CC BY
43УДК 632.938:578.834.1
DOI: 10.24412/1999-6780-2022-1-3-10
МОНИТОРИНГ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У РЕКОНВА-ЛЕСЦЕНТОВ COVID-19
Фролова Е.В. (зав. лаб.)*, Филиппова Л.В. (с.н.с., доцент), Учеваткина А.Е. (с.н.с.), Соловьева Г.И. (в.н.с.), Евсеева A.B. (клинический ординатор), Кривцун O.A. (клинический ординатор), Борзова Ю.В. (зав. клиникой, доцент), Шурпицкая O.A. (зав. лаб.), Тараски-на А.Е. (зав. лаб.), Соболев A.B. (профессор кафедры), Шабашова Н.В. (профессор кафедры)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
Ведущим патогенетическим механизмом заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2, является дисбаланс иммунного ответа, обусловленный нарушением цитоки-новой регуляции, в первую очередь недостаточным синтезом интерферонов. Этот npoifecc сопровождается последующей гиперпродукцией других провоспалителъных цитокинов, приводящей к выраженному воспалению с повреждением различных органов и тканей. Сведения об иммунологических последствиях новой коронавирусной инфекции для здоровья человека ограничены. Целью настоягцего исследования был мониторинг иммунологических показателей у больных, перенесших новую коронави-русную инфекцию в раннем и позднем периодах реконва-лесценции. В исследование включили 20 пациентов старше 18 лет с тяжелым и среднетяжелым течением COVID-19. Проводили исследование субпопуляций лимфоцитов, уровней интерферонов и IgG к SARS-CoV-2. На протяжении всего периода наблюдения у реконвалесцен-тов COVID-19 выявили снижение способности клеток крови к продукции IFNa и IFNy и уменьшение числа NK-клеток на фоне повышенного числа активированных CD4 CD25 CD127 Т-хелперов, NKT-клеток и уровней IgA по сравнению с показателями контрольной группы. Установлено, что все реконвалесценты через 8-9 месяг^ев после выписки из стационара жаловались на выраженную усталость. Сохраняющийся дисбаланс иммунологических показателей и нарушение оби/его самочувствия реконва-лесцентов COVID-19 является показанием для дальнейшего мониторирования иммунологических показателей и поиска персонифицированной иммунотропной терапии.
Ключевые слова: новая коронавирусная инфекция, SARS-CoV-2, реконвалесценты COVID-19, субпопуляции лимфоцитов, интерфероны, антитела, период реконвалес-ценции
* Контактное лицо: Фролова Екатерина Васильевна, e-mail: ekaterina.frolova@szgmu.ru
MONITORING OF IMMUNOLOGICAL PARAMETERS IN COVID-19 RECONVALESCENTS
Frolova E.V. (head of the laboratory), Filippova L.V. (senior scientific researcher, associate professor), Uchevatkina A.E. (senior scientific researcher), Solovieva G.I. (leading scientific researcher), Evseeva A.V. (clinical resident), Kriv-tsun O.A. (clinical resident), Borzova Yu.V. (head of the clinic, associate professor), Shur-pitskaya O.A. (head of the laboratory), Taraski-na A.E. (head of the laboratory), Sobolev A.V. (professor of the department), Shabashova N.V. (professor of the department)
North-Western State Medical University named after I.I. Mech-nikov, St. Petersburg, Russia
The leading pathogenetic mechanism of the disease caused by the SARS-CoV-2 virus is an imbalance of the immune response caused by a violation of cytokine regulation, primarily insufficient synthesis of interferons. This process is accompanied by subsequent hyperproduction of other pro-inflammatory cytokines, leading to severe inflammation with damage to various organs and tissues. Information on the immunological consequences of the new coronavirus infection for human health is limited. The aim of this study was to monitor immunological parameters in patients who had a new coronavirus infection in the early and late periods of reconva-lescence. The study included 20 patients over the age of 18 with severe and moderate COVID-19. lymphocyte subpopula-tions, interferon and IgG levels to SARS-CoV-2 were studied. During the entire observation period, COVID-19 reconvales-cents revealed a decrease in the ability of blood cells to produce IFNa and IFNy and a decrease in the number of NK cells against the background of an increased number of activated CD4+CD25+CD127+T helper cells, NKT cells and IgA levels compared with those of the control group.
It was found that all reconvalescents complained of severe fatigue 8-9 months after discharge from the hospital. The persistent imbalance of immunological indicators and the violation of the general well-being of COVID-19 reconvalescents is an indication for further monitoring of immunological indicators and the search for personalized immunotropic therapy.
Keywords: new coronavirus infection, MKRS-CoV-2, COVID-19 reconvalescents, lymphocyte subpopulations, interferons, antibodies, reconvalescence period
ВВЕДЕНИЕ
В 2019 г. идентифицирован и охарактеризован новый коронавирус SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Related Coronavirus 2), который явился причиной пандемии коронавирусной болезни-2019 (COVID-19 - Coronavirus Disease-2019) [1]. На 1 марта 2022 г. подтверждено более 437 млн. случаев заболевания COVID-19 и более 5,9 млн. смертей, что указывает на серьезную угрозу жизни и
здоровью населения мира [2]. Клинические проявления инфекции SARS-CoV-2 варьируют от бессимптомных и легких форм до крайне тяжелых с развитием острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), септического шока и полиорганной недостаточности [3]. Установлено, что различные симптомы, сопутствующие COVID-19, сохраняются долгое время у значительного числа выздоровевших пациентов [4]. Однако COVID-19 - это новое заболевание, и остается неопределенность в отношении возможных долгосрочных последствий для здоровья человека. Huang С. с соавт. показали, что через 6 месяцев после выписки из стационара реконвалесцен-тов COVID-19 в основном беспокоили усталость, мышечная слабость, проблемы со сном, тревога или депрессия [5]. В другой работе установлено, что ухудшение качества жизни после перенесенной инфекции было связано с пожилым возрастом, женским полом, тяжелым течением болезни. Наиболее распространенными симптомами были усталость, потливость, стеснение в груди, тревога и миалгия [6]. Мета-анализ 18 исследований, посвященных изучению состояния здоровья реконвалесцентов COVID-19 в течение одного года после перенесенного заболевания, показал, что наиболее частыми проявлениями были усталость/слабость (28%), одышка (18%), артромиалгии (26%), депрессия (23%), тревога (22%), потеря памяти (19%), затруднения с концентрацией внимания (18%) и бессонница (12%). Был сделан вывод, что год спустя у значительной части реконвалесцентов COVID-19 все еще имели место остаточные симптомы, связанные с перенесенной инфекцией [7]. Таким образом, вопрос о патофизиологических механизмах, которые лежат в основе влияния новой коронавирусной инфекции на состояние здоровья человека, остается открытым.
Знания, накопленные при исследовании имму-нопатогенеза SARS-CoV и MERS-CoV, свидетельствуют о том, что создание эффективных лекарственных и профилактических средств невозможно без расшифровки особенностей взаимодействия между коронавирусами и иммунными клетками макроорганизма. При коронавирусной инфекции выявлены нарушения в системе врожденного и адаптивного противовирусного иммунитета, интерфероно-генеза. Установлено, что дисбаланс различных субпопуляций Т-лимфоцитов сохраняется длительно и требует иммунотропной фармакокоррекции и реабилитации [8, 9]. Однако литературные данные, описывающие изменения иммунологических показателей в динамике после выписки из стационара реконвалесцентов COVID-19, немногочисленны, а время наблюдения варьировало от 4 недель после появления симптомов до 1 года после заражения SARS-CoV-2 [10-13].
Следовательно, реабилитация реконвалесцентов
COVID-19 должна быть комплексной, влияющей на все звенья патогенеза, в том числе иммунологические.
Цель данного исследования: провести мониторинг иммунологических показателей у пациентов, перенесших новую коронавирусную инфекцию в разные сроки периода реконвалесценции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В проспективное исследование включили 20 реконвалесцентов COVID-19, проходивших лечение и наблюдение на базе НИИ медицинской микологии СЗГМУ им. И.И. Мечникова в период с июля 2020 г. по май 2021 г. Среди обследованных было 48% мужчин и 52% женщин в возрасте от 42 до 77 лет (медиана - 57 (48-67)). У 16 (80%) реконвалесцентов диагностировали среднетяжелое течение COVID-19, у 4 (20%) - тяжелое [3]. Диагноз COVID-19 был установлен на основании положительного результата лабораторного исследования на наличие РНК SARS-CoV-2 с применением методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Группу сравнения составили 25 условно здоровых лиц (47% мужчин и 53% женщин) в возрасте от 21 до 68 лет (медиана — 43 года). Иммунологическое обследование проводили в динамике: первоначально через 23,0 дня (22,0-28,0) после госпитализации (ранний период реконвалесценции), повторно — в поздний период реконвалесценции через 8-9 месяцев от момента выздоровления.
Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови осуществляли методом 6-цветного цитофлуориметрического анализа с использованием проточного цитометра Navios™ (Beckman Coulter, США). Подготовку образцов периферической крови и настройку цитофлуориметра выполняли в соответствии с национальными рекомендациями [15]. Лимфоциты окрашивали меченными флуорохромами моноклональными антителами (Beckman Coulter, США) согласно рекомендациям производителя: CD45-PC5/5, CD4-FITC, CD8-ECD, CD3-APC, CD19-FITC, CD56-PC7 и CD25-PE (Beckman Coulter, США). После внесения антител образцы тщательно перемешивали, затем инкубировали при комнатной температуре 15 минут в защищенном от света месте. По завершении инкубации при постоянном перемешивании добавляли 500 мкл лизирующего раствора VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter, США), инкубировали еще 10 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. При цитомет-рическом анализе для каждого из образцов набирали не менее 5000 лимфоцитов. Полученные результаты проанализировали с помощью программного обеспечения Navios™ Software vi.2 (Beckman Coulter, США). Для дополнительной характеристики Т-клеточного звена иммунной системы вычисляли им-
мунорегуляторный индекс (ИРИ) — соотношение CD45CD3CD4/ CD45+CD3+CD8+.
Оценку Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) проводили методом проточной цитометрии при окрашивании лимфоцитов периферической крови моноклональными антителами CD4-FITC, CD 127-РС7 и CD25-PE (Beckman Coulter, США). Инкубацию осуществляли в тех же условиях, что и при 6-цветном анализе. После инкубации добавляли 500 мкл лизирующего раствора VersaLyse Lysing Solution и 12,5 мкл фиксирующего раствора Fixative Solution IOTest 3 (BeckmanCoulter, США). Через 10 минут инкубации при комнатной температуре в темноте образцы отмывали в 4 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 5 минут при 1500 оборотах в минуту, удаляли надосадок и восстанавливали лейкоцитарную взвесь в 400 мкл ФСБ. При цитометрическом анализе популяцию С04 Т-хелперов на основании позитивного/негативного гейтирования разделяли на CD4+CD25+CD127" Treg и CD4+CD25+CD127+ Т-хелперы активированные (Th act), получая их относительное количество (%).
Для исследования индуцированной продукции IFNy и IFNa использовали гепаринизированную кровь, разведенную в 5 раз полной питательной средой (ППС): среда RPMI 1640 с добавлением L-глутамина (Биолот, Россия), 200 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия). Для индуцированной продукции интерфе-ронов в лунки планшета вносили по 100 мкл разведенной крови и добавляли 100 мкл рабочего раствора фитогемагглютинина-П (ФГА-П) (ПанЭко, Россия) в конечной дозе 25 мкг/мл или 5 мкл вируса болезни Ньюкасла (цитолитический титр 1/256, ФГУ НИИ гриппа им. A.A. Смородинцева, Россия). Планшеты с исследуемыми образцами культивировали при 37 °С в атмосфере 5% С02 в С02-инкубаторе (Sanyo МСО-5 АС, Япония). Через 24 часа супернатанты отбирали и хранили при -20 °С. Концентрацию интерферонов в супернатантах определяли с помощью коммерческих иммунофермент-ных тест-систем в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (Вектор-Бест, Россия). Измерения оптической плотности проводили с использованием планшетного фотометра (HumaReader HS, Германия).
Уровень общих иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови исследовали иммунотурбодимет-рическим методом с применением коммерческих наборов (Vital, Россия). Иммуноглобулины класса G к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «SARS-CoV-2 IgG» (научно-производственная фирма ЛИТЕХ, Россия), предназначенного для качественного выявления иммуноглобулинов. Содержание иммуноглобулинов
класса G к коронавирусу SARS-CoV-2 расценивали как положительное при КП (индекс антител) >1,1.
Уровень патологической усталости оценивали с помощью «шкалы оценки усталости» — Fatigue Assessment Scale (FAS) [16]. Шкала FAS разработана группой нидерландских исследователей под руководством H.J. Michielsen и обладает высокой надежностью и доказанной эффективностью при исследовании усталости у пациентов с широким спектром заболеваний, а также у здоровых людей [17]. Шкала FAS состоит из 10 вопросов, из них 5 вопросов психической усталости и 5 — физической. Результаты опросника подсчитываются суммированием баллов, которые могут колебаться от 10 до 50. При показателе 22 балла и выше можно говорить о наличии у пациента синдрома патологической усталости. Также оценивали нарушение сна, выпадение волос, болевые ощущения, субфебрильную температуру, анос-мию, нарушение когнитивных функций и другие показатели общего самочувствия.
Полученные результаты обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA for Windows (версия 10). Данные представляли в виде медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей, Q2j и Q75). Для оценки различий между независимыми выборками применяли непараметрический критерий Манна-Уитни, между зависимыми выборками — критерий Вилкоксона. Достоверными различиями сравниваемых параметров считали значения р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Известно, что в ответ на инфицирование SARS-CoV-2 в организме развиваются защитные реакции, обусловленные активацией врожденного и приобретенного иммунитета [4, 9]. В нашем исследовании в ранний и поздний периоды выздоровления у рекон-валесцентов COVID-19 не установлено статистически значимых различий в абсолютном количестве лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов по сравнению с контрольными показателями (табл.1). Во многих исследованиях авторы сообщают о лимфоцито-пении после заражения SARS-CoV-2 в острый период заболевания при тяжелом течении заболевания [18-22]. Однако у пациентов с более легким течением COVID-19 количество лимфоцитов оставалось в пределах нормы [12].
Сравнительный анализ числа С04 Т-хелперов и цитотоксических CD8 Т-лимфоцитов на протяжении всего периода наблюдения также не выявил достоверных отличий от показателей контрольной группы (табл.1).
Таблица 1
Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов крови у реконвалесцентов COVID-19 (п=20)
Примечание. Представлены медианные значения с интерквар-тильным размахом Me (Q25-Q75): 1 - ранний период реконвалес-ценции; 2 - поздний период реконвалесценции. Статистически значимые различия по сравнению с контролем (условно здоровые) выявлены с использованием критерия Манн-Уитни (*р < 0,001).
Известно, что Т-клетки играют важную роль в клеточно-оиосредованном иммунном ответе на вирусную инфекцию и связаны с тяжестью течения COVID-19 [10-13]. CD4 Т-хслпсры способствуют выработке антител В-клетками и поддерживают ци-тотоксическую активность CD8 Т-клеток. Цитоток-сические CD8 Т-клетки способны непосредственно распознавать вирусные пептиды, которые представлены на поверхности инфицированных клеток, вызывая апоптоз и предотвращая дальнейшее распространение вируса. Согласно недавнему исследованию, при прогрессировании заболевания наименьшее число В-клеток и CD4 Т-хелперов обнаруживается на второй неделе, цитотоксических CD8 Т-лимфоцитов — на третьей неделе после появления симптомов новой коронавирусной инфекции. По мере выздоровления число Т-клеток постепенно вос-
станавливалось, но длительно сохранялись признаки истощения цитотоксических CD8 Т-лимфоцитов у реконвалесцентов тяжелой формы COVID-19 [19]. В других работах у реконвалесцентов COVID-19, перенесших тяжелую форму инфекции, выявлена устойчивая лимфопения со снижением числа основных субпопуляций Т-клеток [21-23]. Нами также было установлено снижение числа CD4 Т-хелперов и CD8 Т-клеток на ранней стадии выздоровления у больных тяжелой формой COVID-19 [24]. Однако полученные отличия в содержании основных имму-норегуляторных клеток в данном исследовании можно объяснить тем, что большинство реконвалесцентов COVID-19 (80%) перенесли инфекцию в среднетяжелой форме.
Считается, что NK-клетки совместно с цитоток-сическими Т-лимфоцитами играют ключевую роль в уничтожении вирусов при респираторных инфекциях за счет прямой цитотоксичности и секреции цито-кинов. Однако точная роль этих клеток в защите от SARS-CoV-2 и патофизиологии заболевания не определена [9]. В нашем исследовании выявлено устойчивое снижение относительного (р<0,001) и абсолютного числа NK-клеток (р<0,001, р<0,05 соответственно) по сравнению с контрольными показателями как в раннем периоде реконвалесценции, так и через 8-9 месяцев после выписки (Рис.1 А). Полученные данные совпадают с результатами других авторов, которые установили как снижение числа NK-клеток, так и признаки истощения их цитотокси-ческой активности на фоне повышенной продукции цитокинов в острую фазу заболевания и у реконвалесцентов COVID-19 [23, 25]. До сих пор неясно, связано ли снижение числа NK-клеток с их гибелью в результате действия SARS-CoV-2 или с проникновением воспалительных NK-клеток в легочную ткань. Однако маловероятно, что SARS-CoV-2 непосредственно вызывает гибель NK-клеток, подобно тому, как это установлено при гриппе [26]. Особенностью фенотипа NK-клеток пациентов и реконвалесцентов COVID-19 была повышенная экспрессия различных регуляторных молекул, таких как PD-1, CD244 (также известный как 2В4), CD39, NKG2A, на фоне снижения уровней цитотоксических эффектор-ных молекул, включая гранзим А и перфорин [27-29]. Считается, что данный фенотип клеток свидетельствует об истощении цитотоксического потенциала NK-клеток. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования для определения причин снижения количества и функциональной активности NK-клеток у пациентов с COVID-19.
Интерфероны I типа (IFN) обеспечивают первую линию защиты, предотвращая распространение вирусной инфекции. При исследовании в динамике выявлено ослабление способности клеток крови реконвалесцентов COVID-19 к синтезу IFNa. По-
Показатели Группы
Условно здоровые Реконвалесценты COVID-19
1 2
Лейкоциты х109/л 5,70 (5,30-6,30) 5,90 (4,60-9,15) 6,20 (5,00-7,20)
Лимфоциты % 36,00 (34,00-37,00) 38,00 (30,00-45,50) 39,00 (33,00-51,00)
х109/л 1,98 (1,89-2,28) 2,21 (1,87-3,32) 2,29* (2,14-2,95)
Нейтрофилы % 54,00 (50,00-59,00) 55,00 (40,00-60,00) 51,00 (43,00-58,00)
х109/л 3,07 (2,65-3,72) 3,24 (1,43-5,24) 3,27 (2,15-3,67)
Т-лимфоциты CD3+CD19- % 76,00 (70,00-77,00) 76,50 (73,50-78,50) 73,00 (60,00-79,00)
х109/л 1,48 (1,32-1,65) 1,73 (1,44-2,44) 1,63 (1,47-1,70)
Т-хелперы CD3* CD4* % 45,00 (42,00-49,00) 50,00 (43,00-58,00) 41,00 (30,00-53,00)
х109/л 0,88 (0,83-1,01) 1,04 (0,90-1,83) 0,91 (0,85-1,22)
Т-цит CD3+CD8+ % 26,00 (24,00-29,00) 22,50 (20,00-27,00) 23,00 (20,00-33,00)
х109/л 0,54 (0,45-0,63) 0,51 (0,42-0,83) 0,56 (0,43-0,75)
В-лимфоциты CD3CD19+ % 11,00 (10,00-13,00) 11,50 (7,30-16,00) 9,00 (7,00-17,00)
х109/л 0,23 (0,19-0,29) 0,26 (0,13-0,56) 0,22 (0,16-0,40)
ИРИ 1,70 (1,60-1,90) 2,20 (1,55-2,95) 1,60 (1,00-3,00)
казатели продукции IFNa на раннем сроке выздоровления от COVID-19 были достоверно ниже контрольных цифр (р<0,001) (Рис. 1В). При повторном обследовании уровень IFNa был достоверно выше, чем при первичном наблюдении, но не достигал контрольных значений (р<0,001) (Рис. 1В). Полученные данные свидетельствуют о существенном угнетении интерфероногенеза у реципиентов COVID-19 на позднем сроке выздоровления, что согласуется с результатами других авторов, которые продемонстрировали, что у тяжелобольных пациентов с COVID-19 имеет место низкое содержание IFNa на фоне высоких уровней провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-а [30]. В другом исследовании также было показано, что SARS-CoV-2, как и SARS-CoV, подавляет синтез IFN 1-го и 3-го типов, что приводит к повышенной выработке IL-6, IL-lRa, хемокинов CXCL2 и CXCL8, способствующих привлечению различных иммунных клеток в очаг инфекции [31]. Lucas С. и соавторы показали, что даже у пациентов с легкими течением COVID-19 снижены уровни IFN 1-го и 3-го типов [32].
IFNy является ключевым цитокином Т-хелперов 1-го типа (Thl), которые играют главную роль в предотвращении вирусных инфекций. Большинство Т-лимфоцитов при инфекции SARS-CoV-2 превращаются в клетки Thl [4]. В нашем исследовании установлено, что показатели продукции IFNy не различалась между собой на раннем и позднем сроках реконвалесценции после перенесенного COVID-19 (р=0,182), но были достоверно ниже контрольных значений (р<0,001) (Рис. 1В). Наши данные согласуются с результатами других авторов, которые установили, что у пациентов с COVID-19 количество CD4+ и С08+Т-клеток, секретирующих IFNy, существенно снижено по сравнению с контрольной группой [32, 33]. Эти результаты указывают на функциональное истощение цитотоксических CD8+T-лимфоцитов, которое сохраняется и после выздоровления. Ситдикова Т.С. с соавт. обнаружили, что у пациентов с COVID-19 в период реконвалесценции сохраняется низкое содержание в сыворотке крови IFN -у и отмечается дисбаланс регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов за счет снижения числа CD8 Т-клеток [34]. Таким образом, можно сделать вывод, что SARS-CoV-2 вызывает нарушение регуляции как врожденного, так и приобретенного иммунитета, модулируя ответы, опосредованные IFN 1 -го и 2-го типов.
Напротив, при мониторинге иммунных показателей установлено, что повышенное относительное и абсолютное число NKT-клеток сохраняется длительное время у реконвалесцентов новой коронавирус-ной инфекции (р<0,05) (Рис. 1С). Считается, что NKT-клетки способны продуцировать широкий спектр цитокинов и играют регуляторную роль при
различных иммунопатологических процессах. Тем не менее, данные о значении NKT-клетки в патогенезе новой коронавирусной инфекции ограничены [9]. Возможно, повышенное число NKT-клеток в циркуляции стремится ограничить длительно сохраняющийся воспалительный процесс у реконвалесцентов COVID-19 или выполняет заместительную роль при дефиците других цитотоксических клеток.
Среди Т-хелперов регуляторные Т-клетки (Treg) играют важную роль в поддержании иммунной толерантности и уменьшении выраженности инфекци-онно-воспалительного повреждения тканей [8]. Отмечено снижение числа Treg у пациентов с тяжелым течением COVID-19 [35]. В нашем исследовании не выявлено изменений в числе Treg на раннем и позднем сроках выздоровления больных C0VID-19 (Рис. 1D), что согласуется с результатами других авторов [11]. Однако установлено достоверно более высокое абсолютное число активированных Т-хелперов (Th act) по сравнению с показателями условно здоровых лиц (р<0,05) (Рис. 1Е), что также может являться признаком ослабления контроля над воспалительным процессом и возможностью перехода инфекционного процесса в хроническую стадию.
При оценке гуморального иммунного ответа не обнаружено достоверных различий в содержании В-лимфоцитов у реконвалесцентов COVID-19 по сравнению с контрольными показателями (табл. 1). Уровень общих IgA был выше нормативных значений на позднем сроке реконвалесценции (р<0,001). Уровень общих IgG был достоверно выше при повторном обследовании реконвалесцентов COVID-19 в сопоставлении с базовыми показателями (р<0,05) (Phc.IF).
Содержание иммуноглобулинов G к SARS-CoV-2 в сыворотке крови достоверно увеличилось у реконвалесцентов COVID-19 в сравнении с ранним периодом выздоровления (р<0,05) (Рис. 1G).
Полученные данные свидетельствуют о снижении числа NK-клеток и истощении способности клеток крови к продукции интерферонов на фоне повышенного числа NKT-клеток, Th act, уровней IgA и IgG у реконвалесцентов COVID-19. Изменение этих параметров указывает на угнетение механизмов врожденного и приобретенного противовирусного иммунитета и возможного формирования и/или активации хронической воспалительной патологии у людей, перенесших новую коронавирусную инфекцию.
20 15
* *
*
-rti г+ =1 1
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 О
14
12 10
5
6 4 2 О
N К (CD3-CD56+) % NK (CD3-CD56+) 10х9/л (xlOO)
■ 1 □ 2 □ контроль
э±[
=и±
IFN-a пг/мл И1 D2 DK0HTp0/lb
IFN-y пг/мл
NKT(CD3+CD56+)% NKT (CD3+CD56+) 10х9/л (xlOO)
■ 1 □ 2 □ контроль
T reg (CD4+CD25+CD127-) % Т reg (CD4+CD25+CD127-) 10х9/л (xlOO) ■ 1 D2 □ контроль
18 16 14 12 10
3 6
4 2 О
Th act (CD4+CD25+CD127+)» Th act(CD4+CD25+CD127+) 10х9/л (xlOO)
■ 1 □ 2 □ контроль
1-**-
* 1
* ш
IgA г/л IgG г/л
■ 1 D2 □ контроль
**
индекс AT SARS-CoV-2 IgG ■ 1 Ш2
Рис. 1. Динамика иммунологических показателей у реконвалес-центов COVID-19 (п=20). Представлены медианные значения с интерквартильным размахом Ме (Q25-Q75): 1 - ранний период реконвалесценции; 2 - поздний период реконвалесценции. А -NK-клетки CD3"CD56+, В - уровни продукции IFNa и IFNy, С -NKT-клетки CD3+CD56+, D - Treg CD4+CD25+CD127", Е - Th act CD4*CD25*CD127*, F - уровни общих IgA и IgG, G - индекс AT SARS-CoV-2 IgG. Статистически значимые различия по сравнению с контролем выявлены с использованием критерия Манн-Уитни (* - р < 0,05), в зависимых группах - по Вилкоксону (** - р < 0,05).
Результаты анкетирования с помощью опросника FAS показали, что все реконвалесценты через 8-9 месяцев после выписки из стационара жаловались на выраженную усталость (больше 28 баллов), что со-
гласуется с результатами, полученными другими авторами [5, 7]. При клиническом наблюдении выявили, что в 75% случаев у реконвалесцентов СОУШ-19 отмечалось нарушение сна, в 60% - болевые ощущения, в 40% — выпадение волос, в 20% — когнитивные нарушения и аносмия. Субфебрильная температура установлена у 4 человек (20%), что согласуется с выявленными нарушениями иммунных показателей.
Таким образом, иммунологические признаки хронического воспалительного процесса и нарушения состояния здоровья у части реконвалесцентов СОУШ-19 могут служить обоснованием для проведения дальнейшего наблюдения и оценки отсроченных последствий перенесенной инфекции, в том числе влияния на течение уже имеющейся до инфекции хронической воспалительной патологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Huang С., Wang Y., Li X., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 2020; 395(10223): 497-506. doi: 10.1016/SO 140-6736(20)30183-5.
2. COVID-19 Dashboard by the Center for Systems Science and Engineering (CSSE) at Johns Hopkins University (JHU) https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/dashboards/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ). Коронавирус (COVID-19) Информационная панель (по состоянию на 17 января 2022 г.). Доступно онлайн: https://covidl9.who.int/
3. Временные методические рекомендации «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)». Версия 15 (22.02.2022). [Temporary guidelines "Prevention, diagnosis and treatment of new coronavirus infection (COVID-19)". Version 15 (02/22/2022). (In Russ.)].
4. Bhardwaj A., Sapra /.., Saini Ch. et al. COVID-19: Immunology, Immunopathogenesis and Potential Therapies. International Reviews of Immunology. 2022; 41 (2): 171-206. doi: 10.1080/08830185.2021.1883600
5. Huang C., Huang L., Wang Y., et al 6-month consequences of COVID-19 in patients discharged from hospital: a cohort study. Lancet. 2021; 397 (10270): 220-232. doi: 10.1016/S0140-6736(20)32656-8
6. Zhang X., Wang F., Shen Y., et al. Symptoms and health outcomes among survivors of COVID-19 infection 1 year after discharge from hospitals in Wuhan, China. JAMA Netw Open. 2021; 4 (9): e2127403. doi: 10.1001/j amanetworkopen.2021.27403
7. Han Q., Zheng В., Daines /.. , Sheikh A. Long-Term Sequelae of COVID-19: A systematic review and meta-analysis of one-year follow-up studies on post-COVID symptoms. Pathogens. 2022; 11 (2): 269. doi: 10.3390/pathogensl 1020269
8. Иванова И.А., Омелъченко Н.Д., Филиппенко A.B. и др. Роль клеточного звена иммунитета в формировании иммунного ответа при коронавирусных инфекциях. Медицинская иммунология. 2021; 23 (6): 1229-1238. [Ivanova I.A., Omelchenko N.D., Filippenko A.V., et al. Role of the cellular immunity in the formation of the immune response in coronavirus infections. Medical Immunology (Russia). 2021; 23 (6): 1229-1238. (In Russ.)] https://doi.org/10.15789/1563-0625-ROT-2302
9. Ahmadi E., Bagherpour Z., Zarei E., et al. A. Pathological effects of SARS-CoV-2 on hematological and immunological cells: Alterations in count, morphology, and function. Pathol. Res. Pract. 2022; 231: 153782. doi: 10.1016/j.prp.2022.153782
10. Xiong L., Li Q., Cao X., et al. Dynamic changes of functional fitness, antibodies to SARS-CoV-2 and immunological indicators within 1 year after discharge in Chinese health care workers with severe COVID-19: a cohort study. BMC Med. 2021; 19(1): 163. doi: 10.1186/s 12916-021-02042-0
11. Mathew I)., Giles J.R., Baxter A.E., et al. Deep immune profiling of COVID-19 patients reveals distinct immuno-types with therapeutic implications. Science. 2020; 369 (6508): eabc8511. doi: 10.1126/science.abc851
12. Liu Y., Tan W., Chen H., et al. Dynamic changes in lymphocyte subsets and parallel cytokine levels in patients with severe and critical COVID-19. BMC Infect. Dis. 2021; 21 (1): 79. doi: 10.1186/s 12879-021-05792-7
13. Zhao В., Zhong M., Yang Q., et al. Alterations in phenotypes and responses of T cells within 6 months of recovery from COVID-19: a cohort study. Virol Sin. 2021; 1-10. doi: 10.1007/sl2250-021-00348-0
14. Костинов М.П. Иммунопатогенные свойства SARS-CoV-2 как основа для выбора патогенетической терапии. Иммунология. 2020; 41 (1): 83-93. [Kostinov М.Р. Immunopathogenic properties of SARS-CoV-2 as a basis for the choice of pathogenetic therapy. Immunology. 2020; 41 (1): 83-93 (In Russ.)]. doi: 10.33029/0206-4952-2020-41-1-83-91
15. Хайдуков С.В., Байдун JI.A., Зурочка A.B. и др. Стандартизованная технология «Исследование субпопуляци-онного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов» (Проект). Медицинская иммунология. 2012; 14(3): 255-268. [Khaydukov S.V., Baidun L.A., Zurochka A.V., et al. Standardized technology "Study of the subpopulation composition of peripheral blood lymphocytes using flow cytofluo-rimeters-analyzers" (Project). Medical immunology. 2012; 14 (3): 255-268 (In Russ.)]. doi:10.15789/1563-0625-2012-3-255-268.
16. Бикбулатова Л.Ф., Кутлубаев М.А., Ахмадеева JI.P. и др. Шкала оценки усталости: перевод на русский язык, адаптация и оценка психометрических свойств в стационарах клиник неврологии и терапии. Медицинский вестник Башкортостана. 2012; 7 (1): 37-42. [Bikbulatova L.F., Kutlubaev М.А., Akhmadeeva L.R., et al. Fatigue assessment scale: translation into Russian, adaptation and evaluation of psychometric properties in hospitals of neurology and therapy clinics. Medical Bulletin of Bashkortostan. 2012; 7 (1): 37-42 (In Russ.)].
17. Vries J.D., Michielsen H.J., Van Heck G.L. Assessment of fatigue among working people: A comparison of six questionnaires. Occup. Environ. Med. 2003; 60 (1): il0-5. doi:10.1136/oem.60.suppl_l.il0
18. Liu J., Li S., Liu J., et al. Longitudinal characteristics of lymphocyte responses and cytokine profiles in the peripheral blood of SARS-CoV-2 infected patients. eBio Medicine. 2020; 55 (102763). doi: 10.1016/j.ebiom.2020.102763
19. Yu X., Yang R. Changes of peripheral lymphocyte subset in patients with SARS- CoV-2 infection during the whole course of disease. Expert Rev. Respir. Med. 2021; 15: 553-559. doi: 10.1080/17476348.2021.1866991
20. Cantenys-Molina S., Fernandez-Cruz E., Francos P., et al. Lymphocyte subsets early predict mortality in a large series of hospitalized COVID-19 patients in Spain. Clin. Exp. Immunol. 2021; 203: 424-432. doi: 10.111 l/cei.13547
21. Gil-Etayo F.J., Suarez-Fernandez P., Cabrera-Marante ()., et al. T-helper cell subset response is a determining factor in COVID-19 progression. Front. Cell Infect. Microbiol. 2021; 11: 624483.doi: 10.3389/fcimb.2021.624483
22. Han M., Xu M, Zhang Y., et al. Assessing SARS-CoV-2 RNA levels and lymphocyte/T cell counts in COVID-19 patients revealed initial immune status as a major determinant of disease severity. Med. Microbiol. Immunol. 2020; 209: 657-668. doi:10.1007/s00430-020-00693-z
23. Jiang К, Wei X., Guan J., et al. COVID-19 pneumonia: CD8 (+) T and NK cells are decreased in number but compensatory increased in cytotoxic potential, Clin. Immunol. 2020; 218108516. doi: 10.1016/j.clim.2020.108516
24. Фролова E.B., Филиппова Л.В., Учеваткина А.В. и др. Иммунологические особенности пациентов с COVID-19 в зависимости от степени тяжести заболевания. Проблемы медицинской микологии. 2021; 23 (1): 1-13. [Frolova E.V., Filippova L.V., Uchevatkina A.V., et al. Immunological features of patients with COVID-19 depending on the severity of the disease. Problems in Medical Mycology. 2021; 23 (1): 1-13 (In Russ.)]. doi: 10.24412/1999-6780-2021-1-3-13.
25. Yan /.., Cai B, Li Y., et al. Dynamics of NK, CD8 and Tfli cell mediated the production of cytokines and antiviral antibodies in Chinese patients with moderate COVID-19. J. Cell. Mol. Med. 2020; 24: 14270-14279. doi: 10.111 l/jcmm.16044
26. Mao H., Tu W., Qin G., et al. Influenza virus directly infects human natural killer cells and induces cell apoptosis. J. Virol. 2009; 83: 9215-9222. doi: 10.1128/JVI.00805-09
27. Travaglini K.J., Nabhan A.N., Penland /.., et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 2020; 587 (7835): 619-625. doi: 10.103 8/s415 86-020-2922-4.
28. Li M., Guo W., Dong Y., el al. Elevated exhaustion levels of NK and CD8+ T cells as indicators for progression and prognosis of COVID-19 disease. Front. Immunol. 2020; 11:580237. doi:10.3389/fimmu.2020.580237. eCollection 2020.
29. Zheng M., Gao Y., Wang G., et al. Functional exhaustion of antiviral lymphocytesin COVID-19 patients. Cell Mol. Immunol. 2020; 17: 533-535. doi: 10.1038/s41423-020-0402-2
30. Hadjadj J., Yatim N., Barnabei /.., et al. Impaired type I interferon activity and exacerbated inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science. 2020; 369 (6504): 718-724. doi:10.1126/scienceabc6027
31. Blanco-Melo I)., Nilsson-Payant B.E., Liu W-C., et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2drives development of COVID-19. Cell. 2020; 181 (5): 1036-1045.e9. doi:10.1016/j.cell.2020.04.026
32. Lucas C., Wong P., Klein J., et al. Longitudinal analyses reveal immunological misfiring in severe COVID-19. Nature. 2020; 584 (7821): 463-469. doi:10.1038/s41586- 020-2588-y
33. Zheng M., Gao Y., Wang G., et al. Functional exhaustion of antiviral lymphocytes in COVID-19 patients. Cell Mol. Immunol. 2020; 17 (5): 533-535. doi:10.1038/s41423-020-0402-2
34. Ситдикова T.C., Кабиева A.A., Просекова E.B. Показатели врожденного и адаптивного иммунитета пациентов при вирусной инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2. Российский иммунологический журнал. 2021; 24(4): 547-554. [Sitdikova T.S., Kabaeva А.А., Prosekova E.V. Indicators of innate and adaptive immunity of patients with viral infection caused by SARS-CoV-2 coronavirus. Russian Immunological Journal. 2021; 24 (4): 547-554 (In Russ.)]. doi: 10.46235/1028-7221-1051-Ю1
35. Qin C., Zhou /.., Ни Z., et al. Dysregulation of immune response in patients with coronavirus 2019 (COVID-19) in Wuhan, China. Clin. Infect. Dis. 2020; 71 (15): 762-768. doi: 10.1093/cid/ciaa248
Поступила в редакцию журнала 25.03.2022 Рецензенты: Е.П. Киселева, О.В. Шадривова
