CC BY
0
УДК 637.524.5 DOI: 10.21323/2071-2499-2021-2-68-71 Табл. 1. Библ. 25.
МОНИТОРИНГ СОСТАВА СТАРТОВЫХ КУЛЬТУР В ГОТОВЫХ СЫРОКОПЧЁНЫХ И СЫРОВЯЛЕНЫХ КОЛБАСАХ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Курбаков К.А., Коноров Е.А., канд. биол. наук, Минаев М.Ю., канд. техн. наук ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
Ключевые слова: ПЦР в реальном времени, сырокопчёные колбасы, сыровяленые колбасы, стартовые культуры, видовая идентификация, Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus carnosus
Реферат
ГОСТ Р 55456-2013 «Колбасы сырокопчёные. Технические условия» и ГОСТ 33708-2015 «Изделия колбасные сырокопчёные и сыровяленые. Общие технические условия» накладывают требования в том числе и к применению стартовых культур при производстве сырокопчёных и сыровяленых колбас. В связи с этим возникает необходимость разработки методов контроля соответствия готовой продукции данным требованиям. В настоящей работе мы обосновали, что микроорганизмы филогенетической группы Lactobacillus sakei и филогенетической группы Lactobacillus plantarum являются маркерами развития технологически значимой микрофлоры, а микроорганизмы видов Pediococcus pentosaceus и Staphylococcus carnosus - маркерами применения стартовых культур. Мы предложили для этих целей набор пар праймеров для идентификации указанных таксонов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. С их помощью был проведён мониторинг 28 образцов сырокопчёных и сыровяленых колбас. Были выявлены случаи несоответствия маркировке продукции согласно ГОСТ Р 55456-2013 «Колбасы сырокопчёные. Технические условия» и ГОСТ 33708-2015 «Изделия колбасные сырокопчёные и сыровяленые» и рассмотрены возможные причины данных несоответствий. На основе полученных данных были так же проанализированы составы стартовых культур, которые чаще выбирают производители.
STARTER
CULTURES MONITORING IN COMPOSITION OF SMOKED AND DRIED SAUSAGES BY REAL-TIME PCR
Kurbakov K.A., Konorov E.A., Minaev M.Yu.
Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: Real-time PCR, raw smoked sausages, dry-cured sausages, starter cultures, species identification, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus carnosus
Abstract
GOST R55456-2013 «Dry sausages. Specifications» and GOST 33708-2015 «Smoked and dried sausages. General specifications» impose requirements for the use of starter cultures in the production of raw smoked and dry sausages. In this regard, it becomes necessary to develop methods for monitoring the compliance of finished products with these requirements. In this work, we substantiated that microorganisms of the phylogenetic group Lactobacillus sakei and the phylogenetic group Lactobacillus plantarum are markers of the development of technologically significant microflora. And microorganisms of the species Pediococcus pentosaceus and Staphylococcus carnosus are markers of the use of starter cultures. We have proposed a set of primer pairs for the identification of these taxa by the real-time polymerase chain reaction. 28 samples of smoked and dry sausages were monitored using these primer pairs. Cases of non-compliance with product labeling in accordance with GOST R55456-2013 «Dry sausages. Specifications» and GOST 33708-2015 «Smoked and dried sausages. General specifications». Possible causes of these discrepancies are considered. The compositions of the starter cultures, which are more often chosen by the producers, were also analyzed.
Введение
В 2014 году вступил в силу ГОСТ Р 55456-2013 «Колбасы сырокопчёные. Технические условия». В данном ГОСТе регламентируются использование стартовых культур при производстве перечисленных в нём сырокопчёных колбас. При этом различаются колбасы, выработанные с применением стартовых культур («сухие»), и без применения стартовых культур («полусухие»). Для производства сырокопчёных колбас по ГОСТ Р 55456-2013 применяют «стартовые культуры, содержащие штаммы микроорганизмов родов лакто-бацилл (Lactobacillus spp.), педиококков (Pediococcus spp.) и микрококков (Micrococcus/ Kocuria spp.)» [1]. Данное ограничение является существенным, так как в качестве денитрификаторов в составах стартовых культур используются преимущественно микроорганизмы рода Staphylococcus. Согласно данным сети интернет из 25 наименований стартовых культур, доступных на российском рынке, в 21 из них использовались микроорганизмы данного рода.
ГОСТ 33708-2015 «Изделия колбасные сырокопчёные и сыровяленые. Общие технические условия» распростра-
няется на прочие мясные колбасные изделия сырокопчёные и сыровяленые. В нём, помимо сухих и полусухих, прописаны такие типы колбас (колбасок) как «полусухие с регулятором кислотности» и «мажущейся консистенции». Для данных типов указано, что они должны быть «изготовлены... при температурах, обеспечивающих условия, способствующих росту микроорганизмов, входящих в состав стартовых культур» [2]. Соблюдение данного условия также нуждается в контроле.
Для решения задачи контроля соответствия готовых колбасных изделий данным требованиям мы сопоставили имеющиеся в литературе данные о видовом составе микробиоты колбас, выработанных без применения стартовых культур, с заявленным составом стартовых культур, имеющихся на российском рынке. Так, по данным различных авторов [3, 4, 5, 6, 7, 8, 9] основными видами, развивающимися в ходе естественной ферментации, являются Lac-tobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum и Staphylococ-cus xylosus.
Нами было рассмотрено 25 наименований зарубежных стартовых культур,
доступных на российском рынке. Молочнокислые микроорганизмы (МКБ) представлены преимущественно штаммами L. sake (в 11-ти наименованиях стартовых культур), P. pentosaceus (в 9-ти) и P. acidi-lactici (в 7-ми). В единичных случаях используются штаммы видов L. plantarum, L. curvatus и Leuconostoc citreum. Денитрифицирующие микроорганизмы были представлены преимущественно штаммами рода Staphylococcus: в составе 19-ти стартовых культур используются микроорганизмы вида S. carnosus, в 10-ти -S. xylosus и в одной - S. vitulinus. Бактериальные препараты могли содержать сразу два вида рода Staphylococcus. Также по одному наименованию бактериальных препаратов содержали Micro-coccus luteus и штамм, обозначенный как Micrococcoaceae spp. Среди рассмотренной литературы наличие P. pentosa-ceus в колбасах, выработанных без применения стартовых культур, описывает только Козачински с соавт. [8]. В данной работе авторы культуральными и биохимическими методами определили микробиологический состав колбас, выработанных на предприятиях шести стран, в течение процесса созревания. Данный вид обнаруживался, как правило,
в начале ферментативного процесса только в трёх выработках. При этом количество колоний, идентифицированных как иные виды МКБ, значительно превышало колонии, идентифицированные как P. pentosaceus. Также не характерен для микрофлоры колбас вид P. acidilactici.
Таким образом, микроорганизмы видов S. carnosus, P. pentosaceus, P. acidilactici могут служить маркерами применения стартовых культур в процессе производства сырокопчёных и сыро-вяленых колбас. В то время как Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum могут использоваться для контроля соблюдения условий ферментации продукта. Выделение и идентификация данных видов классическими микробиологическими методами требует длительного времени. Методы для прямого обнаружения видов микроорганизмов в готовой продукции являются более предпочтительными, так как не требуют культивирования микроорганизмов и выделения чистых культур. Примером такого подхода является жидкостная масс-спектрометрия. Руссо с соавт. для обнаружения и относительной количественной оценки видов МКБ стартовых культур в буйволиной и коровьей сыворотке предложила метод жидкостной масс-спектрометрии [10]. Также для изучения микробиома сырокопчёной продукции активно применяются методы секвенирования нового поколения (NGS) [11, 12]. Преимуществом данных методов является то, что в результате становится известно полное видовое или родовое разнообразие микроорганизмов образца. Однако оба приведённых метода пока дороги в применении, а также требуют трудоёмкой пробопод-готовки и анализа данных. При этом не всегда возможно определять филогенетическую принадлежность с точностью до вида. Для обнаружения целевых видов организмов оптимальным методом выбора является полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. Данный метод - сравнительно дешёвый и обладает меньшими временными и трудозатратами.
Целью данной работы являлась разработка панели праймеров для скрининга микрофлоры сырокопчёных колбас, представленных на российском рынке, на предмет соответствия маркировке. Развитие стартовых культур и технологически значимой микрофлоры оценивалось по наличию видов L. sakei, L. curvatus, L. plantarum. Соответствие типу «полусухая» устанавливалось по наличию видов-маркеров P. pentosaceus и S. carnosus.
Объекты и методы
Объекты исследования
В качестве положительных контролей использовались образцы ДНК микроорганизмов. L. sakei, L. curvatus, L. plantarum, P. pentosaceus, P. acidilactici и St. carnosus были взяты из коллекции Лаборатории молекулярной биологии и биоинформатики ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН.
В качестве исследуемых образцов были взяты 28 наименований сырокопчёных и сыровяленой колбас от 16 мясокомбинатов. Из них было 4 наименования полусухих колбас, выработанных по ГОСТ Р 55456-2013, 1 - сухая колба, выработанная по ГОСТ Р 55456-2013, прочих сухих колбас - 3, полусухих - 19, полусухая колбаса с регулятором кислотности - 1.
Отбор проб и выделение ДНК
Пищевая продукция была измельчена на ножевом гомогенизаторе GRINDOMIX GM 200 (Retsch, Хаан, Германия). Для выделения ДНК отбирали изолированные колонии культур контрольных образцов, разведённых в 200 мкл физиологического раствора, и гомогенизированной продукции по 50 мг. После чего проводили лизис и очистку хлороформом с использованием реагентов набора Сорб-ГМО-Б (Syntol, Москва, Россия) согласно инструкции. Дальнейшее выделение ДНК было проведено на станции MagNA Pure LC2.0 isolation station (Roche) с использованием набора MagNa Pure LC DNA Isolation Kit II (tissue) (Roche, Мангейм, Германия).
Дизайн праймеров
Для проведения ПЦР использовались отработанные ранее пары праймеров для обнаружения филогенетических групп L. sakei - L. curvatus и L. plantarum -L. paraplantaum - L. pentosus [13] и вида S. carnosus[14]. Для настоящего исследования дополнительно была разработана видоспецифическая пара праймеров для идентификации P. pentosaceus по участку гена gyrB. Выбор участка с необходимой видовой специфичностью проводился с использованием базы данных NCBI [15]. Для дизайна пар праймеров использовались программы Primer-BLAST [16] и OligoAna-lyzer v. 3 [17]. Чувствительность праймеров для обнаружения P. pentosaceus оценивалась при проведении ПЦР с серией десятикратных разведений ДНК P. pentosaceus; специфичность - ПЦР с ДНК P. acidilactici, L. sakei, L. plantaum и S. carnosus.
Параметры ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени проводилась на амплификаторе АНК-32 (Син-
тол, Москва, Россия). Реакционная смесь объёмом 30 мкл содержала праймеры концентрацией 300 нМ, зонд концентрацией 150 нМ, 2,5 млМ MgCl2, dNTP концентрацией 0.25 млМ каждого, SynTaq полимеразы концентрацией 2,5 единицы активности и 5 мкл изолированной ДНК. Компоненты реакционной смеси были произведены Синтол. Режим ПЦР реакции: предварительная денатурация при 95°C, 7 мин и 45 циклов амплификации (60°C, 15 с и 95 °C, 15 с).
Результаты и обсуждение
Была проверена чувствительность и специфичность подобранных прайме-ров для обнаружения P. pentosaceus. ПЦР в реальном времени показало положительный результат с ДНК P. pentosaceus и отрицательный - с ДНК P. acidilactici, L. sakei, L. plantaum и S. carnosus. Прай-меры, используемые для обнаружения филогенетических групп L. sakei и L. plantarum подобраны на участок гена rpoA. Данный ген обладает оптимальной разрешающей способностью для обнаружения отельных филогенетических групп МКБ и часто используется в исследовательских работах [18, 19]. Праймеры для идентификации S. carnosus, так же как и для идентификации P. pentosaceus, были подобраны на участок гена gyrB, обладающий среди многих родов микроорганизмов внутривидовой гомологией и специфичностью относительно родственных видов.
Был проведён анализ ДНК 28 образцов сырокопчёных колбас методом ПЦР в реальном времени с разработанными парами праймеров. Результат приведён в таблице 1.
Из четырёх полусухих колбас, выработанных по ГОСТ, в троих было выявлено наличие S. carnosus. Данный вид не характерен для микрофлоры колбас, выработанных без применения стартовых культур. Следовательно, можно сделать вывод, что было нарушено требование ГОСТ Р 55456-2013, т. к. микроорганизмы Staphylococcus spp. не указаны в данном ГОСТ в перечне родов, допустимых при производстве колбас.
Анализ образца № 1 сухой колбасы комбината № 1, выработанной по ГОСТ Р 55456-2013, показал отсутствие микроорганизмов-маркеров применения стартовой культуры, что указывает на соответствие маркировки товара. Следует отметить, что отсутствие вида S. car-nosus не может полностью указывать на то, что не применялась стартовая культура. В качестве денитрификаторов могут применяться микроорганизмы родов Micrococcus и Kocuria. Идентификация
Таблица 1
Анализ доминирующей технологически значимой микрофлоры образцов сырокопчёных и сыровяленых колбас
H ("С Нормативный документ, ДНК выявляемых таксонов
21 С ^ г-
ч = О ©| ^ Z « ^ о. с Ю о 1 О Z тип колбасы Группа L. sakei Группа L. plantaum P. pentosaceus S. carnosus
1 ГОСТ, сырокопчёная сухая +
2 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
1 3 ТУ, сыровяленая сухая + + +
4 ТУ, сыровяленая сухая + + +
5 ТУ, сыровяленая сухая + + +
6 ГОСТ, сырокопчёная полусухая + +
2 7 ТУ, сырокопчёная полусухая + + + +
8 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
3 9 ТУ, сырокопчёная полусухая +
10 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
4 11 ГОСТ, сырокопчёная полусухая + +
12 ТУ, сырокопчёная полусухая +
5 13 ТУ, сырокопчёная полусухая с регулятором кислотности
14 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
6 15 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
16 ТУ, сырокопчёная полусухая +
7 17 ТУ, сырокопчёная полусухая + + + +
18 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
19 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
8 20 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
21 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
9 22 ГОСТ, сырокопчёная полусухая +
10 23 ГОСТ, сырокопчёная полусухая + +
11 24 ТУ, сырокопчёная полусухая + +
12 25 ТУ, сырокопчёная полусухая + + +
13 26 ТУ, сырокопчёная полусухая + + + +
14 27 ТУ, сырокопчёная полусухая +
15 28 ТУ, сырокопчёная полусухая
+ — обнаруженные виды микроорганизмов
микроорганизмов данных родов осложнена недостаточностью данных по систематике видов данных родов, встречающихся в стартовых культурах, и достаточном количеством их полногеномных прочтений. Однако в настоящее время работы в данном направлении активно проводятся [20].
Анализ сухих сырокопчёных колбас № 3-5 комбината № 1 показал наличие видов-маркеров применения стартовых культур — как Р. репОзасеиз, так и 5. сагпозиз. Таким образом, маркировка продукции не соответствует действительности. Следует отметить, что причиной несоответствия может быть не только сознательное нарушение
+ + +
маркировки, но и контаминация от замесов фаршей предыдущих выработок. Видовой состав стартовых культур данных образцов совпадал с видовым составом образца № 2 того же комбината. Штаммы для производства стартовых культур отбираются, в том числе, и по способности ускоренного роста в условиях технологического процесса [21, 22]. Таким образом, можно предположить, что даже незначительная контаминация фарша без стартовых культур может привести к развитию привнесённых штаммов. Предотвратить подобную контаминацию возможно соблюдением санитарно-гигиенических норм. При сравнении между собой состава технологически
значимой микрофлоры колбас, выработанных на других комбинатах (№ 2-8) видно, что в разных образцах от одного комбината обнаруживаются различия. Следовательно, при соблюдении параметров технологического процесса возможно предотвращать кросс-контаминацию стартовыми культурами. Следует отметить, что состав готовой стартовой культуры так же может не соответствовать заявленному. В частности, ранее нами были исследованы стартовые культуры, содержащие S. carnosus ssp. utilis, идентификация которого с использованием биохимических тест-систем затруднена [14].
Среди всей выборки только образец № 13 комбината № 5 относился к типу колбаса полусухая с регулятором кислотности. В данном образце не обнаруживались даже филогенетические группы L. sakei и L. plantaum, характерные для индигенной микрофлоры колбас. Это свидетельствует о нарушении технологии производства продукта. Данный образец содержал в составе глюконо дельта-лак-тон. Можно предположить, что процесс снижения значения pH на стадии осадки происходил слишком быстро и избыточно, что не дало развиться стартовой и индигенной микрофлоре и привело к её отмиранию.
Если анализировать видовой состав технологически значимой микрофлоры полусухих колбас, обнаруживается предпочтение к использованию стартовых культур, содержащих P. pentosaceus и S. carnosus. Так, из 19 рассмотренных наименований полусухих колбас, выработанных не по ГОСТ Р 55456-2013, в 13 обнаруживался вид P. pentosaceus и в 13 - S. carnosus. Всего было выявлено 16 наименований, в которых обнаруживался хотя бы один из этих видов. Хотя данные виды не характерны для микрофлоры мясного сырья, но их штаммы обладают более выраженными технологическими характеристиками относительно таких видов МКБ, как L. plantaum или нитрат-редуцирующих микроорганизмов, как S. xylosus. Так, в работе Ковентри с соавт. [21] P. pentosaceus показал лучшую динамику роста в экспериментальной выработке сырокопчёных колбас относительно L. plantarum. Ху c соавт. [23] в своей работе показали, что стартовые культуры, содержащие P. pentosaceus, в сочетании с типичными для традиционной микрофлоры МКБ, как L. sakei или L. curvatus и денитрифи-цироующим микроорганизмом S. xylo-sus, давали лучшее формирование цвета и летучих соединений. Ратанбури с соавт. [24] успешно использовали штамм
P. pentosaceus в качестве продуцента у-аминомасляной кислоты в составе стартовой культуры. Влияние S. car-nosus и S. xylosus на органолептические свойства сырокопчёных колбас проводил Олесен с соавт. [25]. Рассматриваемый ими штамм S. carnosus производил большее количество летучих соединений по сравнению с S. xylosus. Также было отмечено, что присутствие нитратов выраженно усиливало продукцию разветвлённых аминокислот и спиртов у S. carnosus.
Следует также отметить, что в качестве основной микрофлоры МКБ во всех образцах ожидаемо присутствовали представители филогенетической группы L. sakei. Однако микроорганизмы филогенетической группы L. plantarum присутствовали только в 5 из 28 образцов. Это объяснимо с учётом того, что L. plantarum как правило уступают по скорости роста культурам других видов [21].
Заключение
В данной работе мы предложили набор пар праймеров для анализа ПЦР в реальном времени микрофлоры сырокопчёных колбас на предмет соответствия требованиям ГОСТ Р 55456-2013 и ГОСТ Р 55456-2013. Было обосновано, что обнаружение микроорганизмов видов P. pentosaceus и S. carnosus указывают на применение стартовых культур в процессе производства сырокопчёных колбас. Выявление микроорганизмов филогенетических групп L. sakei и L. plantarum рассматривалось как показатель соблюдения технологических условий, благоприятных для развития стартовых культур.
С использованием разработанных праймеров был проведён мониторинг сырокопчёных и сыровяленых колбас, имеющихся на российском рынке. При этом были выявлены следующие несоответствия требованиям ГОСТ Р 554562013 и ГОСТ Р 55456-2013: использование микроорганизмов рода Staphylococcus при производстве полусухих колбас по ГОСТ Р 55456-2013; обозначение типа «сухая» для колбас, выработанных с применением стартовых культур; отсутствие МКБ в полусухой сырокопчёной колбасе с регулятором кислотности.
© КОНТАКТЫ:
Курбаков Константин Андреевич a homo_ludens@vniimp.ru
Коноров Евгений Андреевич a casqy@yandex.ru Минаев Михаил Юрьевич a m.minaev@fncps.ru
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: REFERENCES:
1. ГОСТ Р 55456-2013 «Колбасы сырокопчёные. Техни- GOST R55456-2013 «Kolbasy syrokopchonyye. Tekhniches-ческие условия». — Москва, 2014. kiye usloviya» [GOST R55456-2013 «Raw smoked sausages. Technical conditions»]. — Moskva, 2014.
2. ГОСТ 33708-2015 «Изделия колбасные сырокопчё- GOST 33708-2015 «Izdeliya kolbasnyye syrokopcho-ные и сыровяленые. Общие технические условия». - nyye i syrovyalenyye. Obshchiye tekhnicheskiye usloviya» Москва, 2016. [GOST 33708-2015 «Raw smoked and dry-cured sausage products. General technical conditions»]. - Moskva, 2016.
3. Aymerich, T. Microbial quality and direct PCR identification of lactic acid bacteria and nonpathogenic staphylococci from artisanal low-acid sausages / T. Aymerich, B. Martin, M. Garriga, M. Hugas //Applied and environmental microbiology. - 2003. - Т. 69. - № . 8. - P. 4583-4594. DOI: 10.1128/AEM.69.8.4583-4594.2003.
4. Cocolin, L. Culture independent methods to assess the diversity and dynamics of microbiota during food fermentation / L. Cocolin, V. Alessandria, P. Dolci, R. Gorra, K. Rantsiou // International journal of food microbiology. - 2013. -Т. 167. - № 1. - P. 29-43. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.05.008.
5. Daga, E.S. Traditional home-made dry sausages produced in Sardinia: a study of the microflora [PhD Thesis] / E.S. Daga // The University of Sassari, Sassari, Italy, 2013.
6. Fontan, M.C.G. Microbiological characteristics of «androlla», a Spanish traditional pork sausage / M.C.G. Fontan, J.M. Lorenzo, A. Parada, I. Franco, J. Carballo //Food Microbiology. - 2007. - Т. 24. - № . 1. - P. 52-58. DOI: 10.1016/j. fm.2006.03.007.
7. Greppi, A. Monitoring of the microbiota of fermented sausages by culture independent rRNA-based approaches / A. Greppi, I. Ferrocino, A. La Storia, K. Rantsiou, D. Ercolini, L. Cocolin // International Journal of Food Microbiology. -2015. - Т. 212. - P. 67-75. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2015.01.016.
8. Kozacinski, L. Investigation of microbial association of traditionally fermented sausages / L. Kozacinski, E. Drosinos, Faruk Caklovica, L. Cocolin, J. Gasparik-Reichardt, S. Veskovic // Food Technology and Biotechnology. — 2008. — T. 46. — № 1. — P. 93-106.
9. Mangia, N.P. Sardinian fermented sheep sausage: Microbial biodiversity resource for quality improvement / N.P. Man-gia, M.A. Murgia, M. Garau, R. Merella, P. Deiana // Options Méditerranéennes Series A. — 2008. — Т. 78. — P. 273-277.
10. Russo, R. Reliable identification of lactic acid bacteria by targeted and untargeted high-resolution tandem mass spectrometry / R. Russo, M. Valletta, C. Rega, R. Marasco, L. Muscariello, P.V. Pedone, M. Sacco, A. Chambery // Food chemistry. — 2019. — Т. 285. — P. 111-118. DOI: 10.1016/j.foodchem.2019.01.127.
11. Cardinali, F. Microbial dynamics of model Fabriano-like fermented sausages as affected by starter cultures, nitrates and nitrites / F. Cardinali, V. Milanovic, A. Osimani, L. Aquilanti, M. Taccari, C. Garofalo, S. Polverigiani, F. Clementi, E. Fran-ciosi, K. Tuohy, L. Mercuri, S. Altissimi, N. Haouet // International journal of food microbiology. — 2018. — Т. 278. — P. 61-72. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2018.04.032.
12. Li, P. Effect of bioaugmented inoculation on microbiota dynamics during solid-state fermentation of Daqu starter using autochthonous of Bacillus, Pediococcus, Wickerhamomyces and Saccharomycopsis / P. Li, W. Lin, X. Liu, X. Wang, X. Gan, L. Luo, W.-T. Lin // Food microbiology. — 2017. — Т. 61. — P. 83-92. DOI: 10.1016/j.fm.2016.09.004.
13. Курбаков, К.А. Методологические подходы к иден- Kurbakov, K.A. Metodologicheskiye podkhody k identifikat-тификации технологически значимой микрофло- sii tekhnologicheski znachimoy mikroflory syrokopchonykh ры сырокопчёных колбас с использованием ПЦР / kolbas s ispol'zovaniyem PTSR [Methodological approach-К.А. Курбаков, М.Ю. Минаев, Д.С. Батаева // Все es to identification of technologically significant microflo-о мясе. - 2014. - № 4. - С. 24-26. ra of raw smoked sausages with RT-PCR] / K.A. Kurbakov,
M.Yu. Minayev, D.S. Batayeva // Vsyo o myase. - 2014. -№ 4. - P. 24-26.
14. Chernukha, I.M. Detection and identification of S. carnosus in starter cultures using real time PCR and subsequent HRM analysis of amplification products / I.M. Chernukha, M. Yu. Minaev, K.A. Kurbakov, D.S. Bataeva // Procedia Food Science. - 2015. - Т. 5. - P. 38-41. DOI: 10.1016/j.profoo.2015.09.010.
15. GenBank®. Bethesda, MD, USA: National Center for Biotechnology Information (NCBI), US National Library of Medicine; 2017. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
16. Primer-BLAST. Bethesda, MD, USA: National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine; 2017. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi.
17. OligoAnalyzer 3.1, Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA; 2017. Available from: http://eu.idtdna.com/ calc/analyzer.
18. Huang, C.H. Application of the SNaPshot minisequencing assay to species identification in the Lactobacilluscasei group / C.-H. Huang, M.-T. Chang, M.-C. Huang, F.-L. Lee // Molecular and cellular probes. - 2011. - Т. 25. - № 4. - P. 153157. DOI: 10.1016/j.mcp.2011.03.002.
19. Torriani, S. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by recA gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene-derived primers / S. Torriani, G.E. Felis, F. Dellaglio // Applied and environmental microbiology. - 2001. - Т. 67. - № 8. - P. 3450-3454. DOI: 10.1128/AEM.67.8.3450-3454.2001.
20. Raghupathi, P.K. Genome sequence of Kocuria varians G6 isolated from a slaughterhouse in Denmark / P.K. Ragh-upathi, J. Herschend, H.L. R0der, S.J. S0rensen, M. Burm0lle // Genome announcements. - 2016. - Т. 4. - № 2. DOI: 10.1128/genomeA.00076-16.
21. Coventry, J. Growth characteristics of meat starter cultures / J. Coventry, M.W. Hickey // Meat Science. - 1991. -Т. 30. - № 1. - P. 41-48.
22. S0ndergaard, A.K. Growth and aroma production by Staphylococcus xylosus, S. carnosus and S. equorum - a comparative study in model systems / A.K. S0ndergaard, L.H. Stahnke // International journal of food microbiology. - 2002. -Т. 75. - № 1-2. - P. 99-109. DOI: 10.1016/S0168-1605(01)00729-2.
23. Hu, Y. Quality characteristics and flavor profile of Harbin dry sausages inoculated with lactic acid bacteria and Staphylococcus xylosus/ Y. Hu et al. // LWT. - 2019. - Т. 114. - P. 108392. DOI: 10.1016/j.lwt.2019.108392.
24. Ratanaburee, A. et al. Enhancement of y-aminobutyric acid (GABA) in Nham (Thai fermented pork sausage) using starter cultures of Lactobacillus namurensis NH2 and Pediococcus pentosaceus HN8 / A. Ratanaburee, D. Kantachote, W. Cha-rernjiratrakul, A. Sukhoom // International journal of food microbiology. - 2013. - Т. 167. - № 2. - P. 170-176. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.09.014.
25. Olesen, P.T. Generation of flavour compounds in fermented sausages - the influence of curing ingredients, Staphylococcus starter culture and ripening time / P.T. Olesen, A.S. Meyer, L.H. Stahnke // Meat science. - 2004. - Т. 66. - № 3. -P. 675-687. DOI: 10.1016/S03 09-1740(03)00189-X.
