Молекулярный анализ генов, кодирующих белки клеточного деления и прилежащих генов цианобактерии Pleurocapsa sp Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 575.852

© М. Ю.Скопина >,

Е. П. Чижевская 2,

E. E. Андронов 2, А. В.Пиневич 1

молекулярный анализ генов, кодирующих белки клеточного деления и прилежащих генов циАноБАктЕрии PLEUROCAPSA SP.

1 Кафедра микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета;

2 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, Санкт-Петербург

* На примере Pleurocapsa sp. CALU 1126 впервые для группы плеврокапсовых цианобактерий реконструированы нуклеотидные последовательности гена белка клеточного деления FtsZ и прилежащих участков генома. Сопоставление данного локуса с соответствующими участками генома других цианобактерий указывает на различия в филогении, прослеживаемой по разным генам.

* Ключевые слова: филогения цианобактерий; Pleurocapsa; белки клеточного деления FtsZ и FtsQ; белок ИрА; белок ThiD.

ВВЕДЕНИЕ

Прокариоты размножаются посредством клеточного деления (цитокинеза), в котором можно выделить ряд стадий: 1 ) репликация хромосом (ы); 2) сегрегация сестринских хромосом; 3) выбор сайта деления; 4) сборка ор-ганеллы клеточного деления (дивисомы), в основе которой лежит кольцо деления (Z-кольцо); 5) собственно деление перетяжкой или септированием (Lutkenhaus, 1998; Errington et al., 2003).

Белок FtsZ, главный материал кольца деления, имеется у большинства изученных бактерий и архей; его гомологи обнаружены у пластид и митохондрий (Osteryoung, Nunnari, 2003; Maple, Möller, 2007). Вспомогательные белки FtsA и ZipA взаимодействуют с белком FtsZ и фиксируют Z-кольцо на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Прочие белки дивисомы (FtsK, FtsL, FtsN, FtsQ и FtsW) участвуют в процессе сегрегации дочерних клеток с помощью кольцевой инвагинации цитоплазматичес-кой мембраны, а также центрипетального роста ригидного слоя клеточной стенки и, в случае грамотрицательных бактерий, наружной мембраны (Nanninga, 2001). Бактерии и археи унаследовали Z-кольцо от «универсального общего предка» (Wang, Lutkenhaus, 1996), тогда как у эукариотов Z-белок был заменен гомологичным цитоскелетным белком — тубулином (Faguy, Doolittle, 1998).

В основе цитокинеза всех прокариотов лежат общие механизмы, с отличиями на уровне разных таксонов и внутри последних (Wang, Lutkenhaus, 1996). Особый интерес представляет цитокинез цианобактерий, прообраз пластокинеза (деления пластид). Однако его молекулярные детали слабо изучены, в основном у Synechococcus sp. PCC 7904 и Synechocystis sp. PCC 6803, делящихся бинарно (Koksharova, Wolk, 2002; Mazouni et al., 2004; Miyagishima et al., 2005). Что касается плеврокапсовых цианобактерий, обладающих уникальной способностью к множественному делению (Waterbury, Stanier, 1978), то механизм их цитокинеза остается неизвестным. Основной подход к решению данной проблемы состоит в изучении генов белков деления и продуктов их экспрессии.

В частности, настоящая работа посвящена молекулярному анализу гена ftsZ и фланкирующих генов у цианобактерии Pleurocapsa sp.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Поступила в редакцию 13.07.2012 Принята к публикации 22.11.2012

объект исследования и условия его культивирования В работе использована чистая культура Pleurocapsa sp. штамм CALU 1126 (коллекция культур микроорганизмов СПбГУ; см.: Pinevich et al., 2004). Культуру выращивали в жидкой или уплотненной (0,8 %-й агар Difco) минеральной среде BG-11M (Pinevich et al., 1997) при комнатной температуре, с непрерывным освещением интенсивностью 40 рЕ м-2 с-1, обеспечиваемой люминесцентными лампами белого света.

объекты, использованные при клонировании

Реципиентом при клонировании фрагментов ДНК послужил штамм DH5a E. coli (F-, recAl, endA1, gyrA96, hsdR17, deoR, A (lacZYA-argF)U169) (Grant et al., 1990). Культуру E. coli выращивали на среде LB (Маниатис

70

ГЕНЕТИКА ПОПУЛЯЦИЙ И ЭВОЛЮЦИЯ

и др., 1984), для отбора трансформантов при клонировании фрагментов ДНК использовали среду LB с добавлением ампициллина (100 мг * л-1), X-Gal (20 мг * л-1) и IPTG (10 мг * л-1).

Для клонирования рестрикционных фрагментов использовали плазмиду pUC18 (Norrander et al., 1983), а в качестве T-вектора для клонирования ПЦР-фрагмен-тов — плазмиду pTZ57R/T (MBI Fermentas, Литва). Манипуляции с ДНК

Геномную ДНК выделяли с использованием коммерческого набора Nucleón PhytoPure Plant DNA Extraction Kit (Amersham, Великобритания) согласно протоколу фирмы-изготовителя.

Для ПЦР-амплификации фрагмента гена ftsZ Pleu-rocapsa sp. CALU 1126 использовали праймеры, ранее сконструированные для Chroococcidiopsis sp. (Billi et al., 1998): (BF) 5'-AATGCYGTTAACCGSATGATT-3' и (BR) 5'-GCCYKYACRTCWGCAAARTC-3', а также Taq-поли-меразы (Хеликон, Москва) в автоматическом амплифи-каторе iCycler (Bio-Rad, США) в следующем режиме: начальная денатурация при 95 °C, 3 мин (30 циклов); 94 °C, 30 с; 42 °C, 30 с; 72 °C, 1 мин; завершающий синтез, 72 °C, 15 мин.

«Обратную» ПЦР проводили, используя праймеры (ftsZ483_out): 5'-TAGCCGATGATGTCTTGC-3 и (ftsZ71_ out): 5'-GAGCATCGGTATTTATTGC-3' и набор «Long PCR Enzyme Mix» (MBI Fermentas, Литва), который позволяет амплифицировать протяженные фрагменты ДНК (до 20 т. п.н.). Реакцию проводили в режиме: начальная денатурация, 95 °C, 3 мин (30 циклов); 94 °C, 30 с; 50 °C, 30 с; 72 °C, 4 мин; завершающий синтез, 72 °C, 15 мин. Матрицей служила геномная ДНК Pleurocapsa sp. CALU 1126, фрагментированная рестриктазой Ava II и лигиро-ванная в ковалентно замкнутое кольцо.

Реакции рестрикции и лигирования, а также электрофорез в агарозе и извлечение фрагментов ДНК из геля проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Плазмиды в клетки E. coli вводили посредством высокоэффективной трансформации (Hiroaki et al., 1990). Молекулярное секвенирование ДНК Нуклеотидные последовательности ДНК реконструировали с использованием набора реагентов фирмы Beckman Coulter (США) на автоматическом капиллярном секвена-торе CEQ8000 в соответствии с методикой фирмы-изготовителя. В случае секвенирования фрагмента, прилегающего к векторной плазмиде, были использованы стандартные М13-праймеры: M13for (-20) и M13rev (-26).

Для секвенирования центральных, не прилегающих к векторной плазмиде участков фрагмента, на основе уже известных краевых участков были сконструированы и использованы следующие праймеры:

pEE2_for1: 5'-GCGACAAGAGAGGATTGATTA-3' (для плазмиды pEE2);

pEE2_rev1: 5'-CTGGCTGCACATCTTTCAA-3' (для плазмиды pEE2);

pEE2_for2: 5'-CAACCATTGCCACCAACTG-3' (для плазмиды pEE2);

pEE2_rev2: 5'-CAGACAATCACCGCAAGC-3' (для плазмиды pEE2);

p3HH2_for1: 5'-GATGCTCCAATTTCAGTCCA-3' (для плазмиды p3 НН2);

p3HH2_rev1: 5'-GAGCTTTATGGTGGCGAT-3' (для плазмиды p3 НН2);

p3HH2_rev2: 5'-CTCAATTAGCTGCGAGCTG-3' (для плазмиды p3 НН2);

p4HH1_rev1: 5'-GGCGTATTATACCTCCTCAAA-3' (для плазмиды p4 НН1);

p4HH1_rev2: 5'-GCAGCGAAATTAACTACATAGA-3' (для плазмиды p4 НН1).

Анализ полученных данных

Компьютерную обработку нуклеотидных последовательностей и дальнейшую их трансляцию в аминокислотные последовательности проводили с помощью программ Vector NTI, ClustalX и Mega 3.1. Матрицы генетических расстояний составляли, а дендрограммы строили с помощью программы Mega 3.1. с использованием модели PAM Matrix (Dayhoff) и метода для кластеризации Neighbor-Joining. Реконструированные последовательности сопоставляли с базой GenBank при помощи программы BLAST (Altschul et al., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В соответствии с поставленной задачей был осуществлен детальный молекулярно-биологический анализ гена ftsZ Pleurocapsa sp., кодирующего белок, который играет ключевую роль в образовании кольца деления. С этой целью на первом этапе работы были осуществлены ПЦР-амплификации фрагмента гена ftsZ с его последующим клонированием и секвенированием. В связи с тем, что нуклеотидные последовательности генов клеточного деления Pleurocapsa sp. были ранее неизвестны, для ПЦР-амплификации фрагмента гена ftsZ использовались праймеры (BF, BR), ранее предложенные для Chroococcidiopsis sp. (Billi et al., 1998). В результате был амплифицирован фрагмент размером ~500 п. н., который был извлечен из геля, клонирован в векторе pTZ57R/T и секвенирован.

На основе реконструированной нуклеотидной последовательности были разработаны ориентированные «наружу» от секвенированного фрагмента праймеры ftsZ71_out и ftsZ483_out, предназначенные для проведения «обратной» ПЦР. Это позволило амплифицировать фрагмент генома Pleurocapsa sp. CALU 1126 размером ~7,5 т. п. н. Он был клонирован в векторе pTZ57R/T (сконструированная плазмида получила название pFTSZ). После этого плазмида pFTSZ была секвениро-вана с использованием стандартных праймеров, что позволило «прочесть» последовательности, содержащие 3'- и 5'-концевые участки гена ftsZ, которые затем были

таблица 1

Результаты сравнения аминокислотной последовательности белка FtsZ Plpeurocapsa sp. CALU 1126 и других цианобактерий

Объект сравнения (номер в GenBank) Аминокислотная последовательность белка FtsZ (а.о.) Сходство с аминокислотной последовательностью белка FtsZPleurocapsa sp. CALU 1126 (%)

По идентичным аминокислотам По идентичным и аналогичным аминокислотам

Anabaena variabilis ATCC 29413 (ABA21459) 428 68 77

Cyanothece sp. PCC 7424 (EDU18781.1) 418 74 84

Lyngbya sp. PCC 8106 (EAW35671.1) 429 66 79

Microcystis aeruginosa PCC 7806 (CAO87356.1) 415 68 79

Nodularia spumigena CCY 9414 (EAW44422.1) 427 67 77

Nostoc sp. PCC 7120 (BAB75557.1) 428 68 77

Synechocystis sp. PCC 6803 (BAA17496.1) 430 73 83

Trichodesmium erythraeum IMS 101 (ABG52815.1) 423 67 80

объединены с ранее секвенированной областью гена. В результате была реконструирована полная нуклео-тидная последовательность открытой рамки считывания гена ftsZ размером 1266 п. н.

В результате компьютерной трансляции нуклеотид-ной последовательности была реконструирована первичная структура белка FtsZ (422 а. о.). Сравнение с ба-

зой данных GenBank показало его значительное сходство с белком FtsZ других цианобактерий (табл. 1). Сходство составило ~70 % по идентичным и ~80 % по аналогичным аминокислотам.

После выравнивания аминокислотной последовательности белка FtsZ Pleurocapsa sp. с таковыми других цианобактерий (рис. 1) были выявлены четыре типич-

..........РЗлшгоея^гя

...........QrArTcibew sp.

..............1

- if -JtUUg'inOSA

........SgZïdCJlOCystiS sp

■ Г f njin ■ ujüvjon ...............sp

.....2fo. i A: д - г .'-я

.....Длд^двял

........P ItBna^iX'

..........QfjuiotAece sp

.............L^i^bjx sp

■Wicjrocyf-tif '^bro^inoj* .......Syneùhoçys t is ■ sp

riehode ■ £ * д г.-:

..............ifei t« ■ sp

■ ■ ■ ■ ■ sptmigcn*. .....АЛДЬАСДЛ - WuriAiliiïS ■

..........sp.

...........^дпсйссс sp.

..............i - i L>''*'j ** ' '

■ HiejmcYstis • дел™ g-¿по«1

........Sïzifciiocystis ■ sp.

7. i > .v : rir tniim Cifi-Vjdil ...............JfosioC: ■ sp .

.....-7 1.-Г ¿.те r.~

.....ЯялЬлсял ' VAK-iibiliS '

..........PJeumcapia ■ sp.

...........Огдлоймсе1 sp,

..............' sp .

• iiic i 1iï ■ xcjcuq

........Synechozyz±zs ■ sp,

- Tjrdaîtode Nniuii -exytJurAan-

...............Jfostoc s^.

.....Xociul

.....Snabaena ■ varia^iilii -

..........ГЯеипслр» sp,

...........CvAjrîotJifi te ■ sp .

..............i^gbja sp.

■ Û^ÏJC^i-

........SpiecAocyitii ■ sp.

■ miui 'U^thram

...............Nos tcc ■ 3T ■

.....ЯОШапд • jptmjgien*'

.....ДпяЬдепа TTir-! ai-lï^.ï

■ (11 ■■ (Il -- (1) (1) y (1) ■■ (1! (1) - (1) ■■ (Il

(961

■ (961 (1011

■ (971 (1001

■ (991

■ [371

■ E97| (971

(196) (19E| (ÎOlt (1971 (£001 (1991

(197) (1971 (197)

(296) (2961 (3011 (2971 (3001 (299) (297| (197) (2971

(39ÎI (3661 (3991 «671 (399| (39Î) (3971 (3961 (397)

В SLKHKIVS IT HSCTHY1I----И SELPÏJlLGIIir.- L GG- 'ÎK HO5 E SUS." SS 91PKE3Ü ES1K

! НИ nu 1 Ji S sunn E----SAETSSRW SVOI-ijW- STïSF S QMgEFFE1ÏP&ED:

I D £K : HtG S ТС КИДИНЯЕОАНiKRJUWlASEгяНРРГИГЕFHUIHOTESUSKPHEBSWSTD

tfTÎŒSE ÏVPTTP SLHSBE----ÏÂS S«-HS EC IIMTS QH1K.ML ET ?P HE SQITT PREBSESHP

I ILHTOLP L1И15ГГ GS 1Л.НБ >JTE GLDDLFSÎSI 'JDS- t PLEÄL VETPÏH1 SPSP ¡¡LKEI'iji Ii WISK OSin-YYE SPQYQ--GaSNFPLPNWSMP FRITS SGEYGE OWYD («SI HŒJ; EJICI

(ILDSiriJE LTYRHSQ 3LG----CP GESLAWS Ï*PFHH г SLtTE йИШВ SKKI SUSHtAXIS

I TLDOTiCGLTIKÜiPSVG----00GFPLî.VtrSTIIPFtQISSLOT SOTHDSKKHШЯ1И

Ifjb&nB LTÏWJÎ0 SID----OP GESLAOTS iSI'FtWi GUI 'ЗСОТГО S4B И181Œ)

T PHPPKKE Q SP P PKPÏ GLB LSWPSKEPDVQPCÎPGLlj

---PSPWTÎSPPH?i.6U)|

STTT PE DPL SIF1&PE LT -T [«Ptrïii ЯР «mir CLDI

готШиатжгёвкйяя gfLVB p tpuse p ran ещ

РРШ РДРТ FÊPTŒKS GU)

Рис.

CJjTEEEELEEP — ачиХГЕЖКТ-Г СГГНГ

ЖЕЛЕ ШРНИ----Qil S7F1I----»ILS

ïtexi OStSSTR—BITtЗкпхр S SP SP

SŒSP SEPT 3HK- - WI1HPÎ.--------

1ŒKE KPÛKJfTS S-KPVL SSPPÄGVET VP

œVC'T flP IÎEKV- OPEEÎVPIIP------

en вмр Q ÎMUUDUlWfflPPWlTiT 0T Ш (¡ЛГРТ Sir.T - ЖММТРЯИТР 0P _ .ÏEJ CIAÎÏ M gH0„4JUSi.njjapp№TFT ÛT

Выравнивание аминокислотных последовательностей белка FtsZ Pleurocapsa sp. CALU 1126 и других цианобактерий. Домены белка FtsZ: вариабельный N-конце-вой (1); высоко консервативный кор (2); вариабельный спейсер (3); С-терминальный (4)

Рис. 2. Локальная генетическая карта клонированного участка генома Pleurocapsa sp. CALU 1126. Серые стрелки — полные открытые рамки считывания; прямоугольник — часть рамки считывания гена Ц^Т; черные стрелки — дополнительно сконструированные праймеры; Н, Е и А — сайты рестрикции ферментами ШпйШ, £соЩ и ЛvaII

ных домена: вариабельный ^концевой домен (1); консервативный кор, служащий для связывания ГТФ (2); вариабельный спейсер (3); консервативный С-концевой домен, необходимый для взаимодействия с другими белками клеточного деления (4).

Следующей задачей стала реконструкция нуклео-тидных последовательностей, фланкирующих ген ftsZ, и идентификация входящих в них генов. Для этого из состава плазмиды pFTSZ были повторно клонированы в векторе риС18 семь £СоЩ- и ЯшШП-фрагмен-тов. В результате было получено семь плазмид: рЕЕ1 (размер клонированного фрагмента 0,3 т. п. н.); рЕЕ2 (2 т. п. н.); р3 НН1 (0,8 т. п.н.); р3 НН2 (1,6 т. п. н.); р3 НЕ3 (0,5 т. п. н.); р4 НН1 (1,2 т. п. н.); р4 НЕ2 (0,1 т. п. н.). Все они были секвенированы с использованием стандартных праймеров. Для плазмид рЕЕ2, р3 НН2 и р4 НН1 на основе реконструированных нук-леотидных последовательностей были разработаны внутренние (дополнительные) праймеры, и затем было продолжено секвенирование (рис. 2).

После объединения центральной и фланкирующих нуклеотидных последовательностей была получена общая последовательность, размером ~7,5 т. п. н. В результате ее компьютерного анализа были выявлены четыре полные открытые рамки считывания для генов ^рА, гена транспозазы из молекулярного семейства ^200/^605, гена ftsQ и гена thiD а также часть рамки считывания для гена ц^Т (рис. 2).

Ген с(рА у оксигенных фототрофов кодирует «С-кон-цевую» протеазу из молекулярного семейства эндопро-теаз (Inаgаki et а1., 2001). Она катализирует «С-концевой» процессинг белка D1, принимающего участие в сборке марганцевого кластера — активного центра

окисляющего воду комплекса второй фотосистемы. Мутанты с инактивированным геном ctpA теряют способность использовать воду в качестве донора электронов (Anbudurai et al., 1994). Сходство гена ctpA Pleurocapsa sp. с генами, кодирующими «С-концевую» протеазу у других цианобактерий составляет ~80 %.

Мобильный элемент IS 605 является инсерционным элементом из широко представленного у бактерий молекулярного семейства IS200/IS605 (Mahillon, Chandler, 1998). Оно особо интересно тем, что у его представителей отсутствуют концевые инвертированные последовательности, характерные для большинства транспозонов у прокариотов и эукариотов. Как и другие IS-элементы, IS 605 содержит транспозазу TnpA (фермент, связывающий одноцепочную ДНК и встраивающий ее в геномную ДНК). Гены транспозазы в составе инсерционных элементов IS200/IS605 имеют самый маленький размер и наименее изучены (Barabas et al., 2007). Участки, фланкирующие ген транспозазы IS605, содержат последовательности, которые формируют небольшие шпилечные структуры, играющие важную роль в перемещении транспозона (они служат сайтами распознавания транс-позазы и связывают ее с одноцепочной ДНК). Шпилечные структуры транспозона IS605 могут выборочно сохраняться в ходе эволюции, даже после исчезновения самого гена транспозазы (Barabas et al., 2007; Delihas, 2009). Семейство инсерционных элементов IS200/IS605 имеет интересную особенность: его представители всегда встраиваются непосредственно за 3'-концевой четырех-пяти нуклеотидной последовательностью — в отличие от большинства транспозонов, которые встраиваются случайным образом (Barabas et al., 2007). Сходство гена транспозазы у Pleurocapsa sp. CALU 1126 с транспоза-

100| £

1Ш| FtsZ Anabaena variabilis АТСС 29413 FtsZ Nostoc sp. РСС 7120 FtsZ Nodularis spvmigene CCY 9414 FtsZ Nostoc punctiforme РСС 73102

—FtsZ Synechococcus sp. PCC 7002

too j-FtsZ Crocosphaera wetsonii WH 8501

J— FtsZ Cyanothece sp. CCY0110

i FtsZ Pleurocapsa sp. CALU1126

- FtsZ СуШВкс¥зрГРСС7Ш ■ FtsZ Microcystis aeruginosa NIES-B43

-FtsZ Acaryochloris marina MBIC11017

- FtsZ Lyngbya sp. PCC 8106 FtsZ Trichodesmium erythraeum Ш5 101 i PCC 733S

щ

П35

FtsZ Gloeobacter violacevs PCC 7421

FtsZ Synechococcus sp. .1A-2-1 Ah

1D0, FtsZ Synechococcui elongatus PCC 7942 ' FtsZ Synechococcus elongatus PCC 6301

FtsZ Cyanobium sp. PCC 7001

if-I r

FtsZ Synechococcus sp, WH 5701 c^p- FtsZ Prochtorococcus marinus str. CCMP

too r

?y L t

91 671-

'»г FtsZ Synechococcus sp, CC9902 FtsZ Synechococcus sp. BL107 FtsZ Synechococcus sp. CC96Ö5 FtsZ Synechococcus sp. WH 8102 FtsZ Synechococcus sp, CC9311 FtsZ Synechococcus sp. RS9917

• FtsZ Synechococcus sp. WH 7805 FtsZ Synechococcus sp. RS9916

Thi D Anabaena variabilis ATCC 29413 -|j Thi D Nos toe sp. PCC 7120 —

Thi D Nodularis spumigene CCY9414 —

Thi D Nostoc punctiforme PCC 7302-

Thi D Cyanothece sp. PCC 7424 ■ Thi D Crocosphaera watsonii WH 8501 -

I Thi D Pleurocapsa sp. CALU 1126 |-

ThiD Microcystis aeruginosa NiES-843 -

Thi D Triehodesm¡um erythraeum MS101 —

Thi D Lyngbya sp. PCC 8106 — Thi D Acaryochloris marina MBIC11017 ■ Thi D Synechococcus sp. PCC 7335 —

FtsZ Prochlorococcus mann us sir. MIT 9312 FtsZ Prochlorococcus marinus str: NATL2A FtsZ Prochforococcus marinus str. CCMP 1375 FtsZ Prochlorococcus marinus str. МГТ 9211

ThiD Synechococcus sp. PCC 7002 Thi D Synechococcus sp. JA-2-3Ba(2-13) Thi D Synechococcus sp, JA-3-3Ab Thi D Synechococcus elongatus PCC 6301

3

ThiD Synechococcus elongatus PCC 7942 1100 Thi D Gfoeobacter violaceus PCC 7421 -Thi D Prochforococcus marinus str. MIT 9215-

Thi D Prochlotwoccus marinus str. CCMP1M*---

SynPro

Рис. 3. Дендрограмма, построенная на основе сравнения аминокислотных последовательностей белка FtsZ (A) и белка ThiD (Б). LPP — клада Leptolyngbya, Plectonema, Phormidium и Synechococcus sp. PCC 7335; SPM — клада Synechococcus sp. PCC 7002, Synechocystis sp. PCC 6803, Microcystis aeruginosa NIES-843, Crocosphaera watsonii WH 8501 и Cyanothece sp. CCY 0110; PNT — клада Lyngbya sp. PCC 8106, Trichodesmium erythraeum IMS 101, Nodularia spumigena CCY 9414, Nostoc punctiforme PCC 73102, Nostoc sp. PCC 7120 и Anabaena variabilis ATCC 29413; SynPro — клада морских пикоцианобактерий Synechococcus sp. и Prochlorococcus marinus, морского штамма Synechococcus sp. WH 5701 и пресноводного штамма Cyanobium sp. PCC 7001 (по: Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010). Цифры — статистическая достоверность очередности ветвления, %. Масштаб — 0, 05 замены на сайт

зами в составе мобильных элементов IS 605 у других ци-анобактерий составляет 72-78 %.

Ген ftsQ кодирует белок, который состоит из трансмембранного и периплазматического домена и играет важную роль в формировании дивисомы. Предполагается, что он вместе с другими вспомогательными белками деления, локализация которых зависит от предшествующей локализации белка FtsZ, координирует биосинтез материала клеточной стенки и инвагинацию цитоплазма-тической мембраны (Robson, King, 2006).. В клетке содержится не более 20 копий этого белка (Robson, King, 2006, Villanelo et al., 2011). Из числа анализируемых генов ген ftsQ Pleurocapsa sp. характеризуется наиболее низким сходством с соответствующими генами у других цианобактерий (54-57 %).

Ген thiD кодирует фосфометилпиримидинкиназу из молекулярного семейства фосфотрансфераз. Она катализирует реакцию синтеза тиаминпирофосфата (Mizote et al., 1999). Сходство гена thiD Pleurocapsa sp. с соответствующими генами у других цианобактерий составляет 75-81 %.

Ген gcvT кодирует аминометилтрансферазу — один из четырех компонентов системы расщепления глици-

на. Белок GcvT участвует в передаче метильной группы с глицина на тетрагидрофолат (Teplyakov et al., 2004). Для гена gcvT сходство с соответствующими генами у других цианобактерий составляет 52-61 %.

Накопленная информация о генах, содержащихся в анализируемом участке генома Pleurocapsa sp., позволила сравнить его с соответствующими участками у других цианобактерий и сопоставить полученные схемы расположения (локальные генетические карты). Описываемый участок может иметь разное строение у разных родов и даже разных штаммов одного и того же рода — примером служат Cyanothece sp. PCC 8802 и Cyanothece sp. PCC 8801. Тем не менее в анализируемом случае локальная генетическая карта Pleurocaposa sp. сходна с таковыми Cyanothece sp. PCC 7882 и Microcystis aeruginosa NIES-843.

Исследованные у цианобактерий гены ftsQ и ftsZ сцеплены и транскрибируются в одинаковом направлении. Ген ctpA расположен в upstream-положении от гена ftsQ; между ними находится ген транспозазы, входящий в состав мобильного элемента из молекулярного семейства IS200/IS605, представители которого часто встречаются в разных участках генома у циано-бактерий. В частности, у Microcystis aeruginosa PCC

74 ГЕНЕТИКА ПОПУЛЯЦИИ И ЭВОЛЮЦИЯ

Рис. 4. Дендрограмма, построенная на основе сравнения аминокислотных последовательностей белка FtsQ (В) и белка ИрА (Г). Обозначения см. рис. 3

7806 и Trichodesmium erythraeum IMS 101 он находится в upstream-положении от гена ftsQ, тогда как у Microcystis aeruginosa NIES-843 он в downstream-положении от гена thiD.

При построении дендрограмм использовалось древо цианобактерий, реконструированное по данным сопоставления нуклеотидных последовательностей РНК большой и малой субъединицы рибосомы, а также выведенных путем компьютерной трансляции аминокислотных последовательностей 137 консервативных белков (Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010). Основа этого древа — обособленный вид Gloeobacter violaceus и четыре клады: SPM (Synechococcus sp. PCC 7002, Synechocystis sp. PCC 6803, Microcystis aeruginosa NIES-843, Crocosphaera watsonii WH 8501 и Cyanothece sp. CCY 0110); PNT (Lyngbya sp. PCC 8106, Trichodesmium erythraeum IMS 101, Nodularia spumigena CCY 9414, Nostoc punctiforme PCC 73102, Nostoc sp. PCC 7120 и Anabaena variabilis ATCC 29413); SynPro (морские пикоцианобакте-рии Synechococcus sp. и Prochlorococcus marinus, а также морской штамм Synechococcus sp. WH

5701 и пресноводный штамм Cyanobium sp. PCC 7001) и LPP (Leptolyngbya, Plectonema, Phormidium и Synechococcus sp. PCC 7335).

Отметим, что к обособленной кладе SynPro относятся пикоцианобактерии диаметром < 0,2 мкм, которые численно доминируют в эуфотической зоне Мирового океана (Goericke, Welschmeyer, 1993). Термофильные штаммы Synechococcus sp. (JA-2—3Ba (2—13) и JA-3—3Ab) также образуют достоверно обособленную группу. В то же время различие в филогении Acaryochloris marina, Thermosynechococcus elongatus, Synechococcus elongatus и Synechococcus sp. PCC 7335, прослеживаемой по разным генам, может быть следствием ложного объединения «длинных» ветвей (Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010).

Анализ дендрограмм, построенных на основе сравнения аминокислотных последовательностей белков FtsZ, FtsQ, ThiD и CtpA, показал, что филогенетическое распределение их генов у Pleurocapsa sp. CALU 1126 существенно различается (рис. 3 и 4). Так, в соответствии с особенностями первичной структуры белков FtsZ и ThiD Pleurocapsa sp. CALU 1126 попадает в кладу SPM, что соответствует литератур-

ным данным (рис. 3 А, Б) (Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010). Однако если для белка ThiD наблюдается кластеризация с Crocosphaera watsonii WH 8501, то для белка FtsZ штамм Pleurocapsa sp. CALU 1126 обособлен от других представителей клады. Для белка CtpA можно говорить о кластеризации с представителями клады PNT (нитчатые циано-бактерии родов Pseudanabaena, Nostoc и Trichodesmium), тогда как в случае белка FtsQ Pleurocapsa sp. CALU 1126 проявляет родство с представителями клады SynPro (рис. 4 А, Б).

Такое разнообразие филогенетической «топологии» Pleurocapsa sp. CALU 1126 можно объяснить либо горизонтальным переносом генов, либо ложным объединением «длинных» ветвей (см. выше). Вопрос требует дальнейшего анализа; возможно, что после получения данных по генам других плеврокапсовых цианобактерий последние составят обособленную кладу.

Следует отметить, что различия филогении, прослеживаемой по рассматриваемым генам, проявляет не только Pleurocapsa sp. CALU 1126. Так, для Synechococcus sp. PCC 7002, который попадает в кладу SPM (Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010), не показана кластеризация с другими цианобактериями ни по одному из данных генов (рис. 3 и 4).

Клада PNT сохраняет целостность только при кластеризации по белку FtsQ (рис. 4 А). В остальных случаях она распадается на две группы: представители Cубсекции «Nostocales» (Anabaena variabilis ATCC 29413, Nostoc sp. PCC 7120, Nodularia spumigena CCY 9414 и Nostoc punctiforme PCC 73102) и представители Субсекции «Oscillatoriales» (Lyngbya sp. PCC 8106 и Trichodesmium erythraeum IMS 101). Вторая группа образует обособленный кластер в случае белков FtsZ и CtpA (рис. 3 А и 4 Б). В то же время по белку ThiD данные цианобактерии не кластеризуются (рис. 3 Б).

Таким образом, на примере Pleurocapsa sp. CALU 1126 впервые для группы плеврокапсовых цианобактерий определены нуклеотидные последовательности гена ftsZ и фланкирующих его генов. Показано также, что структура локуса ftsZPleurocaposa sp. CALU 1126 различается у разных цианобактерий, равно как и филогения, прослеживаемая по его отдельным генам. Такой неординарный факт требует более глубокого анализа на основе дальнейшего накопления экспериментальных данных.

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии и клеточная биология» ГНУ ВНИИСХМ ОЗ Россельхозакадемии (ГК Министерства образования и науки № 16.552.11.7047).

ЛИТЕРАТУРА

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., 1984. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 480 с.

2. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al., 1990. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. Vol. 215. P. 403-410.

3. Anbudurai P. R., Mor T. S., Ohad I. et al., 1994. The ctpA gene encodes the C-terminal processing protease for the D1 protein of the photosystem II reaction center complex // Plant Biol. Vol. 91. P. 8082-8086.

4. Barabas O., RonningD.R., Guynet C. et al., 2007. Mechanism of IS200/IS605 family DNA transposases: activation and transposon-directed target site selection // Cell. Vol. 132. P. 208-220.

5. Billi D, Caiola M. G., Paolozzi L. et al., 1998. A method for DNA extraction from the desert cyanobacterium Chroococcidiopsis and its application to identification of ftsZ gene // Appl. Environ. Microbiol. Vol. 64. P. 4053-4056.

6. Blank C.E., Sanchez-Baracaldo P.A., 2010. Timing of morphological and ecological innovations in the cy-anobacteria — a key to understanding the rise in atmospheric oxygen // Geobiology. Vol. 8. P. 1-23.

7. DelihasN, 2009. Stem-loop sequences specific to transposable element IS605 are found linked to lipoprotein genes in Borreliaplasmids // PLoS ONE. Vol. 4. P. 1-10.

8. Errington J., DanielR. A., Scheffers D.-J., 2003. Cytokinesis in bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol. 67. P. 52-65.

9. Faguy D.M., Doolittle W.F., 1998. The evolution of cell division // Curr. Biol. Vol. 8. P. R338-R341.

10. Goericke R., Welschmeyer A., 1993. The marine pro-chlorophyte Prochlorococcus marinus contributes significantly to phytoplankton biomass and primary production in the Sargasso Sea // Deep-Sea Res. Vol. 40. P. 2283-2294.

11. Grant S. G. N., Jessee J., Bloom F. R., 1990. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restric-tion mutant // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 87. P. 4645-4649.

12. Hiroaki I., Nogima H., Okayama H, 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. Vol. 96. P. 23-28.

13. Inagaki N., Maitra R., Sato K. et al., 2001. Amino acid residues that are critical for in vivo catalytic activity of CtpA, the carboxyl-terminal processing protease for the D1 protein of photosystem II // J. Biol. Chem. Vol. 276. N. 32. P. 30099-30105.

14. Koksharova O.A. Wolk C.P., 2002. A novel gene that bears a DnaJ motif influences cyanobacterial cell division // J. Bacteriol. Vol. 184. P. 5524-5528.

15. Lutkenhaus J., 1998. The regulation of bacterial cell division: a time and place for it // Curr. Opin. Microbiol. Vol. 1. P. 210-215.

16. Lutkenhaus J., Addinal S. G. Bacterial cell division // Biochem. J. 1997. Vol. 66 P. 93-116.

17. Mahillon J., Chandler M, 1998. Insertion sequences // Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol. 62. P. 725-774.

18. Maple J., M0ller S. G., 2007. Plastid division: evolution, mechanism and complexity // Ann. Bot. Vol. 99. P. 565-579.

19. Mazouni K., Domain F., Cassier-Chauvat C. et al., 2004. Molecular analysis of the key cytokinetic components of cyanobacteria: FtsZ, ZipN and Min CDE // Mol. Microbiol. Vol. 52. P. 1145-1158.

20. Miyagishima S., Wolk C. P., Osteryoung K. W., 2005. Identification of cyanobacterial cell division genes by comparative and mutational analyses // Mol. Microbiol. Vol. 56. P. 126-143.

21. Mizote T., Tsuda M., Smith S. et al., 1999. Cloning and haracterization of the thiD/J gene of Escherichia coli encoding a thiamine-synthesizing bifunctional enzyme, hydroxymethylpyrimidine kinase/phosphomethylpyrim-idine kinase // Microbiol. Vol. 145. P. 495-501.

22. Nanninga N., 2001. Cytokinesis in prokaryotes and eu-karyotes: common principles and different solutions// Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol. 65. P. 319-333.

23. Norrander J., Kempe T., Messing J., 1983. Construction of improved M13 vectors using oligonucleotide-directed mutagenesis // Gene. Vol. 26. P. 101-106.

24. OsteryoungK. W., Nunnari J., 2003. The division of endosymbiotic organelles // Science. Vol. 302. P. 1698-1704.

25. Pinevich A. V., Mamkaeva K. A., Titova N. N. et al., 2004. St. Petersburg Culture Collection (CALU): four decades of storage and research with microscopic algae, cyanobacteria and other microorganisms // Nova Hedwigia. Vol. 79. P. 115-126.

26. Pinevich A. V., Matthijs H. C. P., Averina S. G. et al., 1997. Picocyanophyte (cyanobacterium) from the bo-

real inland water accumulates phycoerythrin as a major biliprotein // Algol. Studies. Vol. 87. P. 99-108.

27. Robson S. A., King G. F., 2006. Domain architecture and structure of the bacterial cell division protein DivlB // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 103. P. 6700-6705.

28. Teplyakov A., Obmolova G., Sarikaya E. et al., 2004. Crystal structure of the YgfZ protein from Escherichia coli suggests a folate-dependent regulatory role in one-carbon metabolism // J. Bacteriol. Vol. 186. P. 7134-7140.

29. Villanelo F., Ordenes A., Brunet J. et al., 2011. A model for the Escherichia coli FtsB/FtsL/FtsQ cell division complex // BMC Struct. Biol. Vol. 11. P. 1-15.

30. WangX., Lutkenhaus J., 1996. FtsZ ring: the eubac-terial division apparatus conserved in achaebacteria // Mol. Microbiol. Vol. 21. P. 313-319.

31. Waterbury J. B., Stanier R. Y., 1978. Patterns of growth and development in pleurocapsalean cyanobacteria// Microbiol. Rev. Vol. 42. P. 2-44.

MOLECULAR ANALYSIS OF CELL DIVISDION GENES AND ADJACENT GENES IN THE CYANOBACTERIUM PLEUROCAPSA SP. CALU 1126

Skopina M. Yu, Chizhevskaya Ye. P., Andronov E. E., Pinevich A. V.

Ф SUMMARY: For the first time for cyanobacteria of the "Pleurocapsa" group (Pleurocapsa sp. CALU 1126), nucleotide sequences of cell division gene ftsZ and adjacent genome sites were determined. The comparison of this locus indicates differences in phylogeny traced by separate genes.

Ф KEY WORDS: phylogeny of cyanobacteria; Pleurocapsa; cell division; proteins FtsZ and FtsQ; CtpA protein; ThiD protein.

Ф Информация об авторах

Скопина Мария Юрьевна — м. н. с. Аспирант кафедры микробиологии. Санкт-Петербургский государственный университет. 199178, Санкт-Петербург, 16-я линия ВО, д. 29. E-mail: [email protected].

Чижевская Елена Петровна — к. б. н., с. н. с. Лаборатория генетики и селекции микроорганизмов. ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхоз-академии. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, ш. Подбельского, д. 3. E-mail: [email protected].

Андронов Евгений Евгеньевич — к. б. н. Заведующий лабораторией микробиологического мониторинга и биоремедиации почв. ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, ш. Подбельского, д. 3. E-mail: [email protected].

Пиневич Александр Васильевич — д. б. н., профессор. Заведующий кафедрой микробиологии. Санкт-Петербургский государственный университет. 199178, Санкт-Петербург, 16-я линия ВО, д. 29. E-mail: [email protected].

Skopina Mariya Yuryevna — Postgraduate student, Junior Researcher. Deptartament of Microbiology. Saint-Petersburg State University. 199034, Saint-Petersburg, Sredniy pr., VO, 29. Russia. E-mail: [email protected].

Chizhevskaya Elena Petrovna — Ph. D. Senior Researcher. Deptartament of Genetics and Breeding of Microorganisms. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology. Podbelskiy chausse, 3, Saint-Petersburg, Pushkin, 196608, Russia. E-mail: [email protected].

Andronov Evgeny Evgenyevich — Ph. D. Head of the Laboratory of Microbiological Monitoring and Mioremediation of Soils. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology. Podbelskiy chausse, 3, Saint-Petersburg, Pushkin, 196608, Russia. E-mail: [email protected].

Pinevich Aleksandr Vasilyevich — Doctor of Biological Sciences, Professor. Head of the Deptartament of Microbiology. Saint-Petersburg State University. 199034, Saint-Petersburg, Sredniy pr., VO, 29. Russia. E-mail: [email protected].