CC BY
82
УДК 577.213.3:582.232(285)
И.В. Тихонова, А.С. Гладких, О.И. Белых, Е.Г. Сороковикова
ВЫЯВЛЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНО ТОКСИЧНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В ОЗЕРЕ БАЙКАЛ И ВОДОХРАНИЛИЩАХ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Лимнологический Институт СО РАН (Иркутск)
Проведен поиск одного из генов синтеза микроцистина mcyA в цианобактериях озера Байкал и трех водохранилищ ангарского каскада с использованием, специфических праймеров и. ПЦР. В качестве контроля, применяли музейный штамм. Microcystis aeruginosa CALU 972, который в эксперименте вызывал гибель водных животных. ДНК штамма M. aeruginosa CALU 972 и ДНК фитопланктона Усть-Илимского водохранилища давали ПЦР-продукты, по длине соответствующие гену mcyA, а в ДНК байкальского фитопланктона и фитопланктона Иркутского и Братского водохранилищ ген mcyA не обнаружен. Определение нуклеотидных последовательностей ампликонов и BLAST-анализ выявили, что все они принадлежат. mcyA-генам. M. aeruginosa.
Ключевые слова: цианобактерии, токсины, микроцистин
DETECTION OF POTENTIALLY TOXIC CYANOBACTERIA IN LAKE BAIKAL AND RESERVOIRS BY POLYMERASE CHAIN REACTION
I.V. Tikhonova, A.S. Gladkikh, O.I. Belykh, E.G. Sorokovikova
Limnological Institute of SB RAS, Irkutsk
The search of gene mcyA which belongs to gene cluster of nonribosomal peptide synthetase was carried out in cyanobacteria of Lake Baikal and Irkutsk region reservoirs. Polimerase chain reaction (PCR) with specific primers was chosen as tool for its detection. Collection, toxic strain Microcystis aeruginosa CALU 972 was taken as positive control, the strain caused, death of zooplankton in food experiments. Gene mcyA was found in cyanobacteria Microcystis aeruginosa CALU 972 and. in cyanobacteria of Ust- Ilimsk reservoir, Irkutsk reservoir and Bratsk reservoir cyanobacteria didn't contain mcyA gene of toxin synthesis. Detected, gene mcyA, according sequencing data and. BLASTA-analysis was determined, as gene of Microcystis aeruginosa. Key words: cyanobacteria, toxins, microcystin
ВВЕДЕНИЕ
Цветение сине-зеленых водорослей или цианобактерий в мезо- и эвтрофных озерах и водохранилищах и вызванное этим явлением ухудшение качества воды становятся серьезной проблемой во многих странах мира. В настоящее время существует много сообщений о массовом развитии в водоемах цианобактерий, синтезирующих токсины — микроцистины [10, 13. Продуцентами микроцистинов являются повсеместно распространенные цианобактерии родов Microcystis Elenk, Anabaena Bory, Planktothrix Anagnostidis et Ko-marek [13]. Микроцистины представляют собой циклические пептиды, синтез которых осуществляется комплексом ферментов нерибосомальной пептидсинтетазы. При попадании в организм человека и животных микроцистины вызывают интоксикацию организма с последующим некрозом печени, механизм их действия заключается в ингибировании сериновых фосфатаз [6, 7]. Микроцистин очень стабилен и может оставаться токсичным после кипячения. Одним из самых известных примеров отравления микроцистинами служит гибель в Бразилии 60 пациентов из 126 при диализе [6]. По рекомендации ВОЗ во многих странах проводится мониторинг токсинов в питьевой воде. Концентрация микроцистина не должна превы-
шать 1 мкг/л для одноразового приема и 0,1 мкг/л для многократного потребления.
Основными способами определения микроци-стинов в питьевой воде являются многоступенчатые и трудоемкие хроматографические и иммуно-химические методы [12, 13]. Молекулярно-биологические технологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием специфичных праймеров, являются быстрым и точным способом оценки качества питьевой воды и определения токсичных видов цианобактерий [5]. Ранее была показана возможность выявления генов синтеза микроцистина с использованием праймеров, специфичных для гена mcyE цианобактерий рода Microcystis [4]. Целью настоящей работы является поиск в пробах воды озера Байкал и трех водохранилищ ангарского каскада фрагмента гена mcyА, кодирующего часть нерибосомальной мик-роцистинсинтетазы у цианобактерий родов Microcystis и Anabaena [11]. Ранее сообщалось, что цианобактерии родов Microcystis и Anabaena присутствуют как в Байкале, так и в водохранилищах Иркутского региона [1, 3].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пробы для исследования отбирали ежемесячно в течение 2005 года на пелагической станции в
Южном Байкале на разрезе Листвянка-Танхой от поверхности до глубины 1400 м; в Иркутском, Братском и Усть-Илимском водохранилищах — в августе 2005 года до глубины 25 м.
ПЦР проводили применяя праймеры, фланкирующие участок гена mcyA длиной 300 пар нуклеотидов [9]. Условия ПЦР были стандартные: за предварительной денатурацией при 94 °С следовало 30 циклов амплификации. В качестве положительного контроля использовали ДНК токсичного штамма M. aeruginosa CALU 972, любезно предоставленного Л.Н. Волошко (БИН, Санкт-Петербург). Данный штамм был выделен во время токсичного цветения озер в Карелии. Тесты in vivo на особях Daphnia magna и Epishura baicalensis показали, что эта цианобактерия является токсичной и приводит к летальному исходу спустя 20 часов совместной инкубации. Определение нуклеотидных последовательностей фрагмента гена проводили на секвена-торе Beckman CEQtm 8800 (Beckman Coulter Inc., USA). Далее полученные фрагменты генов сравнивали с генами других цианобактерий с помощью программы поиска гомологичных последовательностей BLASTA. Филогенетическое древо было построено по модели Кимуры, метод ближайших соседей, в программе MEGA, версия 3.1 [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе ДНК токсичного M. aeruginosa CALU 972 обнаружен ПЦР-продукт, соответствующий по молекулярной массе гену mcyA. В суммарной ДНК фитопланктона озера Байкал и фитопланктона Иркутского и Братского водохранилищ ген mcyA не выявлен. В результате тестирования ДНК фитопланктона Усть-Илимского водохранилища был зарегистрирован ПЦР-продукт длиной около 250 пар нуклеотидов, что свидетельствует о наличии mcyA гена в цианобактериях из этого водоема (рис. 1).
Анализ определенных нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLASTA выявил 97 % гомологию mcyA-гена M. aeruginosa CALU 972 с mcyA-генами штаммов M. aeruginosa 102 из озера Касумигаура (Япония), M. aeruginosa из мелких озер Финляндии и озера Онтарио. Последовательность изолята Усть-Илимского водохранилища на 96 % близка к последовательности M. aeruginosa NIES-89 из озера Кавагучи (Япония) и имеет 10 нуклеотидных и 3 аминокислотных замены по сравнению с японским изолятом. Таким образом, ген mcyA Усть-Илимского изолята принадлежит цианобактерии вида M. aeruginosa. Между генами контрольного штамма M. aeruginosa CALU 972 и M. aeruginosa Усть-Илимского водохранилища отмечены изменения 11 нуклеотидных позиций, которые привели к замене 6 аминокислот в микроцистинсинтетазе. Полученным последовательностям присвоены номера при депонировании в GenBank: DQ680154 — M. aeruginosa CALU 972, DQ683189 — M. aeruginosa из Усть-Илимско-го водохранилища.
На основе определенных генов был проведен филогенетический анализ, использованы нуклео-
Рис. 1. ПЦР-анализ суммарной ДНК фитопланктона озера Байкал и водохранилищ на наличие гена шсуД. Электрофорез в 1% агарозном геле с бромистым этидием. 1 - маркер молекулярного веса, 2 - отрицательный контроль, 3 - M. aeruginosa CALU 972, 4 - оз. Байкал, 5 - Иркутское водохранилище, 6 - Братское водохранилище, 7 - Усть-Илим-ское водохранилище. Стрелкой указана ДНК, соответствующая длине 300 пар нуклеотидов.
тидные последовательности mcyA-генов цианобактерий из GenBank (табл. 1).
Филогенетический анализ выявил наибольшую родственность mcyA-генов M. aeruginosa Усть-Илимского водохранилища с карельским штаммом M. aeruginosa CALU 972, оба вида располагаются в одной кладе. Последовательность гена mcyA M. aeruginosa Усть-Илимского водохранилища является более древней по сравнению с другими последовательностями (рис. 2).
Таким образом, один из генов нерибосомальной микроцистинсинтетазы обнаружен в фитопланктоне Усть-Илимского водохранилища. По нашим данным, он принадлежал цианобактерии M. aeruginosa, численность которой в Усть-Илимском водохранилище в августе 2005 года была на несколько порядков выше, чем в Байкале и других водохранилищах в это же время. Известно, что массовое развитие токсичных цианобактерий часто является следствием эвтрофирования водоемов. Концентрации органических веществ и биогенных элементов в Усть-Илимском водохранилище превышали ПДК в несколько раз [2]. Хроматографического анализа, который позволяет выявить наличие микроцистина и его концентрацию, не проводили.
ВЫВОДЫ
1. С помощью ПЦР-анализа показано, что в озере Байкал, Иркутском и Братском водохранилищах потенциально токсичные цианобактерии не обнаружены, а в Усть-Илимском — подтверждено наличие кластера генов микроцистинсинтета-зы цианобактерии M. aeruginosa.
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности mcyА-генов цианобактерий
Номера доступа (GenBank) Штамм цианобактерий Место выделения штамма
AJ 515453 Microcystis sp. 205 Озеро Малласярви (Финляндия)
AJ 515452 Microcystis sp. 199 Озеро Расатярви (Финляндия)
AJ 515460 M. aeruginosa PCC 7941 Озеро Малое Ридео (Канада)
AJ 515457 M. viridis NIES-102 Озеро Касумигаура (Япония)
AJ 515459 M. aeruginosa NIES-89 Озеро Кавагучи (Япония)
AJ 515458 Microcystis sp. TUM7C Озеро Таасаланярви (Финляндия)
AJ 515455 Microcystis sp. GL280646 Озеро Гранд-Лье (Франция)
AJ 515451 Microcystis sp. HUB 5.2.4 Озеро Пехлитцси (Германия)
AJ 515456 Microcystis sp. IZANCYA5 Озеро Мира (Португалия)
AJ 515454 Microcystis sp. GL260735 Озеро Гранд-Лье (Франция)
AJ 515461 Anabaena circinalis 90 Озеро Весиярви (Финляндия)
AY566856 Nostoc sp. IO-102-I Симбионт лишайника (Финляндия)
AFL515466 Anabaena cf. flos-aquae NIVA-CYA83 Озеро Эдландсватн (Норвегия)
AJ515465 Anabaena sp. 202A2 Озеро Весиярви (Финляндия)
AJ515464 Anabaena sp. 202A1/35 Озеро Весиярви (Финляндия)
AJ515463 Anabaena sp. 66B Озеро Кийккара (Финляндия)
AJ515474 Planktothrix agardhii NIVA-CYA 34 Озеро Колботнватнет (Норвегия)
AJ515473 Planktothrix sp. PCC 7821 Озеро Йершфен (Норвегия)
Рис. 2. Филогенетическое древо, построенное на основе сравнения mcyA-генов токсичных цианобактерий из GeneBank и определенных последовательностей M. aeruginosa CALU 972 и M. aeruginosa Усть-Илимского водохранилища.
2. Генетически родственным штаммом по гену mcyA для Усть-Илимского M. aeruginosa является штамм M. aeruginosa CALU 972, выделенный из мелкого озера Карелии.
Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ № 05-04-97222, Лаврентьевского конкурса молодежных проектов СО РАН № 140, гранта «Фонда поддержки отечественной науки» и гранта 2006-РИ-112./001/007.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьева С.С. Фитопланктон водоемов Лотары / С.С. Воробьева. — Новосибирск, 1995. — 126 с.
2. Кудринская Г.Б. Результаты гидрохимического мониторинга р. Вихоревой / Г.Б. Кудринская, ОА. Морева // Материалы рабочего совещания по выполнению природоохранных мероприятий ОAО «ЦКК» - ОAО «БКХ» в 2000-2003 гг. (Иркутск — Братск, 15-16 апреля 2004 г.). — Иркутск, 2004. — С. 53 — 60.
3. Поповская Г.И. Фитопланктон глубочайшего озера мира / Г.И. Поповская // Тр. ЗИН AB СССР. — 1987. — Т. 172. — С. 102—115.
4. Тихонова И.В. Лнализ цианобактерий озера Байкал и Усть-Илимского водохранилища на наличие гена синтеза микроцистина / И.В. Тихонова, О.И. Белых, Г.В. Помазкина, A.C Гладких // Докл. Лкад. Наук — 2006. — Т. 409, № 3. — С. 1—3.
5. Detection of hepatotoxic Microcystis strains by PCR with intact cells from both culture and environmental samples / H. Pan, L. Song, Y. Liu et al. // Arch. Microbiol. — 2002. — Vol. 178. — P. 421 —427.
6. Dunn J. Algae, kills dialysis patients in Brazil / J. Dunn // BMJ. - 1996. - Vol. 312. - P. 1183-1184.
7. Falconer I.R. An overview of problems caused by toxic blue green algae (cyanobacteria) in drinking and recreational water / I.R. Falconer // Environ. Toxicology. - 1999. - Vol. 14. - P. 5-12.
8. Kumar S. MEGA 3: integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment / S. Kumar, K. Tamura, M. Nei // Briefings in Bioinformatics. - 2004. - Vol. 5. -P. 150-163.
9. Phylogenetic evidence for early evolution of microcystin synthesis / A. Rantala, D. Fewer, M. His-bergues et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2004. -Vol. 101. - P. 568-573.
10. Plotzliche Todesfalle von Alprinderm im Kanton Graubunden / H. Naegeli, A. Sahin, U. Braun et al. // Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. - 1997. - Vol. 139. - P. 201 -209.
11. Quantitative real-time PCR for determination of microcystin synthetase E copy numbers for Microcystis and Anabaena in Lakes / J.A. Vaitomaa, K. Rantala, T. Halinen et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69. - P. 7289-7297.
12. Quellette A. Toxic Microcystis is widespread in Lake Erie: PCR detection of toxic genes and molecular characterization of associated cyanobacterial communities / A. Quellette, S. Handy, S. Wilhelm // Microb. Ecol. - 2006. - Vol. 51. - P. 154-165.
13. Sivonen K. A quite to their public health consequences, monitoring and management / K. Sivonen, G. Jones // Toxic cyanobacteria in water. -London: E&FN Spon, 1999. - P. 41-111.
