполагать, что репертуар им-й.¥П11йго ответа животных этого генотипа отличает-с« ..шибраэнем. Результаты, представленные в на-Л1г'Ш'.'С| работе, подтвердили это предположение. МКЛТпрйпге ГГХ, полученные на основе иммунных чинфодптоп мышей 5.1 Г/Х отличаются от описан-rl.ii* в'.ш«ратуре|40| способностью связывать ши-ровяйокктр псюформ этого фермент а Среди М КАТ
против ^человека ряд реагентов отличается по зим топнон специфичности от аналогов, созданных на основе иммунных лимфоцитов мышей BALB/c. Уникальными но эпитопной специфичности оказа лясь МКАТ прошв IgG2. lgG3 ы некоторых эпитопов IgE.
Эпитопы ТГ, распознаваемые аутоантителнми сыворотки пациентов с АИТ и ДТЗ, при иммуниэа ции этим антигеном мышей линии BALB/c ведут себя как иммунодомииантные. Поэтому значительная часть МКЛТ против ТГ интерферирует с ауто-антителами [32], Среди МКЛТ против ТГ. полученных в настоящей работе иа основе лимфоцитов мышей SJ L/J, только одно обладает указа н ным сnoii ством. Большинство реагентов направлено к иным, отличающимся друг от друга эпитопам ТГ'. что открывает новые возможности для анализа антиген ной структуры этого белка.
Систематическое использование мышей SJL/J для биотехнологических нелеп в настоящей работе описано впервые. Оно представляется перспективным, т. 1с позволяет расширить спектр эпитопов, распознаваем ых МКЛТ, полнее исследовать структуру и разрабатывать новые методы детекции и анализа антигенных субстанций.
Список литературы
1. Грязева И.В., Климович В.Б., Пашкова С.Ф. // Иммунология. —1994. — №3. — С. 31 - 37.
2. Климович В.Б., Самойлович М.П., Крутец-кая И.Ю. и др. // Иммунология. - 1998. -№ з. - С. 27 - 30.
3. Климович В.Б., Самойлович М. Л.. I IaniKoaa С.Ф идр.// В кн. «Моноклональные антитела в медицине и биотехнологии». — 1990 — М., ЦНИИ ВС нм. И.И. Мечникова. — С. 56 - 67.
4 Климович В.Б. Самойлович М.П., Крутеи кая ИЛО. и др. // Биотехнология. - 1997, — № 4. - С. 40 - 46.
5 Самойлович М.Л.. Юшмовнч В.Б., Пашкова С. Ф // Иммунология. — 1996. — .№> 2. — С. 38 - 43.
6. Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю., Климович В.Б. и др. // Иммунология. — 1998. — №3. -С. 30 - 32,
7. Самойлович М.П., Пашкова С.Ф., Овсянникова И.Г идр. // В ка. «Современные методы им-мушшшпческой и мол е куля р н о - би о л о гич е С КО П диагностики в медицине»'. Труды НИ И ВС им. И.И. Мечникова. - М., 1992. — С. 45 53.
S. Фунштейн Л.В. // В кн. о Актуальные вопросы клиники итерании лимфогранулематоза*». — Л., 1970. - С. 9 - 12.
9. Appleby P.. Catty D. // Immunology — 1985. Vol. 54! - P. 429 - 437,
10. Ben-Yaakov M., Haran-Ghera N. // Nature. -
1975. -Vol. 255. -P. 64 66.
11. Bernard C.C.A.. Carnegie P.R. //J. Immunol. -1975. - Vol. 114. - P. 1537 - 1540.
12. Carayanniotis G., Rao V.P. //Immunol. Todav. -1997.-Vol. 18.-P. 83- 88.
13. Crowle A.J., Jacobson S., May M. // Irnmunol. Commun. — 1978. — Vol. 7. — P. 417 - 429.
14. Festing M.F.W. tnbed strains in biomedical research. Unwin Brothers Ltd. London, 1979. — 511 p.
15. Ford R., Ruppert B.. Maize! A.L. // Lab. Invest. 1981.- Vol. 45.- P. 111 — 119.
16. Fuchs S., Moses E., Stollar B.D. //J. Immunol 1975. — Vol. 114.— P. 1287 - 1291. ’
J7. Males J., Woodhead J. // Meth. in Enzymol. -1980. - Vol. 70. - P. 334 - 355.
18. Haran-Ghera N.. Kotler M„ Meshorer A. //J. Nat. Cancer Inst. - 1967. - Vol. 39. - P. 653 - 661.
19. Herzenberg L.A.. Jones P.P., Herzenberg L A. // Ann. Immunol. - 1974. - Vol. Cl25. — P. 1 - 2. 71 - 83.
20 Horibata K., Harris A.W. // Exp. Cell Res. — 1970,- Vol. 60.-P. 61 -77.
21. Hosono M., Cixiader B. // Int.Arch. Allergy Appl. irnmunol. - 1977. - Vol. 54. - P. 289 - 299.
22. Ju S.-T., Dort M. //J. Immunology. — 1984. Vol. 133.- P. 1404 -1409.
23. Kovarchev D..TernynkT.. GuenetJ.-L.. Avrameas S. // Immunology. — 1983. — Vol. 48. — P. 367 - 375.
24. Kumar R.K.// Amer.J. Patol. — 1983. — Vol. 110. -P. 393 - 396.
25. Lawgone J. // J. Immunol. Meth. — 1982. -Vol. 55.-P. 277- 296.
26. Levine B.B. // Ini Arch. Allergy Appl Immunol.— 1970. - VoL 39. - P. 156 - 171.
27. Ling N.. Elliott D., Lowe J, // Immunology. -1987.-Vol.62.-P. 7-10.
28. MacLennan I.C.M. // Current Topics in Microbiology' and Immunology. — 1990. - Vol. 159. -P. 37 - 63.
29- Mclntire К R.. Law L.W. // J. Nat. Cancer Inst. — 1967 - Vol. 39. - P. 1197 -1211.
30. Milstein C.. Kohler G. // In «Antibodies m human diagnosis and therapy». — 1977 N-Y. P. 271 - 286.
31. Murphy E..D. // ]. Nat Cancer Inst. - 1969. — Vol. 42. - P. 797 -807.
32. Noel D.. Bernardh T . Navarro-Teulon I. el al /;' J. Immunol. Meth. - 1996. - Vol. 193. - P. 177 187.
33. Oi V, Herzenberg L.A.. Birshtem B. // J. Immunol. - 1983 - Vol. 130. - P 1967 - 1969.
34. Potter M. // Physiol. Rev. - 1972. - Vol. 5. -P. 631 - 716.
35. Prabhakar B.S., SaegusaJ., OnoderaT„ Notkins A.L // J. Immunol. - 1984. - VoL 133. - P. 2815 -2817.
36. Primi D,, Sanchez P.. Cazenave P.-A. // Eur. J. Immunol. - 1984. — Vol. 14. — P. 1159 - 1162.
37. Rajevski K.. Foster I., Cumano A. // Science. -1987. - Vol. 238. — P. 1088- 1094.
38. Samoilovicb M.P.. Klimovich V.B., Gervazieva V B. et. aJ. //Allergy & Clm. Immunol. News. - 1992. — Vol. 4. - P. 21 - 25.
39. Scheid M.P., Chapman- Alexander J. М.. HayamaT. et al. // «В Lymphocytes & Immune Response: Func., Develop.. Interactive Prop. 2nd Int. Conf» N.Y. e.a., 1981. P. 475 482.
40. Semenenko F.M. (MacMillan), Bratmvell S.. Sidcbotr.om £.. Cuello A. // Histochemistry. -1985. - Vol.83. - P 405 - 408.
41. Stohlman S., Matsushima G., Casteel N.. Frelinger J. /'/'Eur.J. Immunol. — 1985. - Vol. 15.— P. 913 -916.
42. Vaidya II.C., Dietzler D.N . Ladenson |.H // Hybridoma. - 1985. - Vol. 4.- P. 271 - 276.
43. VVanebo H.J.. Gallmeyer W.M.. Boyse Е.Л., Old LJ // Science. - 1966. - Vol. 154.- P. 901 - 903. '
