МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ АСЕПТИЧЕСКОГО НЕКРОЗА ГОЛОВКИ БЕДРЕННОЙ КОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»



УДК 616.718.41-002.4-092.4

https://doi.org/10.23946/2500-0764-2022-7-4-72-82

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ АСЕПТИЧЕСКОГО НЕКРОЗА ГОЛОВКИ БЕДРЕННОЙ КОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

ШАБАЛДИН Н.А.1*, СИНИЦКАЯ А.В.2, БОГДАНОВ Л.А.2, ЛОБОВ А.А.3, РЕПКИН Е.А.4, ШАБАЛДИН А.В.2

гФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Кемерово, Россия

2ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» г. Кемерово, Россия

3ФГБУН Институт цитологии Российской академии наук, г. Санкт-Петербург, Россия

4ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», г. Санкт-Петербург, Россия

Резюме

Цель. Изучить молекулярные и клеточные особенности развития асептического некроза головки бедренной кости в эксперименте.

Материалы и методы. Проведена хирургическая индукция асептического некроза головки бедренной кости 8 крысам. Наблюдение за животными проводилось в течение 4 недель. У всех животных, после выведения из эксперимента путем декапитации, была забрана кровь для сравнения системных показателей, а также выполнена экстирпация бедренных костей. Состояние головок выделенных бедренных костей оценивалось визуально, рентгенологически. Затем остеотомом выполнялось разделение головок бедренных костей на две равновеликие части. Первая часть исследовалась гистологически, вторая часть использовалась для определения молекулярной массы белков костной ткани с помощью гель-электрофореза.

Результаты. После выполнения хирургических манипуляций во всех исследуемых случаях наблюдалась картина стадии импрессионно-го перелома при асептическом некрозе головки бедренной кости, подтвержденная при исследовании макропрепарата и рентгенографии. Гистологическое исследование так же подтвердило развитие остеодеструктивных процессов в проксимальном эпифизе бедра. При иммунологическом исследовании крови после индук-

ции асептического некроза головки бедренной кости отмечалось увеличение концентрации провоспалительных цитокинов по отношению к концентрации нативных крыс. Метод квадру-польно-времяпролетной масс-спектрометрии позволил обнаружить несколько мажорных белков, участвующих в поддержании гомеос-таза костной ткани, ими оказались белки, отвечающие за кальций-фосфорный обмен, протеины, способствующие ангиогенезу, кроветворению костного матрикса, молекулы передачи межклеточных сигналов, молекулы-шапероны, белки хрящевого матрикса, синтеза коллагена, белки липидного профиля, а также для конечности после хирургической индукции асептического некроза - протеины, регулирующие воспалительный ответ, белки окислительного стресса. Полученные данные при исследовании гель-электрофореза указывают на то, что развитие аваскулярного остеонекроза сопровождалось гиперэкспрессией белков окислительного стресса, гликолитических процессов, неспецифического воспалительного ответа при снижении молекул ангиогенеза, хондрогенеза, способствующих кальций-фосфорному обмену, синтеза коллагена и хрящевого матрикса.

Заключение. Развитие остеонекроза сопровождается значительной гетерогенностью изменений регуляции костного гомеостаза. При этом важную роль в манифестации костной де-

Для цитирования:

Шабалдин Н.А., Синицкая А.В., Богданов Л.А., Шабалдин А.В. Молекулярные и клеточные особенности развития асептического некроза головки бедренной кости в эксперименте. Фундаментальная и клиническая медицина. 2022;7(4): 72-82. https://doi. org/10.23946/2500-0764-2022-7-4-72-82

*Корреспонденцию адресовать:

Шабалдин Никита Андреевич, 650056, Россия, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а, E-mail: shabaldin.nk@yandex.ru © Шабалдин Н.А. и др.

струкции играют процессы неспецифического воспаления, окислительного стресса, в том числе перекисного окисления липидов, развивающиеся на фоне гипоксии.

Ключевые слова: асептический некроз, патогенез, протеомный профиль, сигнальные пути.

Конфликт интересов

Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов.

Источник финансирования

Исследование выполнено за счет финансирования гранта «Президента Российской Фе-

ORIGINAL RESEARCH

дерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук», МК-4132.2022.3. Работы по протеомному профилированию и анализу протеомных данных выполнены в Ресурсном центре «Развитие молекулярных и клеточных технологий» Научного парка Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет» (СПбГУ) в рамках договора № С-111/26 от 02.08.2021 г. между НИИ КПССЗ и СПбГУ.

MOLECULAR AND CELLULAR FEATURES OF FEMORAL HEAD AVASCULAR NECROSIS: IN VIVO STUDY

NIKITA A. SHABALDIN1 *, ANNA V. SINITSKAYA2, LEO A. BOGDANOV2, ARSENIY A. LOBOV3, EGOR A. REPKIN4, ANDREY V. SHABALDIN2

Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russian Federation

2Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation

3Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russian Federation

4St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation

Abstract

Aim. To study the molecular and cellular features of femoral head avascular necrosis in the rat model.

Materials and Methods. Femoral head avascular necrosis was surgically induced in 8 rats with the 4-week follow-up. Then, the animals have been euthanised, and we performed gross, radiological, and histological examination of avascular and intact contralateral femoral heads. Systemic inflammation was assessed using enzyme-linked immunosorbent assay, and pro-inflammatory cytokines (interleukin-ip, interleukin-6, and tumor necrosis factor a). The proteomic profile of healthy and necrotic femoral heads was interrogated using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and ultra-high performance liquid chro-matography-tandem mass spectrometry with ion mobility (TimsToF Pro).

Results. Aseptic necrosis of the femoral head was successfully induced in all rats. Serum lev-

els of pro-inflammatory cytokines (interleukin-ip and interleukin-6) were higher in rats with femoral head avascular necrosis as compared with healthy rats. Among the major proteins revealed at proteomic profiling were those involved in maintaining bone tissue homeostasis, calcium phosphate metabolism, angiogenesis, hematopoiesis, cell-cell interactions, chaperones, cartilage matrix proteins, collagen synthesis, and lipid metabolism. In bones with avascular necrosis, we have also found proteins regulating the inflammatory response and oxidative stress. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis indicate that the development of avascular osteonecrosis was accompanied by an overexpression of oxidative stress proteins, anaerobic glycolysis, and non-specific inflammatory response along with the downregu-lation of molecules responsible for angiogenesis, chondrogenesis, calcium phosphate metabolism, collagen synthesis, and cartilage matrix.

Conclusion. Femoral head avascular necrosis is

4 English

For citation:

Nikita A. Shabaldin, Anna V. Sinitskaya, Leo A. Bogdanov, Andrey V. Shabaldin. Molecular and cellular features of femoral head avascular necrosis: in vivo study. Fundamental and Clinical Medicine. (In Russ.). 2022;7(4): 72-82. https://doi.org/10.23946/2500-0764-2022-7-4-72-82

*Corresponding author:

Dr. Nikita A. Shabaldin, 22a, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056, Russian Federation, E-mail: shabaldin.nk@yandex.ru © Nikita A. Shabaldin, et al.

accompanied by non-specific inflammation, oxidative stress, and lipid peroxidation all presumably developed because of hypoxia and together contributing to bone destruction.

Keywords: avascular necrosis, pathogenesis, proteomic profile, signaling pathways. Conflict of Interest None declared.

Funding

The research was carried out by funding the grant of the "President of the Russian Federation for state support of young Russian scientists -Candidates of Sciences", MK-4132.2022.3. Pro-teomics analysis was conducted in the Centre for Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University Research Park.

Введение

Заболевания с прогрессирующими остео-деструктивными процессами в их патогенезе, такие как остеохондропатии различной локализации, асептический некроз, ювенильный идиопатический артрит и другие, вносят существенный вклад в общую инвалидность от хронических заболеваний. Частота данной патологии не имеет тенденции к снижению, а методы таргетной терапии продолжают разрабатываться [1, 2, 3]. В последнее время, на фоне развития теоретических представлений о процессах регуляции костного гомеостаза и его нарушениях, возрос интерес к изучению патогенеза остеонекроза на молекулярном и клеточном уровне. Такой подход открывает новые диагностические возможности прогнозирования течения костно-некротических процессов, разработку вариантов таргетного медикаментозного воздействия на процессы костной деструкции и ремоделирование при помощи генно-инженерных препаратов. В первую очередь, данные стратегии лечения основаны на коррекции межклеточных, внутриклеточных сигнальных путей активации остеокластогенеза, остеоб-ластогенеза. При этом внедрение новых алгоритмов терапии, диагностики базируется на теоретических представлениях о развитии кост-но-деструктивных процессов на разных стадиях.

Поддержание костного гомеостаза является динамическим процессом, обеспеченным равновесием в остеогенных и остеолитиче-ских процессах. Однако пролонгированное течение артропатий может сопровождаться смещением баланса в сторону усиления биологической активности остеокластов и, как следствие, прогрессирования разрушения костной, хрящевой тканей. При этом процесс развития асептического некроза стадийный, и проходит последовательно стадии от дорентгенологиче-ской, импрессионного перелома, фрагментации до репарации с восстановлением костных

балок. На начальной стадии субхондрального перелома наиболее активно изучаются механизмы нарушения молекулярных и клеточных связей, приводящих к усилению остеокласто-генеза [4].

Процессы дифференцировки и активации остекластов и остеобластов осуществляются за счет функционирования ряда межклеточных, внутриклеточных сигнальных путей молекулярного взаимодействия, таких как сигнальные пути с активацией бэта-катенина, фермента JAK-киназы, рецептора активатора ядерного фактора каппа-в (RANK-RANKL-OPG, wnt - в катенин, JAK-STAT). Этот сигналинг регулируются разнообразными медиаторами (цитокины, костные морфогенные белки, и ряд других медиаторов) [5]. Цитокины - сигнальные полипептидные молекулы, биологическое действие на клетку-мишень у которых осуществляется за счет высокоаффинных мембранных рецепторов. Изменение концентрации различных групп цитокинов может влиять на костный го-меостаз опосредованно через сигнальный путь RANK-RANKL-OPG [6]. Так, увеличение экспрессии провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин 1 бэты (IL-1b), фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), интелейкина-6 (IL-6), приводит к усилению выработки лиган-да рецептора активатора ядерного транскрипционного фактора (RANKL) на Т-лимфоцитах [7]. Связывание рецептора активатора ядерного транскрипционного фактора (RANK) с его лигандом (RANKL) ведет через серию внутриклеточных сигнальных путей к транскрипции ядерного фактора кв (NF- кв) в ядро клетки с последующим индуцированием дифференци-ровки и активации зрелых остеокластов. Таким образом, биологическое действие провоспали-тельных цитокинов может способствовать усилению остеокластогенеза. Тем не менее механизмы, приводящие к нарушению регуляции костного гомеостаза, остаются до конца не изученными.

Цель исследования

Изучить молекулярные и клеточные особенности развития асептического некроза головки бедренной кости в эксперименте.

Материалы и методы

Исследование выполнено согласно «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», принятой Советом Европы (Strasbourg, Франция, 1986) и Директивой Совета 86/609/ ЕЕС от 24.11.1986 «По согласованию законов, правил и административных распоряжений стран участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и научных целях».

Модельный эксперимент выполнен на малых животных (крысы линии Wistar) массой тела 250 г, в возрасте 3 месяцев. Проведена хирургическая индукция асептического некроза головки бедренной кости 8 крысам. Наблюдение за животными проводилось в течение 4 недель. Выведение животных из эксперимента проводилось путем декапитации гильотинным способом. Для подтверждения наличия факта остеонекроза головки бедренной кости проводились клиническое, рентгенологическое, гистологическое, биохимические и иммунологические исследования.

Для индукции асептического некроза головки бедренной кости у крыс под общим ингаляционным наркозом раствором изофлюра-на (99,9%) выполнялся хирургический доступ длинной до 3 см в проекции тазобедренного сустава по наружной поверхности одной тазовой конечности. Тупо разводились мягкие ткани в области большого, верхней трети третьего вертела бедренной кости. Распатором производилась круговая отслойка с последующим иссечением надкостницы в проксимальной трети третьего вертела. Визуализировалась шейка бедренной кости, вокруг которой накладывалась плотная лигатура из викрила диаметром 35 мм. В полость тазобедренного сустава под визуальным контролем вводилось 1,5 мл. 2% раствора реополиглюкина, что увеличивало внутрисуставное давление и создавало предпосылки для формирования коллапса головки бедренной кости. Послойно швы на рану.

После выведения животных из эксперимента проводилась экстирпация бедренных костей. Бедренная кость после индукции асептического некроза проксимального эпифиза относи-

лась к основной группе. Интактная бедренная кость с контралатеральной стороны относилась к группе сравнения.

У всех животных после декапитации была забрана кровь. Для сравнения системных показателей в крови декапитированы 4 интактные крысы без хирургической индукции асептического некроза (группа сравнения для системных показателей).

Состояние головок выделенных бедренных костей основной и группы сравнения было оценено визуально, а также выполнено их рентгенологическое исследование. Далее отсекался проксимальный эпифиз бедренной кости и разрезался остеотомом на две равные части (5070 мг). Первая часть головки бедренной кости фиксировалась в 10% растворе формалина для дальнейшего проведения гистологического анализа, а другая - в аликвоту с предварительно охлажденным (4°С) T-PER буфером (78510, Thermo Fisher Scientific) c коктейлем ингибиторов протеаз и фосфотаз (78444, Thermo Fisher Scientific) для выделения белка.

Первая часть головки бедренной кости использовалась для гистологического исследования. Декальцинация препарата проводилась бескислотным способом. Гистологические препараты окрашивались гематоксилин-эозином и микроскопировались при увеличении х50, х100, х200.

Для определения молекулярной массы белков костной ткани со стороны хирургической индукции асептического некроза головки бедренной кости и с интактной стороны проводили гель-электрофорез в полиакриламид-ном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Одинаковое количество белка и маркер молекулярных масс Novex Sharp Pre-Stained (LC5800, Thermo Fisher Scientific) загружали в коммерческий 1,5 мм гель NuP-AGE 4-12% Bis-Tris (NP0009, Thermo Fisher Scientific) Окраска геля проводилась с помощью Coomassie brilliant blue (Кумасси G-250) (0120, ПанЭко). Интенсивность окрашивания белковых пятен (бендов) анализировалась с использованием программного обеспечения Im-ageJ. Для полуколичественной оценки использовали процентное отношение к отдельной интенсивности окрашивания к общей суммарной интенсивности окрашивания всех бендов электрофореза.

Для предварительной оценки протеома головки бедренной кости была выполнена ква-

Рисунок 1.

Макропрепарат. А - интактная кость, Б - асептический некроз.

Figure 1.

Gross examination. A - intact bone, B -avascular necrosis.

друпольно-времяпролетная масс-спектроме-трия образцов, полученных от 1 особи, методом ионизации электрораспылением (ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»). Получена информация по моноизотопной массе идентифицированных белков.

Из всех образцов крови, полученных после декапитации, выделялась сыворотка методом центрифугирования свернувшейся крови на 1,5 тысячи оборотов в минуту (LMC-56, Biosan) в течении 10 минут. Определение концентрации в сыворотке крови провоспалительных цито-кинов IL-1b (SEA563Ra, Cloud-clone), TNF-a (SEA133Ra, Cloud-clone), IL-6 (SEA079Ra, Cloud-clone) проводили с использованием коммерческих наборов согласно прилагаемым инструкциям. На биохимическом анализаторе (Architect 4000C, Abbott, USA) определялись концентрации кальция, фосфора и щелочной фосфатазы.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica for Windows фирмы Stat Soft Inc (США), версия 10.0. Нормальность распределения выборок оценивали с помощью W-теста Шапиро-Уил-ка. Проверка на нормальность распределения показала, что данные в исследовании имеют нормальное распределение. Поэтому в дальнейшем расчеты производились методами параметрической статистики. Номинальные данные описывались с указанием абсолютных значений, процентных долей (%). Количественные

данные представляли в виде средней и стандартной ошибки (М+т). Сравнение значений уровней метрических показателей в несвязанных выборках проводили с помощью критерия Стьюдента.

Результаты

После выполнения представленных хирургических манипуляций во всех исследуемых случаях (100%) наблюдалось развитие асептического некроза головки бедренной кости. При этом при выведении животных из эксперимента на 4-й неделе течения аваскулярно-го некроза головки бедренной кости соответствовало стадии импрессионного перелома. Так, при макроскопическом исследовании головки бедренной кости со стороны индукции асептического некроза были выявлены: эллипсоидная форма, отчетливо выраженное склерозирование со снижением высоты эпифиза, шейка бедра была истончена и уменьшена в размере, в то время как с контрлатеральной, условно-здоровой, стороны патологических изменений, характерных для аваскулярного некроза, не обнаруживалось ни в одном случае, то есть в 100% головка бедра была интакт-ной (рисунок 1).

При рентгенологическом исследовании бедренных костей основной и группы сравнения были выявлены изменения в основной группе в 100%. Так, в проксимальном отделе бедренной кости отмечались выраженные явления остео-пороза. При этом головка бедренной кости была значительно уплощена, что отображалось в уменьшении эпифизарного индекса со стороны хирургического вмешательства по отношению к условно-здоровой контрлатеральной стороне. Так, эпифизарный индекс на стороне индукции асептического некроза составил 38,06 + 2,31%, на интактной стороне - 47,75 + 3,08% (р<0,05). В целом рентгенологическая и макроскопическая картина после хирургической индукции асептического некроза соответствовала стадии импрессионного перелома (рисунок 2).

При проведении гистологического исследования головки здоровой бедренной кости было выявлено, что в диафизе имело место плотное параллельное расположение костных пластинок, ядра остеоцитов были овоидные нормохромные. В костно-мозговом канале обнаруживался обильный клеточный костный мозг.

В патологически измененной головке бедренной кости в диафизе прослеживалась волнообразность расположения костных пластинок, а ядра остеоцитов были пикнотич-ны (уменьшены и гиперхромны), а также отмечалась потеря части остеоцитов. Имелось разрастание плотной неоформленной соединительной ткани на поверхности головки бедренной кости по очаговому и неравномерному типам. Пластинка роста на патологической стороне была с явным дистрофическим изменением в виде разрежения межклеточного вещества и образования в нем полостей с беспорядочным расположением ядер хондроцитов (рисунок 3).

Рисунок 2.

Рентгенологическое исследование. А - асептический некроз, Б - интактная кость.

Figure 2.

X-ray examination. A - avascular necrosis, B - intact bone.

Рисунок 3.

Гистологическое исследование. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х50. А - асептический некроз, Б -интактная кость.

Figure 3.

Histological examination. Hematoxylin and eosin staining, *50 magnification. A -avascular necrosis, B - intact bone.

При исследовании протеинового профиля (по молекулярной массе) головок бедренных костей с помощью гель-электрофореза в по-лиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (SDS-PAGE) обнаружено распределение белков по молекулярной массе от 20 до 260 кДА. Построение количественных профилей осуществлялись посредством анализа бендов с использованием программного обеспечения ImageJ. Данный подход позволил выявить некоторые особенности экспрессии протеинов в стадии импрессионного перелома головки бедренной кости. Манифестация асептического некроза головки бедренной кости сопровождалась значимым усилением (по отношению к группе сравнения) экспрессии белков с молекулярной массой 27-28кДа, 33 кДа, 53 кДа. Также со стороны костной деструкции отмечалось снижение, по отношению к группе сравнения, протеинов молекулярной массы 30 кДа, 41-45кДа, 95кДА, 260 кДа (рисунок 4).

Рисунок 4.

Результаты гель электрофореза в денатурирующих условиях (SDS-ПААГ), окраска Coomassie brilliant blue.

Figure 4.

Sodium

dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis, Coomassie brilliant blue staining.

Метод квадрупольно-времяпролетной масс-спектрометрии образцов позволил определиться с моноизотопной массой и изоэлектрической точкой протеинов из патологической и здоровой головок бедренных костей. Было выделено несколько мажорных белков: белки, отвечающие за кальций-фосфорный обмен (Апха1, Са1г, S100a8, S100a9), протеины, способствующие ангиогенезу, кроветворению костного ма-трикса (АЬ^, Mfge8), молекулы трансдукции, транскрипции, передачи межклеточных сигна-

лов (Fn1, Vim, Ppia, Taldo1, Hpx, Eef2), моле-кулы-шапероны, участвующие в активации экспрессии генов (Hsp90ab1), белки хрящевого ма-трикса, синтеза коллагена (Col2a1, Fmod, Dcn), белки липидного профиля (Apoa1). Для конечности после хирургической индукции асептического некроза были дополнительно обнаружены протеины, регулирующие воспалительный ответ (Ywhae, Rhoa, Igg-2a, Pdzk1, A1bg), белки окислительного стресса (Pgam1, A1m, Ca1, Са3). Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Группы мажорных белков костной ткани.

Table 1.

Major protein groups within the rat femoral heads.

Функция / Function Наименование / Name Моноизотопная масса / Monoisotopic mass

Участие в кальций-фосфорном обмене / Calcium phosphate metabolism Аннексии A1 / Annexin A1 (Anxal) 1Б7114

Кальретикулин / Calreticulin (Calr) 114334

Кальгранулин А8 / Calgranulin A8 (S100a8) 127397

Кальгранулин А9 / Calgranulin A9 (S100a9) 13G5B7

Альфа-2-Ь^-гликопротеин / Alpha-2-HS-glycoprotein (Ahsg) 3G9231

Ангиогенез, кроветворение костного матрикса / Angiogenesis and hematopoiesis Лактадгерин / Lactadherin (Mfge8) 651B1

Передача мехжклеточных сигналов, трансдукция, трансляция / Cell-cell interactions, signal transduction, and translation Виментин / Vimentin (Vim) 1ббБ3Б

Пептидилпролилизомераза А / Peptidylprolyzomerase A (Ppia) 1G4124

Трансальдолаза-1 / Transaldolase-1 (Taldol) 112391

Гемопексин / Hemopexin (Hpx) 3ББб37

Эукариотический фактор элонгации 2 / Eukaryotic elongation factor 2 (EEF2) 271B45

Фибронектин / Fibronectin (Fn1) 10ББ74

Молекулярные шапероны / Chaperones Белок теплового шока 90 / heat shock protein 90 (Hsp90ab1) B2924

Синтез коллагена, образование хрящевого матрикса / Collagen synthesis, cartilage matrix formation Коллаген II типа класса альфа-1 / Type II collagen of class alpha-1 (Col2a1) 139297

Фибромодулин / Fibromodulin (Fmod) 152B72

Декорин / Decorin (Dcn) 12635G

Регулировка воспалительного ответа / Regulation of the inflammatory response Белок 14-3-3 эпсилон (e) / 14-3-3 epsilon (e) protein (Ywhae) 264GG3

ГТФаза / GTPase protein (Rhoa) 116249

Альфа 1-В гликопротеин / Alpha 1-B Glycoprotein (A1bg) 1G7667

Иммуноглобулин G / Immunoglobulin G (Igg-2a) 1677BB

Домен, содержащий белок 1 / Domain containing protein 1 (Pdzk1) 136994

Окислительный стресс / Oxidative stress Фосфоглицерат-мутаза / Phosphoglycerate mutase (Pgam1) 1395G6

Альфа-1-Микроглобулин / Alpha-1-Microglobulin (A1m) 112Б36

Карбоангидраза 1 / Carbonic Anhydrase 1 (Ca1) 123G26

Карбоангидраза 3 / Carbonic Anhydrase 3 (Са3) 1Б2496

Белки липидного профиля / Lipid metabolism Аполипопротеин А1 / Apolipoprotein A1 (Apoa1) 1127B5

С учетом данных гель электрофореза в денатурирующих условиях (SDS-ПААГ), где оценивалась молекулярная масса протеинов и их полуколичественное содержание, а также результатов масс спектрометрии, где идентифицировались белки и рассчитывалась их моноизотопная масса, провели сравнительный анализ протеиновых профилей в патологических и здоровых головках бедренных костей (таблица 2). Было выявлено, что при развитии асепти-

ческого некроза усиливалась (по отношению к группе сравнения) экспрессия белков с молекулярной массой 27-28кДа (Apoal), 33 кДа (Akrlal, Akrlbl, Pgaml, Krtl, Taldol), 53 кДа (Capl, Albg, Igg2a). В то же время в патологической головке бедренной кости было значимо меньше, чем в здоровой конечности, протеинов с молекулярной массой 30 кДа (Mfge8), 41-45кДа (Bgn, Fmod, Calr), 95кДА (Fnl, Ahsg), 260 кДа (Col2a1, Comp) (таблица 2).

Молекулярная масса / Здоровая головка бедра, интенсивность окрашивания бенда, в % Асептический некроз головки бедра, интенсивность окрашивания бенда, в % (M Значимое различие, p / Significant differences, p value

Molecular weight (M+m) / Healthy femoral + m) / Femoral head avascular

head, band staining intensity, % (M + m) necrosis, band staining intensity, % (M + m)

260 (Col2a1, Comp) 3,039514 t 0,017561 0,351865 t 0,013849 < 0,05*

210 6,079027 t 0,125739 5,629838 t 0,359247

155 4,255319 10,024183 2,111189 t 0,015396

95 (Fn1, Ahsg) 3,647416 t 0,035517 0,70373 t 0,007347 < 0,01*

80 3,039514 t 0,017269 2,111189 t 0,018294

75 5,775076 t 0,274396 5,700211 t 0,329164

62 12,76596 t 1,037429 14,0746 t 3,216438

53 (Cap1, A1bg, Igg2a) 1,823708 t 0,002695 10,55595 t 0,015319 < 0,01*

45 (Fmod, Calr) 3,647416 t 0,14692 0,70373 t 0,002175 < 0,05*

41 (Bgn) 8,510638 t 1,007541 4,926108 t 0,918372 < 0,05*

33 0,607903 t 0,001427 5,629838 t 0,729416 < 0,01*

30 (Mfge8) 5,471125 t 0,217349 0,70373 t 0,008431

27 (Apoa1) 0,303951 t 0,000948 10,55595 t 2,416739 < 0,001*

26 1,215805 t 0,082462 0,351865 t 0,027413

21 1,215805 t 0,053429 0,351865 t 0,0152287

14 36,00304 t 5,613275 34,48276 t 6,091246

8,1 2,59878 t 0,053162 0,351865 t 0,013392

Сумма по средним

значениям / Average 100 100

values

Таблица 2.

Результаты анализа экспрессии групп белков с помощью программы ImageJ и их идентификации методом масс-спектрометрии.

Table 2.

Expression of protein groups in rat femoral heads with and without avascular necrosis (mass spectrometry identification combined with ImageJ densitometry analysis).

Примечание: Отмечены * только различия с p < 0,05; Название белков и их функция представлены в таблице 3.

В целом полученные результаты указывают на то, что развитие аваскулярного остеонекроза сопровождалось гиперэкспрессией белков окислительного стресса, гликолитических процессов, неспецифического воспалительного ответа, при снижении молекул ангиогенеза, хондрогенеза, способствующих кальций-фосфорному обмену, синтеза коллагена и хрящевого матрикса. Концентрация белков трансдукции сигналов не изменялась.

При биохимическом исследовании крови определялось значимое увеличение концентрации щелочной фосфатазы, что свидетельствует о нарушении костного гомеостаза (таблица 3). Как видно из

*p < 0.05. Names and functions of the proteins are presented in Table 3.

таблицы, кальциевый и фосфорный обмены при индукции асептического некроза не изменялись.

При иммунологическом исследовании крови у крыс основной и группы сравнения были отмечены следующие изменения (таблица 4). Так, после индукции асептического некроза головки бедренной кости отмечалось увеличение концентрации провоспалительных цитокинов по отношению к концентрации в крови нативных крыс. Значимо усилился синтез IL-1b и IL-6. Полученные данные в целом соответствуют результатам большинства исследований и подтверждают значимость воспалительного звена в патогенезе остеодеструкции.

Таблица 3.

Результаты биохимического исследования крови у лабораторных животных.

Table 3.

Results of the biochemical profiling in rats with and without femoral head avascular necrosis.

Таблица 4.

Результаты иммунологического исследования крови у лабораторных животных.

Table 4.

Results of cytokine measurement in rats with and without femoral head avascular necrosis.

Аналиты / Асептический некроз, n = 8/ Нативные крысы, n = 4 / Intact rats, n = 4 Значимое различие, p

Analytes Femoral head avascular / Significant

necrosis, n = 8 differences, p value

Щелочная фосфатаза, ед/д / 235,76 +2B,79 164,5 i 12,3 p < 0,05*

Alkaline phosphatase, IU/L

Кальций, моль/л / Calcium, mol/L 2,17 +0,09 2,15 i 0,09

Фосфор, моль/л / 4,32 +0,64 2,7 i 0,54

Phosphate, mol/L

Примечание: Отмечены * только различия с p < 0,05 *p < 0.05

Аналиты / Analytes Асептический некроз, n = 8/ Femoral head avascular necrosis, n = 8 Нативные крысы, n = 4 / Intact rats, n = 4 Значимое различие, p / Significant differences, p value

IL-1ß, пг!мл I pgImL 169,66 +34,15 123,06 i 4,37 p < 0,05*

TNF-a, пг!мл I pgI mL 50,44 +9,37 51,17 i 2,41

IL-6, пг!мл I pgImL 95,72 +41,1B 60,41 i 3,3B p < 0,01*

Примечание: Отмечены * только различия с p < 0,05

Тем самым проведенное обследование показало индукцию асептического некроза головки бедренной кости малых экспериментальных животных с помощью хирургического метода. При манифестации асептического склероза меняется протеиновый профиль головки бедренной кости и имеют место системные изменения в виде увеличения щелочной фосфатазы и про-воспалительных цитокинов (ГЬ-1Ь и ГЬ-6).

Обсуждение

Выполненная исследовательская работа отобразила гетерогенность процесса развития асептического некроза головки бедренной кости с активацией большого количества медиаторов межклеточных взаимодействий. При этом важная роль принадлежит способу моделирования остео-деструктивных процессов. Предложенный метод хирургической индукции асептического некроза головки бедренной кости способствует формированию очага гипоперфузии как предрасполагающего фактора и увеличению внутрисуставного давления, как производящего фактора в генезе деструктивного коксартроза. В результате выполнения представленных хирургических манипуляций у всех крыс удалось достичь манифестации аваскулярного некроза, который был подтвержден на основании данных рентгенографии, макроскопически и гистологическом исследованиях. При этом рентгенологическая картина и макропрепарат соответствовали стадии импресси-онного перелома.

*p < 0.05

Биохимическое исследование подтверждает нарушения метаболизма костной ткани. Известно, что увеличение концентрации ЩФ развивается на фоне заболеваний костной ткани, таких как болезнь Педжета, различные формы остеомаляции, рахит, опухоли костей. Значимо большая концентрация ЩФ у крыс после хирургической индукции асептического некроза по отношению к интактным крысам может свидетельствовать об активной стадии развития остеодеструкции, увеличении активности остеокластов. При этом значимых изменений в концентрации кальция и фосфора отмечено не было.

Цитокиновый статус при остеодеструкции, по данным иммунологического исследования, характерен для развития неспецифического воспаления. Увеличение концентрации провоспалительных цитокинов обуславливает усиление биологического действия последних. Особенности цитоки-нового коктейля при течении остеонекроза могут приводить к индукции остеокластогенеза, по средствам сигнального пути RANK-RANKL-OPG. Ряд исследований асептического некроза головки бедренной кости также подтверждает усиление экспрессии медиаторов воспаления в патогенезе остеодеструкции [8, 9]. Однако концентрация различных групп провоспалительных цитокинов различалась в зависимости от стадии аваскулярного некроза. Так, требуется дальнейшее изучение механизмов, приводящих к смещению баланса цито-кинового статуса в сторону преобладания экспрессии провоспалительных пептидов.

В выполненном исследовании проведен анализ белкового профиля с помощью гель-электрофореза и масс-спектрометрии. Квадрупольно-вре-мяпролетная масс-спектрометрия использована на образцах, полученных от 1 особи. Тем не менее, данное исследование помогло в идентификации белков на гель-электрофорезе, а также позволило выделить ряд мажорных белков, которыми оказались протеомы, способствующие межклеточной передачи сигналов, хондрогенезу, ангиогенезу.

Изучение результатов гель-электрофореза позволило определить некоторые закономерности изменений концентрации отдельных групп белков при развитии остеонекроза. Остеодеструкция сопровождалась снижением пептидов ангиогенеза, кровоснабжения костного матрикса (Mfge8, Ahsg), хондрогенеза (Fmod), синтеза коллагена (Col2a1), хрящевого матрикса (Comp) на фоне роста регуляторов воспаления (Igg2a), окислительного стресса (Apoal), глюколитических процессов (Taldol, Pgaml). Исследование транскриптома при развитии асептического некроза головки бедренной кости у крыс, выполненное Adapala NS и Kim HKW, отобразило стадийность экспрессии генов в зависимости от времени, прошедшего с момента хирургической индукции остеонекроза [10]. Так, через 2 недели наиболее активными были гены деминерализации белков, окислительных реакций, ангиогенеза, образование хрящевого матрикса. Через 1 месяц при сохраняющейся активности генов

ишемически-гипоксического повреждения усиливалась экспрессия генов, кодирующих медиаторы воспаления, при этом снижалась концентрации генов остеогенеза. В целом результаты проведенного исследования также подтверждают гетерогенность межклеточных взаимодействий в патогенезе развития остеодеструкции, при котором ишеми-ческий фактор играет ключевую роль в развитии нарушения костного гомеостаза с преобладанием анаэробного глюколиза, перекисного окисления липидов и развитием неспецифического воспаления с последующим угнетением ангиогенеза, хон-дрогенеза.

Заключение

Развитие остеонекроза на стадии импресси-онного перелома характеризуется значительной гетерогенностью изменений регуляции костного гомеостаза и сопровождается снижением концентрации белков ангиогенеза, кровоснабжения костного матрикса (Mfge8, Ahsg), хондрогенеза (Fmod), синтеза коллагена (Col2a1), хрящевого матрикса (Comp) на фоне роста регуляторов воспаления (Igg2a), окислительного стресса (Apoal), глюколитических процессов (Taldol, Pgaml). Так, важную роль в манифестации костной деструкции играют процессы неспецифического воспаления, окислительного стресса, в том числе перекисного окисления липидов, развивающиеся на фоне гипоксии.

Литература:

Шостак Н.А., Клименко А.А., Демидова Н.А., Андрияшкина Д.Ю., Ратьев А.П., Чирков А.В., Аветисян Г.Р., Михеева Е.П. Остеонекроз головки бедренной кости, не связанный с травмой: хирургические и консервативные методы лечения (часть 2). Лечебное дело. 2021;2:4-16. https://doi.org/ 10.24412/2071-5315-2021-12387 Zhao H, Yeersheng R, Xia Y, Kang P, Wang W. Hypoxia Enhanced Bone Regeneration Through the HIF-1a/p-Catenin Pathway in Femoral Head Osteonecrosis. Am J Med Sci. 2021;362(1):78-91. https://doi.org/ 10.1016/j.amjms.2021.03.005

Adapala NS, Yamaguchi R, Phipps M, Aruwajoye O, Kim HKW. Necrotic Bone Stimulates Proinflammatory Responses in Macrophages through the Activation of Toll-Like Receptor 4. Am J Pathol. 2016;186(11):2987-2999. https://doi.org/ 10.1016/j.ajpath.2016.06.024 Нуруллина Г.М., Ахмадуллина Г.М. Костное ремоделирование в норме и при первичном остеопорозе: значение маркеров костного ре-моделирования. Архивъ внутренней медицины. 2018;8(2):100-110. https://doi.org/10.20514/2226-6704-2018-8-2-100-110 Yamaguchi R, Kamiya N, Adapala NS, Drissi H, Kim HK. HIF-1-De-pendent IL-6 Activation in Articular Chondrocytes Initiating Synovitis in Femoral Head Ischemic Osteonecrosis. J Bone Joint Surg Am. 2016;98(13):1122-1131. https://doi.org/10.2106/JBJS.15.01209

10.

Kamiya N, Kim HK. Elevation of Proinflammatory Cytokine HMGB1 in the Synovial Fluid of Patients with Legg-Calvé-Perthes Disease and Correlation With IL-6. JBMR Plus. 2020;5(2):e10429. https://doi.org/10.1002/ jbm4.10429

Chen B, Du Z, Dong X, Li Z, Wang Q, Chen G, Zhang G, Song Y. Association of Variant Interactions in RANK, RANKL, OPG, TRAF6, and NFATC1 Genes with the Development of Osteonecrosis of the Femoral Head. DNA Cell Biol. 2019;38(7):734-746. https://doi.org/10.1089/ dna.2019.4710

Lechner J, Rudi T, von Baehr V. Osteoimmunology of tumor necrosis factor-alpha, IL-6, and RANTES/CCL5: a review of known and poorly understood inflammatory patterns in osteonecrosis. Clin Cosmet Investig Dent. 2018;10:251-262. https://doi.org/10.2147/CCIDE.S184498 Adapala NS, Yamaguchi R, Phipps M, Aruwajoye O, Kim HKW. Necrot-ic Bone Stimulates Proinflammatory Responses in Macrophages through the Activation of Toll-Like Receptor 4. Am J Pathol. 2016;186(11):2987-2999. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2016.06.024 Adapala NS, Kim HKW. Comprehensive Genome-Wide Transcriptom-ic Analysis of Immature Articular Cartilage following Ischemic Osteone-crosis of the Femoral Head in Piglets. Plos One. 2016;11(4):e0153174. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153174

References:

1. Shostak NA, Klimenko AA, Demidova NA, Andriyashkina DYU, Rat'ev AP, CHirkov AV, Avetisyan GR, Miheeva EP. Non-traumatic osteonecrosis of the femoral head: surgical and conservative treatment (part 2). Lech-ebnoe delo. 2021;2:4-16. (In Russ). https://doi.org/ 10.24412/2071-53152021-12387

Zhao H, Yeersheng R, Xia Y, Kang P, Wang W. Hypoxia Enhanced Bone Regeneration Through the HIF-1o/p-Catenin Pathway in Femoral Head Osteonecrosis. Am J Med Sci. 2021;362(1):78-91. https://doi.org/ 10.1016/j.amjms.2021.03.005

Adapala NS, Yamaguchi R, Phipps M, Aruwajoye O, Kim HKW. Necrotic

Bone Stimulates Proinflammatory Responses in Macrophages through the Activation of Toll-Like Receptor 4. Am J Pathol. 2016;186(11):2987-2999. https://doi.org/ 10.1016/j.ajpath.2016.06.024 Nurullina GM, Ahmadullina GM. Bone remodeling in norm and in primary osteoporosis: the significance of bone remodeling markers. Arkhiv" vnutrenney meditsiny. 2018;8(2):100-110. (In Russ). https://doi. org/ 10.20514/2226-6704-2018-8-2-100-110

Yamaguchi R, Kamiya N, Adapala NS, Drissi H, Kim HK. HIF-1-De-pendent IL-6 Activation in Articular Chondrocytes Initiating Synovitis in Femoral Head Ischemic Osteonecrosis. J Bone Joint Surg Am. 2016;98(13):1122-1131. https://doi.org/10.2106/JBJS.15.01209 Kamiya N, Kim HK. Elevation of Proinflammatory Cytokine HMGB1 in the Synovial Fluid of Patients With Legg-Calve-Perthes Disease and Correlation With IL-6. JBMR Plus. 2020;5(2):e10429. https://doi.org/10.1002/ jbm4.10429

Chen B, Du Z, Dong X, Li Z, Wang Q, Chen G, Zhang G, Song Y.

10.

Association of Variant Interactions in RANK, RANKL, OPG, TRAF6, and NFATC1 Genes with the Development of Osteonecrosis of the Femoral Head. DNA Cell Biol. 2019;38(7):734-746. https://doi.org/10.1089/ dna.2019.4710

Lechner J, Rudi T, von Baehr V. Osteoimmunology of tumor necrosis factor-alpha, IL-6, and RANTES/CCL5: a review of known and poorly understood inflammatory patterns in osteonecrosis. Clin Cosmet Investig Dent. 2018;10:251-262. https://doi.org/10.2147/CCIDE.S184498 Adapala NS, Yamaguchi R, Phipps M, Aruwajoye O, Kim HKW. Necrotic Bone Stimulates Proinflammatory Responses in Macrophages through the Activation of Toll-Like Receptor 4. Am J Pathol. 2016;186(11):2987-2999. https://doi.org/10.1016Zj.ajpath.2016.06.024 Adapala NS, Kim HKW. Comprehensive Genome-Wide Transcriptom-ic Analysis of Immature Articular Cartilage following Ischemic Osteone-crosis of the Femoral Head in Piglets. Plos One. 2016;11(4):e0153174. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153174

Сведения об авторах

Шабалдин Никита Андреевич, кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой детских хирургических болезней ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (650056, Россия, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а). Вклад в статью: проведение хирургических манипуляций, написание всех разделов статьи. ORCID: 0000-0001-8628-5649

Синицкая Анна Викторовна, кандидат биологических наук,

научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела

экспериментальной медицины ФГБНУ «Научно-исследовательский

институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»

(650002, Россия, г. Кемерово, б-р Сосновый, д. 6).

Вклад в статью: проведение экспериментальной части, обсчет

результатов.

ORCID: 0000-0002-4467-8732

Богданов Лев Александрович, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, б-р Сосновый, д. 6).

Вклад в статью: подготовка гистологических препаратов, анализ полученных данных. ORCID: 0000-0003-4124-2316

Лобов Арсений Андреевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории регенеративной биомедицины ФГБУН Институт цитологии Российской академии наук (194064, Россия, г. Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4). Вклад в статью: проведение протеомного анализа и биоинформатического анализа протеомных данных. ORCID: 0000-0002-0930-1171

Репкин Егор Алексеевич, специалист ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» научного парка ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет» (199034, Россия, г. Санкт-Петербург, Университетская набережная, д. 7/9). Вклад в статью: проведение протеомного анализа и биоинформатического анализа протеомных данных. ORCID: 0000-0002-8599-3173

Authors

Dr. Nikita A. Shabaldin, MD, PhD, Head of the Department of Pediatric Surgery, Kemerovo State Medical University (22a, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056, Russian Federation).

Contribution: conceived and designed the study; performed the surgery; wrote the manuscript. ORCID: 0000-0001-8628-5649

Dr. Anna V. Sinitskaya, PhD, Junior Research Fellow, Laboratory of Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine, Research Institute of Complex Problems of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation). Contribution: conducted the experiments; performed the data analysis. ORCID: 0000-0002-4467-8732

Mr. Leo A. Bogdanov, MSc, Junior Research Fellow, Laboratory of Molecular, Translational and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation). Contribution: carried out the histological analysis. ORCID: 0000-0003-4124-2316

Dr. Arseniy A. Lobov, PhD, Senior Research Fellow, Laboratory of Regenerative Biomedicine, Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russian Federation (4, Tikhoretskiy Prospekt, St. Petersburg, 194064, Russian Federation). Contribution: conducted the proteomic analysis. ORCID: 0000-0002-0930-1171

Mr. Egor A. Repkin, Technician, Resource Centre for Development of Molecular and Cell Technologies, Research Park, St. Petersburg State University (7/9, Universitetskaya Embankment, St. Petersburg, 199034, Russian Federation).

Contribution: conducted the proteomic analysis. ORCID: 0000-0002-8599-3173

Prof. Andrey V. Shabaldin, MD, DSc, Leading Research Fellow, Laboratory of Congenital Heart Disease, Department of Cardiovascular Surgery, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation). Contribution: performed the data analysis. ORCID: 0000-0002-8785-7896

Шабалдин Андрей Владимирович, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных технологий, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, б-р Сосновый, д. 6).

Вклад в статью: обсчет результатов, статистический анализ данных.

ORCID: 0000-0002-8785-7896

Статья поступила: 04.09.2022 г. Принята в печать: 30.11.2022 г. Контент доступен под лицензией СС ВУ 4.0.

Received: 04.09.2022 Accepted: 30.11.2022 Creative Commons Attribution CC BY 4.0.