CC BY
116
$
Клин. онкогематол. 2015; 8(3): 309-320
ГЕМАТОЛОГИЯ
Klin. Onkogematol. 2015; 8(3): 309-320
|^|
HEMATOLOGY
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КОСТНОГО МОЗГА
BONE MARROW TRANSPLANTATION
Молекулярный мониторинг течения острых миелоидных лейкозов по уровню экспрессии гена WT1 после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
Н.Н. Мамаев, АВ. Горбунова, И.М. Бархатов,
ЯВ. Гудожникова, ТЛ. Гиндина, ВА. Катерина,
Е.В. Волчков, АЛ. Алянский, ЕВ. Бабенко, ОА. Слесарчук, Н.В. Станчева, С.Н. Бондаренко, Б.В. Афанасьев
НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, ул. Льва Толстого, д. 6/8, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197022
__________________РЕФЕРАТ______________________
Цель. Оценить возможности серийного определения уровня экспрессии гена WT1 для предсказания и диагностики посттрансплантационных рецидивов острых миелоидных лейкозов (ОМЛ).
Методы. С помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени проведено серийное измерение уровня экспрессии гена WT1 в посттрансплантационный период у 34 больных ОМЛ. Всем 34 пациентам выполнена аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток: неродственная (n = 22), родственная (n = 12), в т. ч. гаплоидентичная (n = 4). У 5 из 34 больных имел место ОМЛ как результат трансформации мие-лодиспластических синдромов. Параллельно оценивали уровень донорского химеризма и количество бластных клеток в костном мозге и крови. У 8 больных определяли уровень экспрессии генов AML1/ETO (n = 4) и EVI1 (n = 4), результаты были сопоставлены с таковыми гена WT1. Результаты. На основании изучения данных по экспрессии гена WT1 выделены две равные группы. Группу 1 составили пациенты со стойкой нормальной экспрессией изученного молекулярного показателя в посттрансплантационный период, а 2-ю — с его нарушенной экспрессией. Исходный уровень экспрессии гена WT1 практически не зависел от морфоцитохимического и цитогенетического вариантов ОМЛ. В посттрансплантационный период уровень экспрессии коррелировал с таковым генов AML1/ETO и EVI1. Повышение экспрессии гена WT1 часто значительно опережало характерное для посттрансплантационных рецидивов ОМЛ снижение уровня донорского химеризма и нарастание содержания бластных клеток в костном мозге и крови. Заключение. Повышенный уровень экспрессии гена WT1 может служить не только маркером своевременной диагностики посттрансплантационных рецидивов у больных ОМЛ, но и мониторинговым тестом качества их лечения.
Molecular Monitoring of WT1 Gene Expression Level in Acute Myeloid Leukemias after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation
N.N. Mamaev, A.V. Gorbunova, I.M. Barkhatov,
Ya.V. Gudozhnikova, TL. Gindina, VA. Katerina,
E.V. Volchkov,AL. Alyanskii, E.V. Babenko, OA. Slesarchuk, N.V. Stancheva, SN. Bondarenko, B.V. Afanas’ev
R.M. Gorbacheva Scientific Research Institute of Pediatric Oncology Hematology and Transplantation; Academician I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University, 6/8 L’va Tolstogo str., Saint Petersburg, Russian Federation, 197022
____________________ABSTRACT__________________________
Objective. To evaluate the possibility of serial analysis of WT1 gene expression level for prediction and diagnosis of posttransplant acute myeloid leukemia (AML) relapses.
Methods. Serial analyses of WT1 gene expression were performed using quantitative real-time PCR during the post-transplant period of 34 patients with AML. All patients underwent allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: unrelated (n = 22), related (n = 12), including haploidentical (n = 4). Five of 34 patients had AML transformed from the myelodysplastic syndromes (MDS). In addition, the level of donor chimerism and the bone marrow/peripheral blood blast cells counts were evaluated. AML1/ETO (n = 4) or EVI1 (n = 4) gene expression degrees were measured in 8 patients in order to compare those with the WT1 gene expression.
Results. Based on obtained data on the WT1 gene expression, two equal subgroups of patients were formed. The first one consisted of patients with stable normal expression of the investigated molecular indicator during the post-transplant period, whereas the second group consisted of patients with impaired expression. The initial level of WT1 gene expression almost did not depend on both cytological and cytogenetic AML subtypes. During the post-transplant period, the WT1 gene expression degree correlated with that of AML1/ ETO or EVI1. Increased WT1 gene expression takes the lead over the decreased donor chimerism and blast cell count increase in bone marrow and blood typical for post-transplant relapses of AML.
Conclusion. The higher level of WT1 gene expression may serve not only as a marker for timely diagnosis of post-transplant relapses in AML patients, but also as a monitoring parameter for testing their treatment quality.
© 2015 практическая медицина
309
ONCO_3_2015.indd Sec3:309
27.08.2015 10:26:10
$
Н.Н. Мамаев и др.
Ключевые слова: острые миелоидные лейкозы, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, мониторинг экспрессии генов WT1, AML1/ETO и EVI1, диагностика посттрансплантационных рецидивов, молекулярный контроль лечения.
Получено: 19 марта 2015 г.
Принято в печать: 1 июня 2015 г.
Для переписки: Николай Николаевич Мамаев, д-р мед. наук, профессор, ул. Льва Толстого, д. 6/8, Санкт-Петербург,
Российская Федерация, 197022; тел.: +7(812)233-12-43; e-mail: nikmamaev524@gmail.com
Для цитирования: Мамаев Н.Н., Горбунова А.В., Бархатов И.М., Гудожникова Я.В., Гиндина Т.Л., Катерина В.А., Волчков Е.В., Алянский А.Л., Бабенко Е.В., Слесарчук О.А., Станчева Н.В., Бондаренко С.Н., Афанасьев Б.В. Молекулярный мониторинг течения острых миелоидных лейкозов по уровню экспрессии гена WT1 после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Клин. онкогематол. 2015; 8(3): 309-320.
Keywords: acute myeloid leukemias, hematopoietic stem cell transplantation, WT1 gene expression monitoring, AML1/ETO and EVI1, diagnosis of post-transplant relapses, molecular monitoring of treatment.
Received: March 19, 2015 Accepted: June 1, 2015
For correspondence: Nikolai Nikolaevich Mamaev, DSci,
Professor, 6/8 L’va Tolstogo str., Saint Petersburg, Russian Federation, 197022; Tel.: +7(812)233-12-43; e-mail: nikmamaev524@gmail.com
For citation: Mamaev N.N., Gorbunova A.V., Barkhatov I.M., Gudozhnikova Ya.V., Gindina T.L., Katerina V.A., Volchkov E.V., Alyanskii A.L., Babenko E.V., Slesarchuk O.A., Stancheva N.V., Bondarenko S.N., Afanas’ev B.V. Molecular Monitoring of WT1 Gene Expression Level in Acute Myeloid Leukemias after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation.
Klin. Onkogematol. 2015; 8(3): 309-320. (In Russ.)
ВВЕДЕНИЕ
Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) представляют собой гетерогенную группу заболеваний крови с различными генетическими, эпигенетическими и транскрипционными характеристиками, что затрудняет распознавание их после химиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) стандартными молекулярными и цитогенетическими методами [1]. Характерные для них некоторые мутации присущи лишь небольшой когорте больных [2, 3], что ставит исследователей перед необходимостью поиска новых молекулярных маркеров прогноза заболевания и диагностики рецидивов, в т. ч. в посттрансплантационный период. Одним из таких маркеров может быть ген WT1. В частности, его экспрессия может быть повышена как в дебюте ОМЛ, так и на этапе развития рецидивов [4—10]. Кроме того, гиперэкспрессия гена WT1 не является редкостью у больных с миелодиспластическими синдромами (МДС) [5, 11 — 14], острым лимфобластным лейкозом [15, 16] и неходжкинскими лимфомами [16, 17].
Тестирование этого молекулярного маркера для диагностики минимальной остаточной болезни в посттрансплантационный период было впервые осуществлено японскими исследователями [10, 18—20]. Они показали, что после ТГСК уровень экспрессии гена WT1 может быть ниже, чем в костном мозге доноров, хотя при рецидиве он, как правило, достигает максимума [10]. Оптимальные для решения этой задачи серийные исследования уровня экспрессии гена WT1 пока проводились относительно редко [21—24]. Материал забирали в интервале от 20 до 30 дней после ТГСК, а продолжительность мониторинга доходила до 3 лет [21]. На основании полученных данных сложилось впечатление, что у молодых больных уровень экспрессии гена WT1 отчетливо выше, чем в старших возрастных группах, но мало зависит от цитогенетического и морфоцитохимического вариантов лейкоза, так же как и от степени выраженности органоме-галии [22]. С другой стороны, экспрессия WT1 тесно связана с содержанием бластных элементов в костном мозге [25] и с уровнем экспрессии специфических молекулярных маркеров, характерных для изученных лейкозов [4, 8, 10, 26, 27].
Как известно, ген WT1 расположен на коротком плече хромосомы 11, в локусе 11р13. Он кодирует содержащий «цинковые пальцы» транскрипционный фактор, который в физиологических условиях активно экспрессируется в клетках формирующейся у эмбриона урогенитальной системы, так же как и в клетках мезотелия, тимуса, головного мозга, селезенки и эндотелия. В костном мозге его экспрессия была отмечена в клетках-предшествен-ницах гемопоэза [28, 29]. При этом уровень экспрессии гена WT1 в бластных клетках практически не зависит от их генетического профиля.
В настоящей работе серийное измерение уровня экспрессии гена WT1 с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) было использовано для мониторинга течения ОМЛ в посттрансплантационный период у 34 больных, наблюдавшихся в одном трансплантационном центре. Фактически оно было направлено на оценку качества трансплантации, своевременное распознавание возможных рецидивов, а в случае их развития — на попытку терапии.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 34 больных ОМЛ. У 5 (№ 9, 10, 24, 26 и 27) из них была трансформация МДС в ОМЛ. Лиц мужского пола было 20, женского — 14, в возрасте от 3 до 60 лет (средний возраст 25,5 года) (табл. 1). Количество введенных больным CD34-позитивных клеток варьировало от 1,4 до 11,2 х 106/кг массы тела реципиента (в среднем 4,8 х 106/кг массы тела). У 22 больных была выполнена неродственная ТГСК, у 12 — родственная, в т. ч. гапло-идентичная у 4 человек. Кроме того, у 3 больных из-за неэффективности первой ТГСК гаплоидентичная ТГСК была проведена как метод спасения.
У половины больных источником трансплантата был костный мозг, а у другой половины — периферическая кровь. У 13 пациентов в качестве режима кондиционирования применили миелоаблативный режим, а у 21 — не-миелоаблативный или режим со сниженной токсичностью. В итоге приживление трансплантата в ожидаемый срок имело место у 31 больного, в то время как у 3 пациентов
310 Клиническая онкогематология
ONCO_3_2015.indd Sec3:310
27.08.2015 10:26:11
ф
Ген WT1 в мониторинге рецидивов острых миелоидных лейкозов после аллоТГСК
Ф
было отмечено или его неприживление, или последовавшее за приживлением отторжение (№ 26, 28 и 29).
Молекулярное исследование уровня экспрессии генов WT1, AML1 /ETO и EVI1 проводили с помощью количественной ПЦР в реальном времени, сопоставляя полученные данные с уровнем экспрессии в клетках гена ABL. Поскольку у 4 больных с М2-вариантом ОМЛ имело место стандартное слияние генов AML1/ETO, а у 4 других отмечена гиперэкспрессия гена EVI1, это позволило нам сопоставить диагностические значения уровня их экспрессии
в плане предсказания посттрансплантационного рецидива (ПТР). Кроме того, данные по степени экспрессии гена WT1 были сопоставлены с уровнем донорского химеризма и количеством бластных клеток в костном мозге и крови.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как видно из данных табл. 1, максимальный исходный уровень экспрессии гена WT1 варьировал от 175 до 56 884 копии/104 копий гена ABL (средний уровень
Таблица 1. Клинические данные и уровень экспрессии гена WT1 до и после аллоТГСК у больных острыми миелоидными лейкозами
Уровень экспрессии гена WT1
Пациент Вариант лейкоза ТГСК До ТГСК После ТГСК, дни Время наблюдения от ТГСК, дни
№ Пол, возраст (лет) Клинический статус, дата, (число клеток CD34+ , х106/кг) Вид ТГСК, режим кондиционирования 30 60 90 120 150 180 270 360
Группа с нормализацией экспрессии гена WT1 после ТГСК
1 М, 19 М4 Рец. 1, 18.08.14, (5,4) Н/р, мбл 14 928 176 206 - - - - - 70
2 М, 17 М1 Рем. 1,29.08.12, (3,2)** Н/р, н/мбл 13 542 91 44 20 - 49 - 52 44 789*
3 Ж, 11 М1 Перв. рез., 25.03.14, (4,8) Гапло, мбл 11 168 32 - - - - - - - 140***
4 М, 54 М5 Рем. 2, 4.12.13, (4,1)** Н/р, н/мбл 9630 60 40 34 - 7 12 67 6 327
5 М, 41 М4 Рем. 1,5.09.14, (6,3)** Н/р, н/мбл 5457 92 - - - - - - - 108
6 М, 17 М3 Рем. 2, 6.03.14, (4,1) Р, мбл 4375 92 - - - 0 63 - - 501
7 Ж, 32 М1 Рец. 1, 16.02.14, (1,7) Н/р, мбл 3779 214 13 0 112 118 - - - 142***
Ауто - - - - - - - - -
8 М, 14 М2 Рем. 3, 3.07.12, (1,8) Р, н/мбл 3481 - 17 - - - - - - 840
9 М, 22 М4?* МДС, 2.02.12, (1,8) Н/р, н/мбл 3151 - 30 27 8 2 - - - 271***
10 Ж, 22 М1?* Перв. рез., 21.01.13, (2,7) Р, н/мбл 2591 125 - - 26 - - - - 331***
11 М, 26 М4 Рец. 2, 20.01.12, (5,5)** Н/р, мбл 2258 100 67 53 - 143 - - 110 762
12 М, 15 М4 Рем. 1, 16.06.14, (6,1) Р, мбл 1948 12 188 38 - - - - - 126
13 Ж, 25 М4 Рем. 1,22.02.13, (4,0)** Р, мбл 1818 43 - 15 - - 37 56 123 610
14 Ж, 25 М1 Рец. 1,21.08.13, (6,0)** Н/р, н/мбл 1763 42 7 26 - - - 47 - 365
15 Ж, 60 М1 Рем. 2, 18.09.13, (8,1) Н/р, н/мбл 1728 55 30 14 - - - - - 59
16 М, 5 М4 Рем. 1,21.11.13, (2,1) Н/р, н/мбл 999 7 13 - - - - - - 340
17 М, 17 М4 Рем. 1, 16.05.13, (6,0)** Н/р, н/мбл 866 42 1 29 - 45 - 5 120 529
Группа с нарушенной экспрессией гена WT1 после ТГСК
18 Ж, 13 М2 Рец. 1, 12.05.11, (5,2)** Гапло, мбл 56 884 18 - - - - - - - 35***
19 М, 58 М2 Рец. 1, 13.06.13, (2,6) Р, н/мбл 26 100 - - 893 - - - - 135 595
20 Ж, 10 М4 Рец. 1,26.10.12, (11,9)** Н/р, мбл 11 735 161 - - - - - - - 53***
21 Ж, 55 М4 Рец. 1,8.08.12, (5,4)** Н/р, н/мбл 11 686 1100 1020 0 - - - - - 101***
22 Ж, 14 М2 Рец. 2, 24.04.14, (5,0)** Н/р, н/мбл 11 467 322 524 175 63 8610 1216 - - 280+
23 М, 32 М4 Рец. 2, 15.12.11, (5,9)** Н/р, н/мбл 6846 373 289 - 12 414 - - - - 132***
24 Ж, 35 М1* Рец. 1,27.03.12, (3,3) Р, мбл 5870 259 44 - - - - - - 119***
25 Ж, 3 М7 Рец. 1, 19.08.14, (10,0)** Н/р, мбл 3693 - 1049 - - - - - - 225
26а М, 12 М?* Перв. рез., 9.08.12, (2,2)** Н/р, н/мбл 3204 2220 2638 114 - 51 - - - 414***
26б Рец. 1,2.04.13, (2,3) Гапло, н/мбл 51 43 113 3885 - - - - - -
27 М, 32 М?* МДС, 27.02.13, (2,3)** Н/р, н/мбл 147 4000 997 24 - 18 - - 1706 125***
28а Ж, 26 М1 Рем. 1, 17.07.13, (2,65) Н/р, мбл 1049 6 35 48 29 19 1683 - 60 559
28б Рец. 2, 3.10.14, (7,1) Гапло, н/мбл - - - - - - - - -
29а Ж, 17 М4 Рец. 2, 26.10.11, (3,8) Н/р, н/мбл 451 0 48 28 70 1093 221 - 1966 1189
29б Рец. 3, 18.03.14, (7,2) Гапло, н/мбл 867 2025 10 4401 12 59 - - -
30 М, 30 М1* Рем. 1, 13.10.12, (6,8)** Н/р, н/мбл 725 284 1833 3107 161 2649 - - - 194***
31 М, 22 М4 Рем. 1, 17.07.13, (3,5)** Н/р, мбл 290 122 69 118 272 - 33 - 76 559
32 М, 26 М5 Рец. 2, 4.12.13, (2,8) Р, н/мбл 176 - 151 161 1764 - 4542 - - 832
33 М, 53 М7* Рец. 1, 15.12.10, (2,3) Гапло, н/мбл - - - - - - 864 - - 1616
Рец. 1, 17.12.10, (4,1)** -
34 М, 6 М4 Рец. 2, 13.08.13, (10,8) Гапло, н/мбл - - - - - - - - 378 532
«-» — нет данных или исследование не проводилось; гапло — гаплоидентичная ТГСК; М? — подвариант ОМЛ не уточнен; мбл и н/мбл — миелоаблативный и немиелоаблативный режимы кондиционирования; н/p — неродственная ТГСК; р — родственная ТГСК; рем./рец. 1,2, 3 — ремиссия/ рецидив 1,2, 3-й; перв. рез. — первичная резистентность к химиотерапии.
* ОМЛ, трансформировавшийся из МДС.
** Источником CD34-позитивных клеток в данном наблюдении была периферическая кровь донора, а не костный мозг.
*** Смертельный исход.
Ф
www.medprint.ru
311
ONCO_3_2015.indd Sec3:311
Ф
27.08.2015 10:26:11
$
Н.Н. Мамаев и др.
7070 копий). Он мало зависел от морфоцитохимического варианта лейкоза и цитогенетического профиля бластных клеток. В то же время по характеру реакции на ТГСК больные распределились на две равные группы.
Группу 1 составили больные № 1 — 17, у которых исходный уровень экспрессии гена WT1 был в интервале от 866 до 14 928 копий/104 копий гена ABL (среднее значение 4913,7 копий). В процессе посттрансплантационного мониторинга имела место закономерная стойкая нормализация уровня экспрессии WT1. Как правило, это сопровождалось достижением у больных высокого уровня донорского химеризма, а также нормализацией в крови и костном мозге содержания бластных элементов. Сложный кариотип обнаружен у 4 (24 %) пациентов (№ 2, 3, 7 и 17), а гиперэкспрессия гена EVI1 была отмечена у 2 (№ 3 и 9). Неродственная аллоТГСК была выполнена 11 (65 %) больным этой группы (№ 1, 2, 4, 5, 7, 9, 11, 14—17), а родственная — 6 (35 %) (№ 3, 6, 8, 10, 12 и 13), в т. ч. гаплоидентичная — 1 (№ 3). Как видно из данных табл. 1, у 10 больных аллоТГСК была проведена в 1, 2 и 3-й ремиссиях (№ 6, 3 и 1 соответственно), а у 4 — в 1-м (№ 1, 7, 14) или во 2-м (№ 11) рецидиве ОМЛ. У 2 больных (№ 3 и 10) перед аллоТГСК была констатирована первичная резистентность к химиотерапии, а у 1 пациента аллоТГСК выполнялась еще на этапе МДС, позднее трансформировавшегося в ОМЛ.
Среднее количество вводимых реципиентам CD34-позитивных клеток/кг массы тела составляло 4,3 х 106/кг (диапазон 1,7—4,8 х 106/кг). В качестве режима кондиционирования у 7 больных использовался миелоаблативный (№ 1, 3, 6, 7 и 11 — 13), а у 10 — немиелоаблативный. За редким исключением, приживление трансплантата происходило в ожидаемый срок. В итоге под наблюдением оставалось 12 (70 %) пациентов, умерло 5 (№ 2, 3, 7, 9 и 10). Среди последних 3 (№ 2, 3 и 7) имели сложный кариотип, у 2 (№ 2, 3) был наиболее высокий исходный уровень экспрессии гена WT1, а у 3 пациентов (№ 7, 9 и 10) количество введенных CD34-позитивных клеток не достигало 3 х 106/кг массы тела. Причинами смерти стали инфекции (№ 3, 9), прогрессирование основного заболевания (№ 3) и неприживление трансплантата (№ 9). Средняя продолжительность жизни больных в этой группе составляла 462 дня (диапазон 140—1103 дня).
Группу больных с нарушенной экспрессией гена WT1 в посттрансплантационный период составили также 17 пациентов (№ 18—34).
Средний исходный уровень экспрессии гена WT1 у больных этой группы составил 10 121 копия/104 копий гена ABL (диапазон 175—56 884 копии), что заметно выше, чем в 1-й группе больных (4914 копий). Однако из-за малого числа наблюдений выявленные различия статистически незначимы. Лейкозы со сложным кариотипом (№ 2, 7, 16, 18, 22, 28, 29 и 32) и гиперэкспрессией гена EVI1 (№ 25, 29 и 32) были диагностированы у 8 (54 %) и 3 (24 %) больных соответственно, причем у 3 пациентов (№ 28, 29 и 30) оба маркера были представлены одновременно. Неродственная аллоТГСК была выполнена 11 больным, а родственная — 6, причем 3 из них гаплоидентичная. Костный мозг стал источником гемопоэтических стволовых клеток у 7 пациентов, а периферическая кровь — у 10. Как видно из данных табл. 1, среднее количество CD34-позитивных клеток, введенных в этой группе больным, составляло
4,78 х 106/кг (диапазон 2,2—11,9 х 106/кг массы тела), что практически не отличалось от соответствующего показателя в 1-й группе. В качестве режимов кондиционирования у 6 больных применили миелоаблативный, а у 11 — немиелоаблативный. Как правило, приживление трансплантата происходило в ожидаемый срок. ПТР были зарегистрированы у всех больных. В 8 наблюдениях (№ 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27 и 30) констатирован летальный исход. Средняя продолжительность жизни ко времени проведения статистического анализа равнялась 559 дням (диапазон 35—1616 дней). Необходимо отметить, что у некоторых больных (№ 33, 34) данные о гиперэкспрессии гена WT1 перед трансплантацией отсутствовали. В посттрансплантационный период они были определены и указывали на возможность развития ПТР. Общая 3-летняя выживаемость больных в 1-й группе составила 78 %, а во 2-й — 52 % (р = 0,08).
Дополнительный анализ материала (табл. 2) показал, что повышение уровня экспрессии гена WT1 отчетливо совпадало по времени с увеличением количества бластных клеток в костном мозге и/или крови. Следует отметить, что в ряде наблюдений (№ 28—32) молекулярный рецидив значительно опережал морфологический, что ранее было продемонстрировано и другими исследователями [30]. По нашим данным, подтверждающим ранее опубликованные в литературе [21], диагностика ПТР на основании серийного измерения уровня донорского химеризма значительно уступает таковой с помощью серийного измерения уровня экспрессии специфических и неспецифических молекулярных маркеров, в частности гена WT1 .
В свою очередь, серийно проведенные молекулярные исследования обнаруживают четкую связь изменений уровня экспрессии гена WT1, с одной стороны, и AML1/ ETO, EVI1 — с другой, что может служить основанием для активного его использования как в ранней диагностике ПТР, так и в качестве мониторинга эффективности их лечения. Иллюстрацией сказанному являются рис. 2, 4 и сопровождающие их краткие выписки из историй болезни.
Клиническое наблюдение 1
Больная № 18, 13 лет, ОМЛ, ФАБ-вариант М2, 1-й рецидив. Обнаружены транслокация t(8;21 )(q22;q22) и необычные дополнительные перестройки хромосом (рис. 1), в частности с переносом части длинного плеча хромосомы 17 на другие (1,2, 13, 14). Кроме того, важной отличительной чертой лейкоза у этой больной была наивысшая исходная экспрессия в клетках гена WT1, равная 56 884 копиям/106 копий гена ABL. С другой стороны, из-за отсутствия в семье и в регистрах HLA-совместимого донора в качестве источника CD34-позитивных клеток стала кровь от гаплоидентичной матери. Немаловажно и то, что из-за быстрого прогрессирования патологического процесса гаплоТГСК у этой больной выполнена до достижения ремиссии. При этом были использованы миелоаблативный режим кондиционирования и достаточное количество CD34-позитивных клеток (5,2 х 106/кг массы тела). Достичь должного лечебного эффекта от гаплоТГСК не удалось. Больная умерла на 35-й день после трансплантации, когда содержание бластных элементов в пунктате костного мозга (Д+34) достигло 94,2 %, а уровень донорского химеризма снизился до 5 %.
312 Клиническая онкогематология
ONCO_3_2015.indd Sec3:312
27.08.2015 10:26:11
$
Ген WT1 в мониторинге рецидивов острых миелоидных лейкозов после аллоТГСК
Таблица 2. Характеристика больных с нарушением уровня экспрессии гена WT1 в посттрансплантационный период
АллоТГСК Дата анализа (день до/после ТГСК) Уровень экспрессии гена WT1 До- норский химеризм Содержание бластных клеток в костном мозге/крови Специфические молекулярные маркеры Дата последнего наблюдения или смерти Время наблюдения от даты ТГСК, дни
Пациент № Дата, вид, режим Количество клеток CD34+/ кг массы
18 AML1/ETO 16.06.11* 35
22.03.11 (Д-510) 56 884 28,4/36,0 305
3.05.11 (Д-12) - 50,0/- 300
12.05.11, гапло, мбл 5,2 1.06.11 (Д+20) 18 5-10 38,0/43,0 -
15.06.11 (Д+34) - < 5 94,2/- -
19 AML1/ETO 27.01.15 595+
3.06.13 (Д-10) 26 100 45,0/- 482
13.06.13, р, н/мбл 2,6 8.07.13 (Д+25) - > 95 1,2/0 -
12.08.13 (Д+60) - > 95 2,4/0 -
30.09.13 (Д+109) 893 > 97 0,2/0 0,05
17.03.14 (Д+277) 135 > 97 1,6/0 -
20 До 11 735 69,0/17,0 Уровень 18.12.12* 53
18.09.12 (Д-38) 9 -/- экспрессии
26.10.12, н/р, мбл 11,9 12.11.12 (Д+17) 161 - 0,4/0 AML1/ETO не
22.11.12 (Д+29) 132 - -/-
21 7.05.12 10,0/- Уровень 17.11.12* 101
22.05.12 (Д-78) 1686 68,0/19,0 экспрессии
25.07.12 (Д-34) 5471 17,0/0 AML1/ETO не
8.08.12, н/р, мбл 5,4 6.09.12 (Д+29) 1100 90-95 6,0/0
20.09.12 (Д+43) 53 > 95 1,4/0
4.10.12 (Д+57) 1020 > 95 20,8/0
15.10.12 (Д+68) 852 > 95 1,2/0
25.10.12 (Д+78) 0 > 95 4,2/0
15.11.12 (Д+99) 55 > 95 1,0/0
22 AML1/ETO 27.01.15 280+
28.01.13 5198 71,0/60,0 188
24.12.13 - 22,0/- 189
4.02.14 0 0,8/ 0
21.03.14 - 0,8/- 0,06
26.03.14 - -/- -
24.04.14, н/р, н/мбл 5,0 17.04.14 (Д-7) 11 467 5,4/0 35,8
19.05.14 (Д+25) 87 > 97 4,0/0 8,5
5.06.14 (Д+42) 524 > 97 0,6/0 10,1
30.06.14 (Д+67) 20,0 70-79 37,0/0 405
4.08.14 (Д+102) 164 > 97 0,4/0 0,2
9.10.14 (Д+168) 8610 40-49 74,0/28,0 176
13.11.14 (Д+212) 16 90-97 0,2/0 11,5
23 23.08.11 (Д-86) 2316 11,0/- Уровень 25.04.12 132*
28.11.11 (Д-17) - 4,2/- экспрессии
1.12.11 (Д-14) 6846 7,8/0 EVI1 не
15.12.11, н/р, н/мбл 5,9 29.12.11 (Д+14) 373 90-95 -/1,0
13.02.12 (Д+60) 289 - 8,6/-
12.03.12 (Д+87) 120 - 7,0/-
18.04.12 (Д+124) 13 414 - 84,0/-
24 20.02.12 (Д-36) 5870 28,0/44,0 Уровень 3.08.14* 119
27.03.12, р, мбл 3,3 19.04.12 (Д+23) 259 > 97 1,2/0 экспрессии
14.05.12 (Д+47) - 80-90 - EVI1 не
23.05.12 (Д+56) - 50-60 -
6.06.12 (Д+71) 44 40-50 -
25 EVI1 27.01.15 222+
18.12.13 (Д-172) 282 27,8/3,0 18
7.04.14 (Д-72) 42 4,6/- 5
10.06.14 (Д-9) 3693 13,6/- 90
19.06.14, н/р, мбл 10,0 5.07.14 (Д+16) 0 > 97 1,0/- 22
29.07.14 (Д+40) - > 97 -/- -
18.08.14 (Д+60) 1049 > 97 20,0/- 53
2.10.14 (Д+104) - - 60,8/- -
www.medprint.ru
313
ONCO_3_2015.indd Sec3:313
Ф
27.08.2015
#
10:26:11
$
Н.Н. Мамаев и др.
АллоТГСК Содержание Дата Время
Пациент № Дата, вид, режим Количество клеток CD34+/ кг массы Дата анализа (день до/после ТГСК) Уровень экспрессии гена WT1 До- норский химеризм бластных клеток в костном мозге/крови Специфические молекулярные маркеры последнего наблюдения или смерти наблюдения от даты ТГСК, дни
26а 29.02.12 (Д-162) 3204 10,0/0 Уровень 27.09.13* 414
17.04.12 (Д-112) - 4,0/- экспрессии
9.08.12, н/р, н/мбл 2,2 29.08.12 (Д+20) - 80-90 -/- EVI1 не
08.10.12 (Д+60) 27 - -/-
23.10.12 (Д+75) 80 - -/-
08.11.12 (Д+91) 2220 - 6,6/-
26.11.12 (Д+109) 2638 - 2,8/-
8.01.13 (Д+152) - - 52,9/83,0
31.01.13 (Д+185) 11 468 - 79,0/-
25.03.13 (Д+228) 51? < 5 -/20,0
31.03.13 (Д+234) - - -/20,0
11.04.13 (Д+245) - < 5 -/-
26б 3.04.13, гапло, н/млб 23.04.13 (Д+20) - > 95 -/1,0
29.04.13 (Д+26) - > 95 0,4/0
13.05.13 (Д+40) - > 95 -/0
28.05.13 (Д+55) - - -/0
20.06.13 (Д+78) 43 113 80-90 31,0/4,0
25.06.13 (Д+83) - > 95 -/0
1.07.13 - - -/4,0
4.07.13 - 90-95 -/-
8.07.13 - 80-90 -/5,0
11.07.13 - - -/14,0
15.07.13 - - -/21,0
18.07.13 - - -/41,0
23.07.13 38 859 10-20 49,8/41,0
15.08.13 - 20-30 41,0/-
20.08.13 - 20-30 -/43,0
23.08.13 - - -/79,0
27.08.13 - - -/55,0
27 27.02.13, н/р, н/мбл 2,3 21.03.13 (Д+22) 147 90-95 1,8/0 Уровень 29.06.13* 125
27.03.13 (Д+28) 1706 - 1,8/0 экспрессии
3.04.13 (Д+35) 6.05.13 (Д+68) 4000 997 10 31,8/- -/- EVI1 не определялся
20.05.13 (Д+82) - - -/-
28 EVI1 27.01.15 559+
12.12.12 (Д-217) 1049 84,2/61,0 23
14.01.13 110 -/- 8,3
29.05.13 (Д-49) 44,6 1,8/0 3
26.06.13 (Д-21) 61,2 3,4/0 2
17.07.13, н/р, мбл 2,65 1.08.13 (Д+15) 6,2 80-90 0,6/0 -
12.09.13 (Д+57) 35 80-90 2,2/0 1
3.10.13 (Д+78) 41 80-90 1,2/0 0,3
21.10.13 (Д+96) 48 80-90 4,4/0 2
6.11.13 (Д+112) 29 80-90 1,6/0 1
21.11.13 (Д+127) 19 80-90 0,4/0 2
25.12.13 (Д+161) 19 80-90 0/0 -
13.01.14 (Д+180) 282 80-90 4,2/0 -
24.01.14 (Д+191) 29 - -/- 3
6.02.14 (Д+204) 488 80-89 0,4/0 -
20.02.14 (Д+218) 1653 70-79 11,6/0 7
4.03.14 (Д+233) - - 54,2/0 -
8.04.14 (Д+265) 60 > 97 0,4/0 4
24.04.14 (Д+281) 6 90 0,4/0 0,3
19.05.14 (Д+306) 8 60-69 1,0/0 1
4.06.14 (Д+322) 1 80-89 1,0/0 0,5
25.06.14 (Д+343) - 80-89 0,4/0 -
21.08.14 (Д+397) 2500 60-70 45,4/- 10
25.09.14 (Д+404) - 3-9 90,0/0 -
3.10.14, гапло, н/мбл 7,1 22.10.14 (Д+19) 22 90-97 1,0/0 1
314
Клиническая онкогематология
ONCO_3_2015.indd Sec3:314
27.08.2015 10:26:11
Ген WT1 в мониторинге рецидивов острых миелоидных лейкозов после аллоТГСК
АллоТГСК Содержание Дата Время
Количество Дата анализа Уровень До- бластных клеток Специфические последнего наблюдения
Пациент клеток CD34+/ (день до/после экспрессии норский в костном молекулярные наблюдения от даты
№ Дата, вид, режим кг массы ТГСК) гена WT1 химеризм мозге/крови маркеры или смерти ТГСК, дни
29 EVI1 27.01.15 1189+
9.09.11 (Д-47) 6846 12,0/0 -
26.10.11, н/р, мбл 3,8 21.09.11 (Д-35) - 45,2/0 -
13.10.11 (Д-13) 451 45,5/0 11
9.11.11 (Д+14) - 30-40 1,6/0 -
15.11.11 (Д+20) - - 1,4/0 -
23.11.11 (Д+28) 0,01 90-95 1,0/0 -
5.12.11 (Д+40) - 90-95 1,0/0 -
14.12.11 (Д+49) - > 95 0,4/0 -
22.12.11 (Д+57) 48 > 95 6,2/0 0,5
23.12.11 (Д+58) - > 95 3,4/0 -
11.01.12 (Д+77) 28 > 95 2,2/0 0,18
7.02.12 (Д+104) 21 90-95 0,4/0 -
15.02.12 (Д+112) 70 90-95 0/0 3,4
19.03.12 (Д+145) 1093 60-70 7,2/3,0 36
26.03.12 (Д+152) - - 22,4/- -
25.04.12 (Д+182) 2393 60-70 7,4/0 25,1
2.05.12 (Д+189) 3252 60-70 24,0/0 -
24.05.12 (Д+211) 733 80-90 4,4/0 -
14.06.12 (Д+232) 221 > 95 1,0/0 -
17.09.12 (Д+327) 67 > 95 0/0 0,5
12.12.12 (Д+413) 55 > 95 1,0/0 0,9
3.07.13 (Д+616) - > 95 0,2/0 -
11.12.13 (Д+777) 1966 > 97 8,0/0 15
15.01.14 (Д+902) 867 80-89 17,0/0 49
22.01.14 (Д-55) - 90-97 -/- -
19.02.14 (Д-27) 1139 - -/- -
18.03.14, гапло, н/мбл 7,2 26.02.14 (Д-20) 2025 - 9,0/0 -
14.04.14 (Д+27) 3 > 97 1,0/0 -
28.04.14 (Д+41) 65 > 97 0,4/0 -
12.05.14 (Д+55) 10 > 97 0,2/0 -
26.05.14 (Д+69) 4401 > 97 3,4/0 -
9.06.14 (Д+83) 529 70-79 11,2/15,0 -
17.07.14 (Д+121) 12 - 31,5/0 22
28.07.14 (Д+132) 118 > 97 8,0/0 5
11.08.14 (Д+146) 59 - 0,2/0 3
20.08.14 (Д+155) - > 97 0,2/0 -
30.09.14 (Д+168) 10 > 97 1,2/0 9
1.10.14 (Д+197) 110 > 97 1,4/0 12
5.11.14 (Д+232) 2016 90-97 9,2/- 12
30 AML1/ETO 25.04.13* 194
5.07.12 (Д-100) 725 22,0/29,0 27,8
16.08.12 (Д-65) - - 1,7
19.09.12 (Д-24) - 3,8/0 12,6
13.10.12, н/р, н/мбл 6,8 31.10.12 (Д+18) - - 1,4/0 -
12.11.12 (Д+30) 284 > 95 2,4/0 6,0
26.11.12 (Д+44) 1833 > 95 1,4/0 139
5.12.12 (Д+53) 2363 - 52,0/0 169
13.12.12 (Д+61) 3107 - 23,0/0 180
9.01.13 (Д+88) 19 - 4,8/0 2
16.01.13 (Д+95) 161 - 2,0/0 2
31.01.13 (Д+110) - - 1,2/0 40
1.03.13 (Д+139) 2649 70 28,6/3,0 423
15.04.13 (Д+184) - - -/11,0 -
31 20.05.13 (Д-58) 290 3,2/0 Уровень 27.01.15 559+
17.07.11, н/р, млб 3,5 5.08.13 (Д+19) 112 > 95 0,8/0 экспрессии AML1/ETO
2.09.13 (Д+47) 122 > 95 2,8/0 и EVI1 не
16.09.13 (Д+61) 69 > 95 3,0/0 определялся
14.10.13 (Д+89) 118 > 97 1,8/0
www.medprint.ru
315
ONCO_3_2015.indd Sec3:315
27.08.2015 10:26:11
$
Н.Н. Мамаев и др.
АллоТГСК Содержание Дата Время
Количество Дата анализа Уровень До- бластных клеток Специфические последнего наблюдения
Пациент клеток CD34+/ (день до/после экспрессии норский в костном молекулярные наблюдения от даты
№ Дата, вид, режим кг массы ТГСК) гена WT1 химеризм мозге/крови маркеры или смерти ТГСК, дни
26.11.13 (Д+131) 147 > 97 3,2/0
18.12.13 (Д+154) 272 > 97 1,6/0
15.01.14 (Д+182) 33 > 97 1,2/0
24.03.14 (Д+250) 76 > 97 3,0/0
32 EVI1 22.10.14 832+
20.11.13 (Д-14) 176 -/- 53
4.12.13, н/р, н/мбл 2,8 25.12.13 (Д+21) - > 95 -/- -
9.01.14 (Д+36) - > 95 -/- 4
22.09.14 (Д+49) - > 95 5,8/0 1
29.01.14 (Д+56) 151 > 97 3,0/0 6
17.02.14 (Д+75) 71 > 97 1,8/0 14
27.02.14 (Д+85) 161 90-97 2,0/0 17
31.03.14 (Д+117) 1764 80-89 1,8/0 80
21.05.14 (Д+168) 4542 60-69 4,4/0 88
17.06.14 (Д+195) - - 21,0/- -
22.10.14 (Д+352) 3025 10 2,0/0 132
33 20.03.10 (Д-280) 49,0/- Уровень 28.09.13 1616+
15.12.10-17.12.10, 2,3 17.01.11 (Д+31) - 90-95 0/- экспрессии
гапло, н/мбл AML1/ETO
4,1 и EVI1 не
9.02.11 (Д+62) - 90-95 -/- определялся
10.03.11 (Д+103) - < 5 -/12,0
20.04.11 (Д+133) - < 5 37,5/22,0
(Д+180) 864 - -/-
34 24.01.13 (Д-199) - 63,4/- Уровень 27.01.15 532+
18.06.13 (Д-55) - 54,6/1,0 экспрессии
17.07.13 (Д-26) - 49,0/- AML1/ETO и EVI1 не
13.08.13, гапло, н/мбл 10,8 16.04.14 (Д+246) 296 > 95 41,2/- определялся
16.06.14 (Д+307) - > 97 1,6/-
26.06.14 (Д+317) 0 > 95 -/-
20.08.14 (Д+372) 378 99 -/-
«-» — нет данных; гапло — гаплоидентичная ТГСК; мбл — миелоаблативный режим кондиционирования; н/мбл — немиелоаблативный режим кондиционирования; н/p — неродственная ТГСК; р — родственная ТГСК.
* Летальный исход.
Клиническое наблюдение 2
Больной № 19, 58 лет, ОМЛ, ФАБ-вариант М2, 1-й рецидив с транслокацией t(8;21) и высоким уровнем экспрессии генов WT1 и AML1/ETO. Окончательная нормализация экспрессии этих молекулярных маркеров была достигнута после родственной ТГСК, проведенной с использованием немиелоаблативного режима, только на Д+227. Обращало на себя внимание то, что несмотря на высокий уровень экспрессии молекулярных маркеров, выраженность донорского химеризма все это время была в пределах 95—97 %, что указывало на его меньшую чувствительность в плане предсказания ПТР.
По нашим данным, корреляция уровня экспрессии гена WT1 c таковыми AML1/ETO или EVI1 наиболее отчетливо прослеживается у больных № 28—30, выписки из историй болезни которых представлены ниже.
Клиническое наблюдение 3
Больной № 30, 30 лет, ОМЛ, трансформировавшийся из МДС, ФАБ-вариант М1, 1-я ремиссия. Клинические и лабораторные данные, касающиеся экспрессии генов AML1/ETO и WT1, были опубликованы ранее [31]. Как видно из данных табл. 1 и 2, источником CD34-позитивных клеток в этом наблюдении был костный мозг
316
от HLA-совместимого неродственного донора. Их количество составляло 6,8 х 106/кг массы тела реципиента. Был выбран немиелоаблативный режим кондиционирования. Несмотря на наличие в трансплантате достаточного количества стволовых клеток, гиперэкспрессия выбранных для мониторинга генов стала обнаруживаться и прогрессивно нарастать задолго до снижения донорского химеризма (рис. 2). Число же бластных клеток в костном мозге стало нарастать и достигло 53 и 28 % соответственно. Больной умер от прогрессирования заболевания. Продолжительность жизни в этом наблюдении составила 194 дня.
Важная особенность данного наблюдения заключается в том, что диагностическая ценность экспрессии гена WT1 в распознавании ПТР оказалась выше, чем данные об экспресии специфического маркера AML1/ETO.
Клиническое наблюдение 4
Больная № 28, 26 лет, ОМЛ, ФАБ-вариант М1, лейкозные клетки имели сложный кариотип (рис. 3). Кроме гиперэкспрессии гена WT1 (1049 копий/104 копий гена ABL) в них активно экспрессировался ген EVI1 (23 копии/102 копий гена ABL), в то время как количество бластных клеток в костном мозге и крови достигало уровня 84 и 61 % соответственно. Было введено
КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ
ONCO_3_2015.indd Sec3:316
27.08.2015 10:26:11
$
Ген WT1 в мониторинге рецидивов острых миелоидных лейкозов после аллоТГСК
А
Б
tder(1)
J! к И п IS
1 # ** II 2 г* * % 3 ^der(8) 1* 32 и 4 SI 5 It
6 7 8 9 10 11 12
И •• 41 St H
13 *« 14 «« 15 ^der(21) •• t# 16 17 *-x i 18
19
20
der(1)
21 22 ,*-der(2) I
и
add(14)
14
X
Y
2
Рис. 1. Кариограмма (А) и частичные кариотипы (Б) из 3 клеток больной № 18, иллюстрирующие стандартную транслокацию t(8;21) (q22;q22) с дополнительной утратой одной из Х-хромосом и переносом части длинного плеча хромосомы 17 на хромосомы 1,2, 13 (не показано) и 14
#
Fig. 1. Karyogram (А) and partial karyotypes (Б) from 3 cells of patient No. 18 illustrating a standard t(8;21)(q22;q22) translocation with further loss of one of X chromosomes and a part of long arm of chromosome 17 jumping to chromosomes 1,2, 13 (not illustrated) and 14
#
2,65 x 106/кг массы тела CD34-no3ffraBHbix клеток от HLA-совместимого неродственного донора. Использовался миелоаблативный режим кондиционирования. После трансплантации уровень экспрессии генов WT1 и EVI1 длительное время был ниже порогового значения, а на долю донорского химеризма приходилось 80—90 % клеток. Впервые повышение уровня экспрессии гена WT1 было зафиксировано в Д+180 и Д+204 (рис. 4). В то же время достоверная диагностика рецидива лейкоза по морфологическим критериям, сопровождающаяся дальнейшим повышением уровня экспрессии гена WT1 , стала возможна значительно позже. Обращает на себя внимание то, что у больной с развившимся ПТР применение системной химиотерапии, дополненное гаплоидентичной ТГСК, позволило достичь кратковременной ремиссии. Продолжительность жизни больной составила 559 дней. Наблюдение за больной продолжается.
Клиническое наблюдение 5
Больная № 29, 17 лет, ОМЛ, ФАБ-вариант М4, 2-й рецидив. В данном наблюдении вслед за успешным лечением первого ПТР с помощью инфузий донорских лимфоцитов и гипометилирующих агентов были зарегистрированы новые морфологические и молекулярные рецидивы. Как и в предыдущем наблюдении, их удалось временно купировать системной химиотерапией, дополненной выполнением гаплоидентичной родственной ТГСК. Далее, несмотря на постоянное сдерживание лейкозного процесса гипометилирующими агентами,
1 3750 я 3500 0- 3250 3000 2750 2500 2250 2000 5 1750 | 1500 1250 1000 750 500 250 0
са и
60
50
40
30
20
10
0
&>
о
Дни после трансплантации
-*~WT1 AML1/ETO бластные клетки
Рис. 2. Молекулярный мониторинг посттрансплантационного течения М1-варианта ОМЛ (по ФАБ-классификации) у больного № 30 с транслокацией t(8;21)(q22;q22). Молекулярные рецидивы заболевания обнаружены раньше увеличения содержания бластных клеток в костном мозге
Fig. 2. Molecular monitoring of post-transplantation course of the M1 type AML (according to the FAB classification) in patient No. 30 with a t(8;21)(q22;q22) translocation. Molecular relapses of the disease were detected earlier than the increased blast cell levels in the bone marrow
сиролимусом и повторными (в эскалирующих дозах) инфузиями донорских лимфоцитов, предотвратить очередной, третий по счету, ПТР не удалось (рис. 5).
www.medprint.ru
317
ONCO_3_2015.indd Sec3:317
27.08.2015 10:26:11
$
Н.Н. Мамаев и др.
^der(1)t(1;7)
II L 1* н 1; A p ■' К
* 1 * 2 *3 ■ • 4 • 5
^inv(11)
и И 19 И .< ** • ■
• 6 •7 о • а> • ■ со • *11" *12
м А* И и • I ••
*13" *14 *15" *16 *17" * 18
^der(X)t(X;17) ft
. ** It* •« 1
*19" *20 *21" *22" *X *Y"
Рис. 3. Кариотип клетки костного мозга больной ОМЛ (№ 28), иллюстрирующий как структурные, так и числовые нарушения хромосом (> 3), что соответствует представлению о сложном кариотипе: 46, -X, der(X)t(X;17)(p22;q21), der(1)t(1;17)(p36;q2?3), inv(11) (p15q22), +21
Fig. 3. Karyotype of an AML patient's bone marrow cell (patient No. 28) demonstrating both structural and numerical chromosome aberrations (> 3) that corresponds to the conception of a complex karyotype: 46, -X, der(X)t(X;17)(p22;q21), der(1)t(1;17)(p36;q2?3), inv(11)(p15q22), +21
#
-»~WT1 --- EVI1 бластные клетки
Рис. 4. Корреляция уровня экспрессии генов WT1 и EVI1 у больной № 28 со сложным кариотипом и поздним посттрансплантационным рецидивом ОМЛ. Повышение экспрессии гена WT1 предшествовало нарастанию содержания бластных клеток в костном мозге. Этот маркер был более чувствительным, чем экспрессия специфического маркера EVI1
Fig. 4. Correlation of WT1 и EVI1 gene expression degrees in patient No. 28 with complex karyotype and delayed post-transplant AML relapse. Increased WT1 gene expression preceeded the growth of the blast cell count in the bone marrow. This marker was more sensitive, than expression of the specific marker EVI1
Продолжительность периода наблюдения за больной составляет 1189+ дней.
Экспрессия молекулярных маркеров опережала нарастание содержания бластных клеток в крови и костном
318
#
-»~WT1 --- EVI1бластные клетки
Рис. 5. Корреляция повышенного уровня экспрессии генов WT1 и EVI1 у больной ОМЛ М4-варианта (№ 29) с кариотипом 45,XX, inv(3)(3q21q26), -7 во время посттрансплантационных рецидивов после аллоТГСК и гаплоТГСК
Fig. 5. Correlation of increased WT1 and EVI1 gene expression degree in a patient with M4 type AML (patient No. 29) with 45,XX, inv(3)(3q21q26), -7 karyotype during post-transplant relapses after allosCT and haploSCT
мозге. Проводимая терапия инфузиями донорских лимфоцитов и гипометилирующими агентами на начальных этапах была эффективной, позже ее комбинировали как с системной химиотерапией, так и с гаплоидентичной ТГСК.
Клиническая онкогематология
ONCO_3_2015.indd Sec3:318
27.08.2015 10:26:11
Число бластных клеток, %
ф
Ген WT1 в мониторинге рецидивов острых миелоидных лейкозов после аллоТГСК
Ф
РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ ПОСТТРАНСПЛАНТАЦИОННЫХ РЕЦИДИВОВ
Как видно из данных, представленных в табл. 3, результаты предпринятого нами лечения зарегистрированных ПТР с использованием инфузий донорских лимфоцитов, гипометилирующих агентов, химиотерапии и гапло-идентичной ТГСК пока оказались малоутешительными. Действительно, стойкие клинико-гематологические ремиссии удалось достичь только у 3 пациентов, причем 2 из них (№ 21 и 22) умерли от реакции «трансплантат против хозяина» на 53-й и 101-й дни после ТГСК. В дополнение к этому в 2 наблюдениях (№ 20 и 29) было отмечено только некоторое улучшение лабораторных и клинических параметров. В то же время у 13 больных имело место дальнейшее прогрессирование заболевания с развитием ПТР.
ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Как известно, гиперэкспрессия гена WT1 является хорошо зарекомендовавшим себя в онкогематологии неспецифическим маркером, который позволяет успешно прогнозировать рецидивы опухолевого процесса [5—7]. В равной мере это справедливо как в отношении больных, уже получавших химиотерапию [32], так и в отношении ПТР [8, 20, 21]. По нашим данным, уровень экспрессии гена WT1 у больных ОМЛ варьирует в широких пределах. Он мало зависит от морфоцитохимического и цитогенетического вариантов лейкоза. В то же время высокий исходный уровень экспрессии гена WT1 и неблагоприятный исход заболевания могут быть взаимосвязаны (наблюдение № 18). Из работы следует, что уровень экспрессии гена WT1 отчетливо связан с уровнями экспрессии таких специфических молекулярных маркеров, как AML1/ETO и EVI1. Это подтверждает правомерность использования данного молекулярного параметра даже при отсутствии у больных более специфических молекулярных маркеров [30]. Немаловажно и то, что параллельные измерения уровня донорского химеризма оказались менее стабильными, а по информативности значительно уступали молекулярному мониторингу с использованием как неспецифических (WT1), так и специфических (AML1/ETO, EVI1) маркеров, что было продемонстрировано и другими исследователями [21].
Дополнительный анализ материала показал, что одним из важных факторов неудачи аллоТГСК может быть качество трансплантата, в частности количество в нем CD34-позитивных клеток. Этот вывод основан на том, что у 7 из 10 больных после аллоТГСК с низким (< 3,2 х 106/кг массы тела) числом CD34-позитивных клеток в трансплантате исход ТГСК был неудовлетворительным.
В целом представленные в работе данные о серийном количественном измерении уровня экспрессии гена WT1 показали, что у половины больных имевшее место перед трансплантацией повышение уровня экспрессии гена WT1 после аллоТГСК стойко нормализуется, что совпадает по времени с достижением и длительным сохранением клинико-гематологической ремиссии и полного донорского химеризма. В то же время у других больных картина качественно отличалась. У части из них после аллоТГСК нормализация экспрессии гена
Таблица 3. Терапия посттрансплантационных рецидивов заболевания
Результат лечения (время наблюдения
Пациент Дата Дата Терапия при от даты выполнения
№ аллоТГСК рецидива рецидиве ТГСК, дни)
19 13.06.13 30.09.13 Азацитидин Улучшение (595+)
2 цикла
21 8.08.12 4.10.12 Азацитидин Клинико-
2 цикла гематологическая
ремиссия, летальный исход (101)
22 24.04.14 30.06.14 Азацитидин, Ремиссия (280+)
FLAG-Ida
9.10.14 ИДЛ 2 раза
23 15.12.11 13.02.12 Проводилась* Прогрессирование (132)
24 27.03.12 6.06.12 FLAG, ИДЛ 2 раза Прогрессирование и
летальный исход (119)
25 19.06.14 18.08.14 FLAG Прогрессирование
(225+)
26 9.08.12 8.11.12 ИДЛ 1 раз Рефрактерность к
8.01.13 AML-BFM-04 химиотерапии,
3.04.13 21.06.13 Децитабин, ИДЛ, прогрессирование (414)
химиотерапия (клофарабин, цитарабин)
27 27.02.13 27.03.13 ИДЛ 2 раза Прогрессирование и
летальный исход (125)
28 17.07.13 13.01.14 ИДЛ 6 раз, FLAG, Ремиссия
азацитидин 6 циклов
9.06.14 «5+2», ИДЛ 2 раза, Прогрессирование
интерферон- a2a
3.10.14 Проводилась* Стабилизация (559+)
29 26.10.11 19.03.12 Цитарабин, ИДЛ Ремиссия (902+)
1 раз
11.12.13 ГаплоТГСК Новые рецидивы (1189+)
30 13.10.12 26.11.12 FLAG, ИДЛ 1 раз Прогрессирование и
летальный исход (194)
31 17.07.11 18.12.13 Не проводилась Ремиссия (559+)
32 4.12.13 31.03.14 Азацитидин Стабилизация (832+)
4 цикла, ИДЛ 4 раза, FLAG 2 цикла
33 15.12.10 10.03.11 Децитабин, ИДЛ Ремиссия (1616+)
_______________________________2 раза________________________
ИДЛ — инфузия донорских лимфоцитов (клеток CD3+).
* Данных о виде противоопухолевой терапии нет.
WT1 долго не наступала, а у других имели место разного уровня экспрессионные «всплески», которые могли служить предвестниками развития ПТР. Как предотвращать и лечить такие рецидивы, пока неясно. По-видимому, терапия должна проводиться в условиях молекулярного мониторинга. В будущие исследования помимо больных ОМЛ следует также включать пациентов с МДС [12, 14], острыми лимфобластными лейкозами [15, 16] и не-ходжкинскими лимфомами [16, 17].
Молекулярный подход рассматривался в двух недавно опубликованных работах. В одной из них измерение уровня экспрессии гена WT1 использовалось для обнаружения опухолевых клеток в крови, приготовленной для
www.medprint.ru
319
Ф
ONCO_3_2015.indd Sec3:319
Ф
27.08.2015 10:26:12
$
Н.Н. Мамаев и др.
#
аутоТГСК [33]. В другой работе минимальная остаточная болезнь наиболее успешно определялась методом проточной флоуцитометрии и молекулярного измерения уровня экспрессии гена WT1 [26].
КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ
Исследование не имело спонсорской поддержки.
ВКЛАД АВТОРОВ
Концепция и дизайн: Н.Н. Мамаев.
Сбор и обработка данных: А.В. Горбунова, Я.В. Гудож-никова, В.А. Катерина, И.М. Бархатов, Т.Л. Гиндина, С.Н. Бондаренко.
Предоставление материалов исследования: И.М. Бархатов, Т.Л. Гиндина, Е.В. Бабенко, А.Л. Алянский, О.А. Слесарчук, Н.В. Станчева, С.Н. Бондаренко. Анализ и интерпретация данных: Н.Н. Мамаев, Я.В. Гу-дожникова, Т.Л. Гиндина.
Подготовка рукописи: Н.Н. Мамаев, Я.В. Гудожникова, Т.Л. Гиндина, Е.В. Волчков.
Окончательное одобрение рукописи: Б.В. Афанасьев. Административная поддержка: Б.В. Афанасьев.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Wertheim G.B., Bagg A. Minimal residual disease testing to predict relapse following transplant for AML and high-grade myelodysplastic syndromes. Exp. Rev. Mol. Diagn. 2011; 11(4): 361-6.
2. Mardis E.R., Ding L., Dooling D.J. et al. Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome. N. Engl. J. Med. 2009; 361: 1058-66.
3. Rocquain J., Carbuccia N., Trouplin V. et al. Combined mutations of ASXL1, CBL, FLT3, IDH1, IDH2, JAK2, KRAS, NPM1, NRAS, RUNX1, TET2 and WT1 genes in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. BMC Cancer. 2010; 10: 401.
4. Cilloni D., Gottardi E., De Micheli D. et al. Quantitative assessment of WT1 expression by real time quantitative PCR may be a useful tool for monitoring residual disease in acute leukemia patients. Leukemia. 2002; 16: 2115-21.
5. Cilloni D., Gottardi E., Messa F. et al. WT1 as a universal marker for minimal residual disease detection and quantification in myeloid leukemias and in myelodysplastic syndrome. Acta Hematol. 2004; 112: 79-84.
6. Cilloni D., Renneville A, Hermitte F. et al. Real-time quantitative PCR (RQ-PCR) detection of minimal residual disease (MRD) by optimized WT1 assay to enhance risk stratification in acute myeloid leukemia (AML): A European LeukemiaNet Study. Blood. 2007; 110: 542a.
7. Nomdedeu J.F., Hoyos M., Carricondo M. et al. Bone marrow WT1 levels at diagnosis, post-induction and post-intensification in adult de novo AML. Leucemia. 2013; 27: 2157-64.
8. Yoon J.H., Kim HJ., Shin S.H. et al. BAALC and WT1 expressions from diagnosis to hematopoietic stem cell transplantation: consecutive monitoring in adult patients with core-binding-factor-positive AML. Eur. J. Haematol. 2013; 91(2): 112-21.
9. Tamaki H., Ogawa H., Inoue K. et al. Increased expression of the Wilms tumor gene (WT1) at relapse in acute leukemia. Blood. 1996; 88: 4396-8.
10. Ogawa H, Tamaki H, Ikegame K. et al. The usefulness of monitoring WT1 gene transcripts for the prediction and management of relapse following allogeneic stem cell transplantation in acute type leukemia. Blood. 2003; 101: 1698-704.
11. Bader P., Niemeyer C., Weber G. et al. WT1 gene expression: useful marker for minimal residual disease in childhood myelodysplastic syndromes and juvenile myelomonocytic leukemia? Eur. J. Haematol. 2004; 73: 25-8.
12. Lange T., Hubmann M., Burkhard R. et al. Monitoring of WT1 expression in PB and CD34+ donor chimerism of BM predicts early relapse in AML and MDS patients after hematopoietic cell transplantation with reduced-intensity conditioning. Leukemia. 2011; 25: 498-505.
13. Ueda Y., Mizutani C., Nannya Y. et al. Clinical evaluation of WT1 mRNA expression levels in peripheral blood and bone marrow in patients with myelodysplastic syndromes. Leuk. Lymphoma. 2013; 54(7): 1450-8.
14. Мамаев Н.Н., Горбунова А.В., Гиндина ТЛ. и др. Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при миелодиспластических синдромах и клиническое значение гиперэкспрессии гена WT1. Клиническая онкогематология. 2014; 7(4): 551-63.
[Mamayev N.N., Gorbunova A.V., Gindina T.L. et al. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in myelodysplastic syndromes and clinical significance of WT1 gene overexpression. Klinicheskaya onkogematologiya. 2014; 7(4): 551-63. (In Russ.)]
15. Heesch S., Goekbuget N., Stroux A. et al. Prognostic implications and expression of the Wilms tumor 1 (WT1) gene in adult T-lymphoblastic leukemia. Haematologica. 2010; 95: 942-9.
16. Ujj Z., Buglyo G., Udvardy M. et al. WT1 overexpression affecting clinical outcome in non-Hodgkin lymphomas and adult acute lymphoblastic leukemia. Pathol. Oncol. Res. 2014; 20: 565-70.
17. Drakos E., Rassidakis G.Z., Tsioli F. et al. Differential expression of WT1 gene product in non-Hodgkin lymphomas. Appl. Immunohistochem. Mol. Mor-phol. 2005; 13(2): 132-7.
18. Inoue K., Sugiyama H., Ogawa H. et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood. 1994; 84: 3071-9.
19. Inoue K., Ogawa H., Yamagami T. et al. Long-term follow-up of minimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1 (Wilms tumor gene) expression levels. Blood. 1996; 88: 2267-78.
20. Inoue K., Ogawa H., Sonoda Y. et al. Aberrant overexpression of the Wilms’ tumor gene (WT1) in human leukemia. Blood. 1997; 88: 1405-12.
21. Candoni A, Toffoleti E., Gallina R. et al. Monitoring of minimal residual disease by quantitative WT1 gene expression following reduced intensity conditioning allogeneic stem cell transplantation in acute myeloid leukemia. Clin. Transplant. 2011; 25: 308-16.
22. Kwon M., Martinez-Laperche C., Infante M. et al. Evaluation of minimal residual disease by real-time quantitative PCR of Wilms’ Tumor 1 expression in patients with acute myelogenous leukemia after allogeneic stem cell transplantation: Correlation with flow cytometry and chimerism. Biol. Blood Marrow Transplant. 2012; 18: 1235-42.
23. Polak J., Hajkova H., Haskovec C. et al. Quantitative monitoring of WT1 expression in peripheral blood before and after allogeneic stem cell transplantation for acute myeloid leukemia — a useful tool for early detection of minimal residual disease. Neoplasma. 2013; 60(1): 74-82. doi: 10.4149/neo_2013_011.
24. Frairia C., Aydin S., Riera L. et al. WT1 expression in аcute myeloid leukaemia: a useful marker for improving therapy response evaluation. Blood. 2013; 122(21): 2588 (abstract).
25. Alonso-Dominiquez J.M., Tenorio M., Velasco D. et al. Correlation of WT1 expression with the burden of total and residual leukemic blasts in bone marrow samples of acute myeloid leukemia patients. Cancer Genet. 2012; 205(0): 190-1 (Letter to the Editor).
26. Zhao X.S., Yan C.H., Liu D.H. et al. Combined use of WT1 and flow cytometry monitoring can promote sensitivity of predicting relapse after allogeneic HSCT without affecting specificity. Ann. Hematol. 2013; 92(8): 1111-9.
27. Yoon J.-H., Kim H.-J., Kim J.-W. et al. Identification of molecular and cytogenetic risk factors for unfavorable core-binding factor-positive adult AML with post remission treatment outcome analysis including transplantation. Bone Marrow Transplant. 2014; doi:101038/bmt.2014.180.
28. Hosen N., Shirakata T., Nishida S. et al. The Wilm’s tumor gene WT1-GFP knock-in mouse reveals the dynamic regulation of WT1 expression in normal and leukemic hematopoiesis. Leukemia. 2007; 21: 1783-91.
29. Huff V. Wilm’s tumours about tumour suppressor genes, an oncogene and chameleon gene. Nat. Rev. Cancer. 2011; 11: 11-21.
30. Zhang Q., Zhang Q., Li Q. et al. Monitoring of WT1 and its target gene IRF8 expression in acute myeloid leukemia and their significance. Int. Jnl. Lab. Hem. 2014 (Letter to the Editor). doi: 10.1111/ijlh.12309.
31. Мамаев Н.Н., Горбунова А.В., Гиндина ТЛ. и др. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при остром миелоидном лейкозе с транслокацией t(8;21)(q22;q22). Клиническая онкогематология. 2013; 6(4): 439-44.
[Mamayev N.N., Gorbunova A.V., Gindina T.L. et al. Hematopoietic stem cell transplantation in AML patients with t(8;21)(q22;q22) translocation. Klinicheskaya onkogematologiya. 2013; 6(4): 439-50. (In Russ.)]
32. Мамаев Н.Н., Горбунова А.В., Гиндина ТЛ. и др. Стойкое восстановление донорского гемопоэза у больной с посттрансплантационным рецидивом острого миеломонобластного лейкоза с inv(3)(q21q26), моносомией 7 и экспрессией онкогена EVI1 после трансфузий донорских лимфоцитов и использования гипометилирующих агентов. Клиническая онкогематология. 2014; 7(1): 71-5.
[Mamayev N.N., Gorbunova A.V., Gindina T.L. et al. Stable donor hematopoiesis recovery after post-transplantation relapse of acute myeloid leukemia in patient with inv(3)(q21q26), monosomy 7 and EVI1 oncogene overexpression after donor lymphocyte infusions and administration of hypomethylating agents. Klinicheskaya onkogematologiya. 2014; 7(1): 71-5. (In Russ.)]
33. Messina C., Candoni A., Carraba M.G. et al. Wilms’ tumor gene 1 transcript levels in leukopheresis on peripheral blood hematopoietic cells predict relapse risk in patients autografted for acute myeloid leukemia. Biol. Blood Marrow Transplant. 2014; 20(10): 1-6.
320
Клиническая онкогематология
ONCO_3_2015.indd Sec3:320
27.08.2015
#
10:26:12
