CC BY
63
ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ
REWIEWS
© Коллектив авторов, 2000 УДК 616.24-006.6-07
А. Ю. Барышников, Е. В. Степанова, М. И. Давыдов
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ БИОМАРКЕРЫ РАКА ЛЕГКОГО
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, НИИ клинической онкологии
Рак легкого — одна из основных причин смерти онкологических больных в большинстве стран мира. В России число заболевших раком легкого в 1994 г. составило 69 100 человек, причем число вновь выявленных больных за 1980—1994 гг. увеличилось на 46 % [1]. Только 10—15% всех пациентов живут больше чем 5 лет после установления диагноза, несмотря на применение современных методов лечения. Эта проблема требует разработки новых методов терапии и диагностики рака легкого.
Одним из современных путей совершенствования прогнозирования течения рака легкого и, следовательно, оптимизации лечебной тактики является изучение ряда индивидуальных молекулярно-генетических характеристик опухолей, влияющих на ее рост, дифференцировку и способность к метастазированию. Эти определенные хромосомные и генные мутации, а также экспрессия различных маркеров клеточного и иного происхождения, подвергающихся качественным и/или количественным специфическим изменениям, обнаруживаемым при развитии и прогрессии неоплазий, получили название молекулярных биомаркеров [2]. Наличие/отсутствие в опухолевых клетках определенных маркеров приводит к тому, что опухоли, классифицируемые как имеющие одинаковую стадию по классификации ТИМ, различаются по агрессивности течения заболевания и чувствительности к противоопухолевой лекарственной терапии, что затрудняет выбор оптимального лечения для конкретного больного. Определение таких индивидуальных особенностей опухоли дает возможность планировать лечение онкологического больного в соответствии с ее генетическими характеристиками.
Методы определения молекулярных маркеров. Увеличение в последнее время интереса к определению различных молекулярно-генетических маркеров в опухолевой ткани потребовало разработки новых, точных и надежных методов оценки изменений, происходящих в опухолевых клетках. Основные методы определения статуса белков в ткани основаны на двух подходах: определение изменений на геномном уровне (по амплификации гена или по увеличению числа копий мРНК, по наличию мутантного гена) или на белковом уровне (по гиперэкспрессии белка, по экспрессии мутантного белка).
A. Yu.Baryshnikov, E. V.Stepanova, M.I.Davydov
BIOCHEMICAL MARKERS OF LUNG CANCER
Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, Institute of Clinical Oncology
Lung cancer is the principal cause of death of oncological patients all over the world. There were 69,100 lung cancer cases registered in Russia in 1994; the morbidity during 1980-1994 increased by 46% [1]. Only 10% to 15% of the patients survive 5 years after diagnosis in spite of up-to-date treatment. The problem of lung cancer requires new therapeutic and diagnostic approaches.
Study of molecular genetic characteristics of lung cancer that contribute to its growth, differentiation and metastatic potential is a new way to improve disease prognosis and therefore to optimize the treatment. These characteristics include certain chromosome and gene mutations, expression of a variety of markers of cellular or other origin that undergo qualitative and/or quantitative transformations detectable during tumor progression and are referred to as molecular biomarkers [2]. The presence or absence of certain markers in tumors with similar TNM stage accounts for the variability of disease course and response to chemotherapy and thus makes difficult the choice of optimal treatment in individual cases. Detection of these markers facilitates the treatment planning with respect to tumor genetic characteristics.
Molecular Markers Tests. The interest to tumor molecular genetic markers over the last years stimulated development of new accurate and reliable tests to detect tumor cell changes. The principal tests for tissue proteins are based on two approaches: detection of changes at genome level (by gene amplification or augmentation of mRNA copies, by the presence of mutant genes) or at protein level (by protein hyperexpression, by mutant protein expression).
Immunohistochemical staining is the principal method to detect protein hyperexpression or mutation. Modern immunohistochemical techniques can detect proteins both in cryosections and in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Results of the immunohistochemical protein assays on cryosections correlate well with those of gene detection tests. These tests are ideal in protein detection. The application of paraffin blocks allows the use of archive material which facilitates and accelerates the study. However, immunohistochemical tests on formalin-fixed paraffin-embedded tissues are not standardized, and there is much dispute on their results. Time of tissue fixation, method of tissue preparation,
Иммуногистохимия является господствующим методом оценки гиперэкспрессии или мутации белка. Современные иммуногистохимические методы позволяют оценивать статус белков не только на криостатных срезах, но и на фиксированных в формалине, заключенных в парафин тканях. Иммуногистохимическое определение белков на криостатных срезах, как было показано, точно коррелирует с методами, основанными на определении гена. Он является идеальным методом определения белков, если доступен исследователю. Использование парафиновых блоков позволяет применять для изучения прогностической значимости белков архивный материал, что существенно облегчает и убыстряет работу. Однако методы иммуногистохимии для тканей, фиксированных в формалине и заключенных в парафин, не являются стандартизованными и имеются значительные разногласия между результатами определения гена и белка в этих тканях. На потерю антигенных свойств белка могут влиять время фиксации ткани, метод обработки ткани, природа фиксатора, температура заключения в парафин и т. д. Кроме того, использование нестандартизи-рованных методик восстановления антигена может приводить к ложноположительным результатам.
Методами, основанными на определении геномных изменений, являются нозерн-, саузерн-блоттинги, полимеразная цепная реакция (ПЦР). Применение первых двух методов в настоящее время ограничено рядом трудностей: они довольно дороги, трудоемки и выполняются только на свежих или замороженных тканях. Кроме того, наличие в образце из первичной инвазивной карциномы ДНК или мРНК не только опухолевых, но и большого количества нормальных клеток (соединительнотканных, лимфоцитов) приводит к разбавлению амплифицированных копий гена и, следовательно, к ложноотрицательным результатам. Недавно разработанный метод гибридизации in situ лишен этих недостатков. В этом случае гибридизация с ДНК-зондом, меченным флюоресцентной или нефлюоресцентной меткой, проводится на срезах опухоли с сохраненной структурой ткани, что позволяет оценить амплификацию гена только в опухолевых клетках. Этот метод, кроме того, является быстрым, чувствительным и очень надежным и может быть легко выполнен на архивных блоках, сохраняемых долгий период, и на материале, полученном при трепанобиопсиях. Методы ПЦР также широко и успешно применяются для определения различных маркеров, например гиперэкспрессии Pgp 170.
Большой проблемой в лечении опухолей является резистентность к химиотерапевтическим агентам (75—85% опухолей легкого являются резистентными к химио- и радиотерапии). Имеется несколько путей развития устойчивости опухолевых клеток или защитных механизмов против токсических противоопухолевых препаратов. Одним из главных механизмов является гиперэкспрессия протеиновых насосов, с помощью которых клетки выбрасывают из цитоплазмы ксенобиотики.
Первым открытым клеточным насосом на плазматической мембране клеток был энергозависимый гликопротеин Pgpl70, который ведет к усилению выведения из клеток ряда цитостатиков (антрациклины, виналкалоиды,
fixator type, temperature of paraffin embedding and other factors may affect protein antigenicity. Besides, the application of non-standard methods for antigen recovery may lead to false-positive tests.
The methods based on detection of genome transformations include Northern- and Southern blottings, polymerase chain reaction (PCR). The use of the first two methods is currently limited by high cost and labor consumption, besides, they require fresh or frozen tissues. Another disadvantage of this approach is that the presence of both neoplastic and normal DNA and mRNA (connective tissue cells, lymphocytes) in the primary invasive carcinoma sample reduces concentration of amplified gene copies and leads eventually to false-negative tests. A new method of in situ hybridization is free from these disadvantages. The hybridization is performed in tumor sections with preserved tissue structure using fluorescent or non-fluorescent DNA probes and allows evaluation of gene amplification in tumor cells only. This technique is rapid, highly sensitive, reliable and may be performed on archive materials and on punch biopsy specimens. PCR is a common technique to measure a variety of markers, e.g. Pgp 170 hyperexpression.
Drug resistance is a great problem of cancer treatment since 75% to 80% of lung tumors are refractory to chemo-and radiotherapy. There are several mechanisms of tumor cell drug resistance or defense against toxic antitumor agents. Hyperexpression of protein efflux pumps which throw out xenobiotics from the cytoplasm are a principal mechanism of such defense.
Energy-dependent glycoprotein Pgp 170 was the first efflux pump found on cell membranes. It is thought to be responsible for discharge of some cytostatic (anthracyclines, vinca alkaloids, epipodophyllotoxins) from cells at least in vitro [3]. There is evidence of Pgp 170 contribution to drug resistance of hematological and some solid tumors (neuroblastoma, soft-tissue sarcoma) [3-5]. The use of this marker to evaluate drug resistance of ovarian carcinoma and small-cell lung carcinoma (SCLC) is currently under discussion [6,7]. Immunohistochemical staining and PCR discovered Pgp expression in 50-75% of smokers and only in 10-20% of non-smokers with non-small cell lung carcinoma (NSCLC) [7-9]. Pgp expression was found in 15-20% of SCLC [7]. A study of 30 NSCLC cases demonstrated Pgp significance as a drug resistance marker, though there was no statistically significant correlation between Pgp expression and resistance to cisplatin and vindesine in a similar group of NSCLC patients [7]. While in another study [9] Pgp expression was significantly related to resistance to doxorubicin in vitro.
Another multidrug resistance-associated protein (MRP) is not fully characterized yet [10]. The protein expression is related to experimental resistance to cisplatin, vinblastine, etoposide, doxorubicin and other glutathione substrates [11]. The MRP may be present both in plasmatic membrane and on intracellular organella membranes [12]. Although MRP hyperexpression is found immunohistochemically in lung carcinoma, childhood neuroblastoma, colorectal carcinoma, its role in the tumor resistance in vivo is unclear [12]. The MRP is also detected immunohistochemically in normal
эпиподофиллотоксины) по крайней мере in vitro [3]. Имеются доказательства, что он играет роль в устойчивости к этим препаратам в гематологических и некоторых солидных опухолях (нейробластомах, мягкотканных саркомах) [3—5]. Обсуждается возможность использования этого маркера в определении резистентности к химиотерапии у больных раком яичника и мелкоклеточным раком легкого (MPJI) [6,7]. При помощи иммуногистохимических методов и ПЦР было показано, что 50 — 75% опухолей курящих больных немелкоклеточным раком легкого (HMPJI) и только 10—20% некурящих экспрессируют Pgp [7 — 9]. Опухоли MPJT экспрессируют Pgp в 15 — 20% случаев [7]. На 30 больных НМРЛ было показано, что экспрессия Pgp является значимым маркером, предсказывающим резистентность к химиотерапии. На аналогичной выборке больных НМРЛ значимой корреляции с резистентностью к химиотерапии, включающей цисплатин и виндезин, выявлено не было [7]. Однако имеется значимая корреляция между экспрессией Pgp и резистентностью in vitro к доксо-рубицину [9].
Характеристика другого недавно открытого белка, ассоциированного с множественной лекарственной устойчивостью (MRP), еще далеко не полная [10]. Экспрессия этого белка связана с экспериментальной резистентностью к цисплатину, винбластину, этопозиду, доксорубицину и другим глутатионовым субстратам [11]. MRP может находиться не только на плазматической мембране, но и на мембранах внутриклеточных органелл в зависимости от типа клеток [12]. Хотя гиперэкспрессия MRP определяется иммуногистохимически в опухолях легкого, детских нейробластомах, колоректальных карциномах, неясна его роль в устойчивости этих опухолей in vivo [12]. Иммуногистохимически MRP определяется в нормальном эпителии бронхов, но в отличие от опухолевых клеток только на базолатеральной мембране. Кроме того, сильное иммуноокрашивание определяется в пневмоцитах типа 2 гипер-плазированных альвеол, но не в нормальных пневмоцитах типов 1 и 2. Уровень и частота экспресси MRP выше у больных НМРЛ (87% случаев), чем МРЛ (56%), где в большинстве случаев белок определялся лишь в небольших скоплениях клеток [13]. При НМРЛ гиперэкспрессия MRP значимо коррелирует с мутациями р53. Причем больные, имеющие гиперэкспрессию MRP и мутации р53, имели худший прогноз, чем больные без MRP и мутантного р53 [14]. Пациенты с MRP-положительными опухолями, получавшие после хирургического вмешательства химиотерапию (виндезин и этопозид), имели более плохой прогноз, чем те, у которых MRP отсутствовала. Корреляция между экспрессией MRP и прогнозом была найдена для больных в III стадии, а также с плоскоклеточными карциномами [14].
Большой интерес вызывает дальнейшее изучение клинической значимости гиперэкспрессии белка, связанного с множественной лекарственной устойчивостью рака легкого (LRP) [15]. Этот белок является членом семейства ри-бо- и нуклеобелков, которые локализуются в цитоплазматических везикулах и ядерных мембранах [12], и его функция связана с перераспределением ксенобиотиков
bronchial epithelium though (unlike tumor cells) on basolat-eral membrane only. Besides, there is a marked immunos-taining in type 2 pneumocytes of hyperplastic alveolas but not in type 1 and 2 normal pneumocytes. MRP content and rate of expression are higher in NSCLC (87%) as compared to SCLC (56%) cases in which the protein was detectable in small cell clusters [13]. MRP hyperexpression in NSCLC correlates with p53 mutations in a statistically significant manner. The cases with MRP hyperexpression and p53 mutations had a poorer prognosis than those free from MRP and p53 mutations [14]. Patients with MRP-positive tumors receiving vindeside and etoposide therapy after surgery had a poorer prognosis as compared to MRP-negative cases. MRP correlated with prognosis in stage III disease and in squamous-cell carcinoma [14].
Of much interest is further study of clinical significance of hyperexpression of the lung cancer drug resistance-related protein (LRP) [15]. This protein belongs to ribo- and nucle-oproteins located on cytoplasmic vesicles and nuclear membranes [12] and mediates redistribution of xenobiotics (in particular doxorubicin) from the nucleus to cytoplasmic vesicles [16]. Study of LRP mRNA expression by RT-PCR on 14 lung carcinoma lines demonstrated a statistically significant correlation with resistance to cisplatin. There was no relationship between LRP mRNA and tumor resistance to etoposide, doxorubicin and vincristine [17].
Hyperexpression of isoenzymes, glutathione transferases, that are responsible for glutathione conjugation with various xenobiotics and may contribute to detoxication is another potential mechanism of drug resistance [18]. Recent studies demonstrated the important role of glutathione transferase n in NSCLC resistance to a variety of drugs including platinum complexes. F.Bai et al. [19] reported of a significantly higher response (69% vs 12%, p—0.0012) to platinum-containing chemotherapy in the protein-negative patients with NSCLC.
Hyperexpression of epidermal growth factor receptor analog HER2/neu (c-erbB-2) predicts the ability of cells to grow unlimitedly. Amplification and hyperexpression of erbB-2 (located in chromosome 17q21) [20] is found in breast and ovary tumors. Though the gene amplification is not frequent in lung cancer, HER2/neu hyperexpression is encountered in about 30% of all NSCLC types especially in lung adenocarcinoma [21-23]. HER2/neu hyperexpression demonstrates a statistically significant relationship with a shortened survival of patients with lung adenocarcinoma unlike other lung cancer types [24-27]. HER2/neu transfection increased metastatic potential of NSCLC cell lines in vivo [28]. NSCLC cell lines with HER2/neu hyperexpression were more resistant to doxorubicin, etoposide and cisplatin than those without HER2/neu expression in vitro [29].
Programmed cell death (apoptosis) also plays an important role in carcinogenesis. Apoptosis mechanism may be triggered via the CD95(Fas/APO-l) receptor-ligand system. Interaction of Fas ligand with Fas receptor extracellular domain may result in its trimerization and activate apoptosis [30]. Owing to the Fas ligand expression on plasmatic membranes of numerous tumor cells they can (at least in vitro) kill immune cells with Fas-receptor expression [31 ]
(в частности, доксорубицина) из ядра в цитоплазматические везикулы [16]. Исследование роли экспрессии LRP по уровню мРНК методом RT-PCR на 14 клеточных линиях рака легкого показало значимую корреляцию с устойчивостью к цисплатину. Связи между экспрессией мРНК LRP и устойчивостью к этопозиду, доксорубицину и винкрис-тину не было найдено [17].
Альтернативным механизмом возникновения устойчивости к противоопухолевой терапии является гиперэкспрессия членов семейства изоэнзимов глутатионтрансфе-раз, которые отвечают за конъюгирование глутатиона с различными ксенобиотиками и могут играть роль в детоксикации [18]. Недавние исследования показали важную роль глутатионтрансферазы къ устойчивости НМРЛ к различным химиопрепаратам, включая соединения платины. В исследовании F. Bai и соавт. [19] у больных НМРЛ, леченных химиотерапией на основе платины, при отсутствии данного белка скорость ответа на терапию была значимо выше (69% против 12%, р=0, 0012).
Гиперэкспрессия аналога рецептора эпидермального фактора роста, белка HER2/neu (c-erbB-2), придает клеткам свойство неограниченного деления. Амплификация и гиперэкспрессия erb-B2, который картирован на хромосоме 17q21 [20], встречается в опухолях молочной железы и яичников. Хотя амплификация этого гена редко встречается в опухолях легкого, гиперэкспрессия HER2/neu встречается примерно в 30% всех типов НМРЛ, особенно в аденокарци-номахлегкого [21 — 23]. Гиперэкспрессия HER2/neu значимо коррелирует с более короткой выживаемостью больных аденокарциномой легкого в отличие от других типов рака легкого [24 — 27]. Трансфекция гена HER2/neu увеличивала метастатические свойства клеточных линий НМРЛ в моделях in vivo [28]. Также в экспериментах in vitro было показано, что клеточные линии НМРЛ с гиперэкспрессией HER2/neu более устойчивы к доксорубицину, этопозиду и цисплатину по сравнению с клеточными линиями, не экспрессирующими HER2/neu [29].
Известно, что большую роль в канцерогенезе играет также нарушение запрограммированной клеточной гибели (апоптоза), которая может запускаться через CD95 (Fas/APO-1) рецептор-лигандную систему. Взаимодействие Fas-лиганда с экстрацеллюлярным доменом Fas-рецепто-ра может приводить к его тримеризации и активировать процесс программируемой клеточной гибели [30]. Экспрессия Fas-лиганда на плазматической мембране многочисленных опухолевых клетках позволяет им, по крайней мере in vitro, убивать иммунные клетки, экспрессирующие Fas-рецептор [31]. Это наблюдение помогает понять как опухолевые клетки, используя Fas-лиганд, индуцируют специфическую иммунную толерантность. Недавние эксперименты показали также, что некоторые противоопухолевые цитотоксические препараты действуют, запуская апоптоз в клетках-мишенях [32]. Отсутствие экспрессии СВ95-рецептора в опухолевых клетках может приводить к их ускользанию от иммунологического контроля и блокированию запуска апоптоза, вызванного химиотерапией [33]. Однако некоторые противоопухолевые препараты (цисплатин, доксорубицин, камптомицин и др.) и лучевая
thus inducing specific immune tolerance. Recent experiments demonstrated that some cytotoxic agents act by triggering apoptosis in target cells [32]. The absence of CD95 receptor expression on tumor cells helps them to avoid immunological control and to block chemotherapy-induced apoptosis [33]. However, some cytotoxic drugs (cisplatin, doxorubicin, camptomycin etc.) and radiation may modulate the Fas receptor/ligand expression [31]. Little is known about the contribution of Fas receptor-ligand interactions into cytotoxicity of the mentioned drugs so far. Although, it is discovered that small doses of the cytotoxic drugs enhance the Fas expression and thus increase their elimination by the immune system. CD95 receptor expression and its relation to disease outcome are not studied well enough. There are several recent reports on relationship of the apoptosis factor expression and lymph node metastasis. High expression of proapoptotic factors such as Fas and Fas ligand correlated with low rate of node involvement in patients with squamous-cell carcinoma (/7=0.004) [34].
Products of protooncogene BCL-2 and tumor growth suppressor gene p53 are best studied apoptosis mediators. The BCL-2 protects cells from apoptosis and thus may contribute to the drug resistance through inhibition of tumor cell apoptosis. Tumor BCL-2 content measured after chemotherapy in patients with resistance to some drugs was higher as compared to cases receiving no chemotherapy [35]. BCL-2-transfected cell lines of SCLC demonstrated higher resistance to some antitumor drugs [36]. Paradoxically, BCL-2 expression is found more frequently in SCLC (70-95%) than in NSCLC (10-40%) [37-39] though SCLC responses to chemotherapy better than NSCLC. Chemoradioresistance of the carcinoids with low BCL-2 expression (which would be expected to increase their sensitivity) may be explained by slow cell proliferation. In contrast, small-cell carcinomas demonstrate fast proliferation in spite of BCL-2 hyperexpression which accounts for chemoresistance seen already at a short time after treatment start. There are equivocal reports of BCL-2 effect on survival in lung cancer [38, 40-43]. So, the BCL-2 role in lung cancer is unclear and may depend upon expression of BAX-like effectors or cysteine proteases from the caspase family [44].
BCL-2 expression in squamous-cell carcinoma is higher (25-40%) than in adenocarcinoma (about 10%) and correlates with NSCLC neuroendocrine differentiation (BCL-2-positive tumors express neuroendocrine markers) [39-42]. Immunohistochemical assay of surgically resected NSCLC discovered inverse relationship between BCL-2 expression and mutant p53 [43,45]. This discovery confirms the hypothesis that either p53 mutations or BCL-2 hyperexpression is sufficient to interfere with NSCLC cell apoptosis, and that BCL-2-positive tumors may be less aggressive than mutant p53-positive ones [43]. Interestingly, that surgically resected SCLC as a rule present with both p53 mutations and BCL-2 hyperexpression.
p53 is a protein responsible for regulation of cell cycle. The p53 activity is needed to initiate some types of apoptosis, and its mutations maybe associated with aggressive disease course and chemoradioresistance [46]. Gene p53 mutations are
терапия могут модулировать экспрессии Fas-рецептора и лиганда [31]. Роль Fas-рецептор-лигандных взаимодействий в цитотоксичности этих препаратов еще плохо изучена. Но ясно, что малые дозы этих цитотоксических препаратов увеличивают экспрессию Fas, таким образом способствуя их элиминации иммунной системой. Экспрессия С095-рецептора и его связь с прогнозом исхода заболевания плохо изучены в солидных опухолях. В последнее время появились сообщения о связи экспрессии апоптотических факторов с метастазами в лимфоузлы. Высокая экспрессия проапоптотических факторов — Fas и Fas-лигэнда коррелировала с низкой частотой метастази-рования в лимфоузлы у пациентов с плоскоклеточными карциномами (/)=0,004) [34].
Наиболее изученными ключевыми белками, также участвующими в управлении апоптозом, являются продукты протоонкогена BCL-2 и гена-супрессора опухолевого роста р53. BCL-2 защищает клетки от апоптоза и таким образом, возможно, играет роль в химиоустойчивости через ингибирование апоптоза в опухолевых клетках. Например, оказалось, что уровень BCL-2 в опухолях после химиотерапии у пациентов с устойчивостью к определенным препаратам выше по сравнению с образцами от пациентов, не получавшими до этого терапию [35]. Трансфектированные BCL-2 клеточные линии MPJI оказались более резистентными к некоторым противоопухолевым препаратам [36]. Исследования показывают, что экспрессия белка BCL-2 обнаруживается чаще при MPJ1 (70-95%), чем при НМРЛ (10—40%) [37—39]. Возникает парадокс, так как MPJ1 являются обычно более чувствительными к химиотерапии, чем НМРЛ. Действительно, карциноиды, которые известны как химиорезистентные опухоли, экспрессируют низкий уровень BCL-2, это в принципе должно способствовать их чувствительности, но клетки карциноида имеют малую скорость пролиферации, что и делает их радио- и химиорезистентными. А мелкоклеточные карциномы, несмотря на гиперэкспрессию BCL-2, активно делятся, что, вероятно, отвечает за химиочувствительность, реализующуюся уже в ранние сроки от начала лечения. Кроме того, имеются противоречивые данные о влиянии BCL-2 на выживаемость больных раком легкого [38, 40-43]. Таким образом, роль BCL-2 в опухолях легкого до сих пор неясна и, возможно, зависит от экспрессии ВАХ-подобных эффекторов или цистеино-вых протеаз семейства caspase [44].
Экспрессия BCL-2 сравнительно выше при плоскоклеточных карциномах (25-40%), чем при аденокарциномах (около 10%), и коррелирует с нейроэндокринной диффе-ренцировкой НМРЛ (BCL-2-положительные опухоли экспрессировали нейроэндокринные маркеры) [39—42]. Была найдена обратная зависимость между экспрессией BCL-2 и мутантного р53 при иммуногистохимическом анализе операционных образцов НМРЛ [43, 45]. Это подтверждает гипотезу, что либо мутации р53, либо гиперэкспрессии BCL-2 достаточно, чтобы нарушить механизм апоптоза при НМРЛ, и что BCL-2-положительные опухоли могут быть менее агрессивными, чем опухоли, положительные по мутантному р53 [43]. Интересно, что в хирургических
a common aberration encountered in all human tumors, and more than 50% of lung cancers contain mutant p53 [47]. Most of the mutations are of missense type and increase the protein life thus making it immunohistochem-ically detectable on tumor sections [48]. Most reports demonstrate that mutant p53 hyperexpression is more frequent in squamous-cell carcinoma than in adenocarcinoma. The p53 prognostic significance in lung cancer is disputed. S.Graziano [49] summarized 14 studies of prognostic significance of p53 mutations (4), mutant p53 expression (8) or both (2) in NSCLC to establish the following. The gene mutations correlated with a shorter survival only in 2 of the 4 studies. Mutant p53 expression was related to a shorter survival in 5, to a longer survival in 3 and had no relationship with survival in 2 of the 10 immunohistochemical studies.
Therapeutic effect of some antitumor agents is associated with DNA damage, the apoptosis induction being a secondary mechanism of action. The p53 mutations as a rule cause impairment of the gene normal function, i.e. cell cycle arrest in phase G1 or G2 during DNA reparation [50]. Therefore, the p53 may potentially be a genetic basis of resistance to chemotherapy. NSCLC experimental models containing no normal p53 were chemoradioresistant while cells expressing normal p53 responded to the treatment and died by apoptosis [51]. There is also some clinical evidence in support of this hypothesis. Mutant p53 expression is reported to correlate with resistance to platinum therapy in stage II-IV NSCLC. Multivariate analysis demonstrated statistical significance of p53 as a marker of NSCLC drug resistance [7,14,52,53]. There is evidence of the fact that some drugs (e.g. taxol) may induce p53-independent apoptosis [54].
Evaluation of proliferative activity may help in prognosis of aggressive course and metastatic activity of tumor disease [55] as well as (together with other factors) in prognosis of tumor response to therapy. Most of the methods involve radioactive labeling of cells in S-phase. Antibody to Ki-67 antigen that is present in Gl, S, G2 and M phases labels proliferating cells only. Relationship of percentage of Ki-67-labeled cells and the prognosis is unclear [56-58]. The Ki-67 immunostaining is much higher in hypodiploid and multi-ploid tumor segments [59] and correlates with degree of differentiation, cellularity and percentage of S-cells [60].
Growth of all solid tumors depends upon angiogenesis. Therefore it is reasonable to evaluate tumor angiogenesis as a good prognostic factor of disease course, metastatic potential and chemosensitivity. Tumor angiogenic activity is a complicated balance between angiogenic stimuli and natural angiogenesis inhibitors.
Thrombospondin is a key angiogenesis inhibitor that influences endothelial cell adhesion and growth [61]. This extracellular matrix glycoprotein is synthesized by different cells including endothelial and neoplastic ones. It plays an important part in platelet aggregation and regulation of endothelial cell adhesion and proliferation [61,62]. As demonstrated, thrombospondin synthesis is controlled by normal p53 and is often impaired in tumor cells with mutant p53 [63]. Malignant progression of some cell lines of lung and breast
образцах МРЛ обычно встречаются одновременно и мутации р53, и гиперэкспрессия ВСЬ-2.
р53 — белок, регулирующий прохождение клетки по клеточному циклу. Активность р53 требуется для активации некоторых форм апоптоза, и его мутации могут быть ассоциированы с агрессивностью течения заболевания и устойчивостью опухолевых клеток к химио- или лучевой терапии [46]. Мутации гена р53 — одни из самых распространенных нарушений, которые находят во всех типах опухолей человека. Сообщается, что более чем 50% опухолей рака легкого являются положительными по мутантному р53 [47]. Большинство из этих мутаций являются миссенс-мутация-ми и удлиняют время жизни белка на несколько часов, что делает возможным его определение иммуногистохимичес-кими методами на срезах опухолей [48]. Большинство исследований показывает, что частота гиперэкспрессии мутантного р53 выше в плоскоклеточных карциномах, чем в аденокарциномах. Роль прогностической значимости экспрессии р53, в частности при раке легкого, спорна. Б. Сгаг1апо [49] обобщил 14 исследований прогностической значимости мутаций р53 или его экспрессии при НМРЛ: в 4 исследовали мутации гена р53, в 8 — экспрессию мутантного белка, а в 2 исследованиях применяли оба метода. Из 4 исследований мутаций гена только в 2 нашли связь с более короткой выживаемостью. Практически из 10 иммуно-гистохимических исследований в 5 экспрессия мутантного р53 коррелировала с укорочением периода жизни, в 3 была связана с удлинением периода жизни, а в 2 не оказывала никакого влияния.
Терапевтический эффект некоторых противоопухолевых агентов связан с повреждением ДНК и уже вторично с индукцией апоптоза. В основном мутации белка р53 выключают функции нормального р53, который останавливает клеточный цикл в 01- или 02-фазе во время репарации ДНК [50]. Поэтому мутации р53 могут потенциально обеспечивать генетическую основу устойчивости к химиопрепаратам. Экспериментальные модели НМРЛ, не содержащие нормальный р53, являлись резистентными к химио- и радиотерапии, тогда как клетки, экспрессирующие нормальный р53, были чувствительными и погибали в результате апоптоза [51]. Кроме того, сообщается о небольшом числе клинических данных, поддерживающих эту гипотезу. Сообщают, что экспрессия мутантного р53 коррелирует с резистентностью к химиотерапии на основе соединений платины при НМРЛ II—IV стадии. При многофакторном анализе р53 был статистически значимым предсказывающим маркером химиоустойчивости при НМРЛ [7,14, 52, 53]. Имеются данные, что некоторые препараты могут индуцировать р53-независимый апоптоз, например таксол [54].
Оценка пролиферативной активности может помочь определить агрессивность и злокачественность течения опухолевого процесса [55], а также в совокупности с другими факторами, возможно, и вероятность ответа на проводимую терапию. Большинство методов, включая индекс клеток, меченных ЗН-тимидином, основано на мечении клеток, находящихся только в Б-фазе клеточного цикла. Антитела к Ю-б7-антигену, который присутствует
cancer, melanoma is related to fall in thrombospondin expression [64].
VEGF (vascular endothelium growth factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor) are important inducers of tumor angiogenesis. VEGF expression is much lower in tumors with poor vascularization free from mutant p53 [5,66]. VEGF expression in squamous-cell carcinoma was inversely related to the overall survival [67] and increased in patients with lymph node metastases of lung cancer [68]. Although bFGF expression is found in 70% of NSCLC its prognostic significance is equivocal [69,70]. Expression of both VEGF and bFGF on lung epidermoid carcinoma was associated with increased tumor neovascularization [71]. Potential synergism of VEGF and bFGF in angiogenesis induction was also demonstrated in vitro [72,73].
Degree of tumor angiogenesis is evaluated by count of microvessels stained with antibodies to endothelial cells (CD31, CD34, anti-VIII factor) in the field of vision.
Clinical significance of intratumor vessel density was demonstrated for several tumor types: the higher the density the poorer the prognosis [74-76]. All these studies treated intratumor vascularization as neoangiogenesis. This assumption is based on the fact that tumor originates from normal tissue and new vessels develop in tumor-associated stroma. Therefore the conclusion is made that the tumor needs new vessels to grow and the greater the vascularization the faster the growth. However, there is another hypothesis that the tumor can have all necessary substances from the available existing vessels and there is no need in neoangiogenesis. This hypothesis is true for tissues with originally high vascularity, such as tongue [77]. F.Pezzella et al. [78] studied 500 NSCLC specimens to demonstrate that both hypotheses were valid for lung tumors. The growth of 16% of NSCLC is provided by existing alveolar capillaries.
There is evidence in favor of correlation of NSCLC vascularity with disease progression, lymph node [79,80] and distant [81,82] metastases. NSCLC demonstrated relationship of intratumor vessel density with overall and disease-free survivals [66].
The neoangiogenesis often falls behind the growth of tumor itself which results in lack of oxygen and nutrients in the tumor and eventually limits response to chemotherapy. Analysis of intratumor vessel density in relation to response to doxorubicin in patients with NSCLC discovered doxorubicin resistance in 85% of low-vascularity and in 65% of high-vascularity tumors [83]. Besides, the hypoxia enhances expression of drug resistance-related genes (Pgp glycoprotein, hydropholate reductase) [84,85]. Thus, low intratumor vessel density may lead to increase in concentration of drug resistance-associated proteins and be predictive of chemora-dioresistance. Analysis of angiogenesis in stage IIIA (Tl-3N2M0) NSCLC versus survival discovered that the 3-year survival of patients with low tumor vascularization did not depend upon adjuvant chemotherapy while patients with high intratumor vessel density had much higher survival [83].
The biomarker identification for more accurate prognosis of disease course and reasonable choice of adequate therapy in lung cancer is a disputable problem. There is a worldwide
в клетках G1-, S-, G2- и М-фазах, метят только пролиферирующие клетки. Связь между процентом клеток, меченных Ki-67, и прогнозом неясна [56—58]. Иммуноокрашивание Ki-67 значительно выше в гиподиплоидных и мультиплоидных участках опухоли [59] и коррелирует со степенью дифференцировки, клеточностью и процентом клеток в S-фазе [60].
Рост всех солидных опухолей является ангиогенеззави-симым. Поэтому неудивительно, что оценка ангиогенеза опухоли рассматривается как один из самых успешных маркеров прогноза течения заболевания, наличия метастазов и чувствительности к противоопухолевой терапии. Ан-гиогенная активность опухоли является сложным балансом между ангиогенными стимулами и природными ингибиторами ангиогенеза. Тромбоспондин — один из главных ингибиторов ангиогенеза, влияющий на адгезию и рост эндотелиальных клеток. [61]. Это гликопротеин экстрацеллюлярного матрикса, синтезируемый различными типами клеток, в том числе эндотелиальными и некоторыми опухолевыми клетками. Он играет важную роль в агрегации тромбоцитов и регулирует адгезию и пролиферацию эндотелиальных клеток [61, 62]. Было показано, что синтез тромбоспондина контролируется нормальным белком р53, и часто в опухолевых клетках с мутантным р53 нарушается синтез этого белка [63]. Злокачественная прогрессия некоторых клеточных линий рака легкого, меланомы и рака молочной железы связана с уменьшением экспрессии тромбоспондина [64].
VEGF (сосудистый фактор роста эндотелия) и bFGF (основной фактор роста фибробластов) считаются одними из важных индукторов опухолевого ангиогенеза. Экспрессия VEGF значительно ниже в опухолях, не содержащих мутантный тип р53 и с низкой степенью васкуляризации [65, 66]. Экспрессия VEGF в плоскоклеточных карциномах обратно коррелировала с общей выживаемостью пациентов [67] и была выше в опухолях легкого с метастазами в лимфоузлы [68]. Хотя экспрессия bFGF определяется в 70% HMPJT, связь между его экспрессией и прогностической значимостью противоречива [69, 70]. На эпидермоид-ных карциномах легкого было показано, что совместная экспрессия VEGF и bFGF была связана с увеличением не-оваскуляризации опухоли [71]. Также в исследованиях in vitro была показана возможность синергизма между VEGF и bFGF в индукции ангиогенеза [72, 73].
В настоящее время ангиогенез в опухолях оценивается путем подсчета количества микрососудов, окрашенных антителами к эндотелиальным клеткам (CD31, CD34, ан-ти-VIII фактор), в поле зрения микроскопа.
Клиническая значимость определения плотности сосудов в опухоли показана для опухолей различных типов: чем выше плотность сосудов, тем хуже прогноз для пациента [74—76]. Во всех этих исследованиях васкуляризация опухоли рассматривалась как синоним неоангиогенеза. Это допущение основано на факте, что опухолевая ткань возникла на основе нормальной и что новые сосуды развиваются в опухольассоциированной строме. Таким образом, делается вывод: для того чтобы расти, опухоль нуждается в продукции новых сосудов, и чем богаче васкуляризация,
study of molecular biomarkers related to tumor recurrence and metastatic potential as well as of mechanisms of drug resistance in patients with lung cancer. Several other factors (RB, ras, p21, L-myc mutations etc.) not considered in this paper are also studied for prognostic significance in lung cancer. The application of new tests is hoped to increase considerably outcomes of treatment for lung cancer owing to: timely detection and reliable prognosis of local recurrence and metastasis, reliable monitoring of true remission, adequate therapy and choice of optimal dosage and schedule.
тем быстрее рост. Но существует и другая гипотеза, что опухоль может получать все необходимые вещества из доступных, уже существующих сосудов, не нуждаясь в продукции новых сосудов. Эта гипотеза находит подтверждение только для уже изначально высоковаскуля-ризованных органов, например языка [77]. Р. РеггеИа и соавт. [78] показали на 500 образцах НМРЛ, что для опухолей легкого справедливы две эти гипотезы. В 16% случаев рост опухолей НМРЛ происходит за счет использования уже существующих капилляров альвеолярных септ.
Исследования НМРЛ показывают, что количество сосудов в опухоли коррелирует с прогрессией, наличием метастазов в лимфоузлы [79, 80] и отдаленными метастазами [81, 82]. По крайней мере для НМРЛ была обнаружена связь количества сосудов в опухоли с общей и безрецидивной выживаемостью [66].
Часто формирование новых микрососудов в опухоли отстает от роста самой опухоли, таким образом создавая в опухоли условия с очень низким содержанием кислорода и питательных веществ, что может лимитировать эффективность химиотерапии. Так, при анализе зависимости плотности сосудов и чувствительности кдоксо-рубицину НМРЛ оказалось, что 85% опухолей с низкой васкуляризацией и 65% с высокой васкуляризацией были резистентны к доксорубицину [83]. Кроме того, гипоксия увеличивает экспрессию генов, связанных с лекарственной устойчивостью (Pgp-гликoпpoтeинa, гидрофолатредуктазы) [84, 85]. Таким образом, невысокая степень васкуляризации может повышать уровень белков, ассоциированных с устойчивостью, и представлять собой важный фактор неэффективности химиотерапии и радиации в достижении полной ремиссии. При изучении ангиогенеза НМРЛ ША (Т1 - ЗШМО) стадии оказалось, что 3-летняя выживаемость у пациентов с низкой васкуляризацией опухоли не зависела от проведения адьювантной химиотерапии, а с высокой степенью васкуляризации была значительно выше [83].
До сих пор идентификация биомаркеров для более точного прогноза течения заболевания в помощь клиницистам в определении адекватной терапии является еще открытой проблемой для больных раком легкого. Изучение комплекса молекулярных биомаркеров факторов прогноза, отражающих риск развития рецидива и метастазирования, а также механизмов лекарственной резистентности у больных раком легкого активно
ведется в различных странах мира. В качестве маркеров, возможно, имеющих прогностическое значение, рассматриваются и другие (RB, мутации ras, р21, L-myc и др.), не вошедшие в этот обзор. Использование разрабатываемых тестов даст реальную возможность принципиально улучшить результаты лечения больных раком легкого за счет своевременного выявления и прогнозирования возникновения рецидивов и метастазов; осуществления надежного мониторинга за состоянием истинной ремиссии; планирования адекватной терапии; выбора оптимальных схем и комбинаций методов лечения.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Двойрин В. В., Аксель Е. М., Трапезников H. Н. Статистика
злокачественных новообразований в России и некоторых других странах СНГ в J 994 году. — М., 1995. — С. 198.
2. Коган Е. А., Жак Г., Кайзер У. и др. // Арх. пат. — 1997. — № б.
- С. 23-30.
3. Nooter K., Stoter G. // Pathol. Res. Pract. — 1996. — Vol. 192. —
P. 768-780.
4. Chan H. S. L., Haddad G., Thomer P. S. et al. // N. Engl. J. Med.
-1991.-Vol. 325.-P. 1608-1614.
5. Lamy Т., Drenou B., Fardel О. et al. // Br. J. Hematol. — 1998. —
Vol. 100.— P. 509—515.
6. Holzmayer T. A., Hilsenbeck S., von Hoff D. D., Roninson I. B. //
J. natl. Cancer Inst. — 1992. — Vol. 84.— P. 1486—1491.
7. Kawasaki M., Nakanishi Y., Kuwano K. et al. // Eur. J. Cancer. —
1998.-N 9.-P. 1352-1357.
8. Galimberti S., Marchetti A., Buttitta F. et al. // Anticancer Res. —
1998. - Vol. 18, N 4C. - P. 2973-2976.
9. Volm M., Mattern J., Samsel B. // Br. J. Cancer. — 1991. — Vol.
64. - P. 700—704.
10. Grant C., Valdimarsson G., Hipfner D. et al. // Cancer Res. —
1994. - Vol. 54. - P. 357-361.
11. Giaccone G., van Arc-Otte J., Rubio G. J. et al. // Int. J. Cancer.
- 1996. - Vol. 66. - P. 760-767.
12. Aszalos A., Ross D. //Anticancer Res. — 1998. — Vol. 18. — P. 2937-2944.
13. Wright S. R., Boag A., Valdimarsson G. et al. // Clin. Cancer Res.
- 1998. — N 9. — P.2279—2289.
14. Oshika Y., Nakamura M., Tokunaga T. et al. // Mod. Pathol. — 1998.-N 11.-P. 1059-1063.
15. Scheper R., Broxterman H., Scheffer G. et al. // Cancer Res. —
1993. - Vol. 53. - P. 1475-1479.
16. Schuurhuis G., Boxterman H., de Lange J. et al. // Br. J.Cancer.
- 1991. - Vol. 64. - P. 857-861.
17. Ikeda K., Oka M., Narasaki F. et al. // Anticancer Res. — 1998. — N 4C. — P. 3077—3080.
18. Jakoby W. B. //Adv. Enzimol. Relat. Areas Mol. Biol. — 1978. — Vol. 46. - P. 383-414.
19. Bai F., Nakanishi Y., Kawasaki M. et al. // Cancer. — 1996. —
Vol. 78.-P. 416-421.
20. Fukushige S., Matsubara K., Yoshida M.-C. et al. // Mol. Cell.
Biol. - 1986. - N 6. - P. 955-958.
21. Rachwal W. J., Bongiorno P. F., Orringer M. B. et al. // Br. J. Cancer. - 1995. - Vol. 72. - P. 56-64.
22. Schneider P. M., Hung M.-C., Chiocca S. M. et al. // Cancer Res.
- 1989. - Vol. 49. - P. 4968-4971.
23. Shi D., He G., Cao S. et al. // Mol. Carcinogen. - 1992. - N 5. -P. 213-218.
24. Weiner D. B., Nordberg J., Robinson R. et al. // Cancer Res. —
1990. - Vol. 50. - P. 412-425.
25. Tateishi M., Ishida Т., Mitsudomi T. et al. // Eur. J. Cancer. —
1991. - Vol. 27. - P. 1372-1375.
26. Kern J. A., Slebos R. J. C., Top B. et al. // J. clin. Invest. —
1994. - Vol. 33. - P. 516-520.
27. Pfeiffer P., Clausen P. P., Andersen K.,Rose C. L// Br. J. Cancer.—1996. - Vol. 74. - P. 86-91.
28. Yu D., Wang S.-S., Dulski K. M. et al. // Cancer Res. — 1994.
- Vol. 54. - P. 3260-3266.
29. Tsai C.-M., Chang K.-T., Wu L.-H. et al. // Ibid. - 1996. -Vol. 56. - P. 206-209.
30. Takahashi T. et al. //J. biol. Chem. — 1996. — Vol. 271, N 29. -P. 17555-17560.
31. Solary E., Micheau O., Dimanche-Boitrel M. T. // Bull. Cancer. — 1998. — Vol. 85, N 8. — P. 685—694.
32. Dive C., Hickman J. A. // Br. J. Cancer. — 1991. — Vol. 64. — P. 192-196.
33. Micheau O., Solary E., Hammann A. et al. // J. natl. Cancer Inst. - 1997. - Vol. 89, N 11. - P. 783-789.
34. Volm M., Koomagi R. // Oncol. Rep. — 1999. — N 2. — P. 373-376.
35. Brambilla E., Nagoescu A., Gazzeri S. et al. // Am. J. Pathol.
- 1996. - Vol. 149. - P. 1941-1952.
36. Ohmori T., Podack E. R., Nishio K. et al. // Biochem. bio-phys. Res. Commun. — 1993. — Vol. 192. — P. 3036.
37. Jiang S. X., Sato Y., Kuwao S., ICameya T. // J. Pathol. —
1995. — Vol. 177. - P. 135—138.
38. Kaiser U., Schilli M., Haag U. et al. // Lung Cancer. — 1996. -Vol. 15.-P. 31-40.
39. Jiang S. X., KameyaT., Sato Y. et al. //Am. J. Pathol. — 1996. -Vol. 148.-P. 837-846.
40. Pezzella F., Turley H., Kuzu I. et al. // New Engl. J. Med. —
1993. - Vol. 329. - P. 690-694.
41. Higashiyama M., Doi O., ICodama K. et al. // J. Surg. Oncol.
- 1997. - Vol. 64. - P. 48-54.
42. Apolinario R. M., van der Valk P., de Jong J. S. et al. // J. clin. Oncol. - 1997. - Vol. 15. - P. 2456-2466.
43. Fontanini G., Vignati S., Vigini D. et al. // Br. J. Cancer. —
1995. - Vol. 71. - P. 1003-1007.
44. Cheng E. H.-Y., Kirsch D. G., Clem R. J. et al. // Science. — 1997. - Vol. 278. - P. 1966-1968.
45. Kitagawa Y., Wong F., Lo P. et al. // Am. J. Respir. Cell.
Mol. Biol. - 1996. - Vol. 15. - P. 45-54.
46. Levine A. J. // Cell. - 1997. — Vol. 88. — P. 323—331.
47. Greenblatt M. S., Bennett W. P. Hollstein M. K., Harris C. C. // Cancer Res. - 1994. — Vol. 54. - P. 4855—4878.
48. CaseyG., Lopez M. E., Ramos J. S. et al. // Oncogene. —
1996.-Vol. 13.-P. 1971-1981.
49. Graziano S. // Lung Cancer. — 1997. — Vol. 17. — P. 37—58.
50. Keurbitz S. J., Plunkett B. S., Walsh W. V., Kastan M. B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. — Vol. 89. — P. 7492—7496.
51. Perdomo J. A., Naomoto Y., Haisa M. et al. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. - 1998. - Vol. 124. - P. 10-18.
52. Kawasaki M., Nakanishi Y., Yatsunami J. et al. // Cancer J.
Sci. Am. - 1996. — N 4. — P. 217.
53. Higashiyama M., Kodama K., Yokouchi H. et al. // J. surg. Oncol. - 1998. - Vol. 68. - P. 19-24.
54. Lanny J., Lowe S., Licitra E. et al. // Proc. natl. Acad. Sci.
USA. - 1997. - Vol. 94 - P. 9679-9683.
55. Costa A., Silvestrini R., Mochen C. et al. // Br. J. Cancer. —
1996. - Vol. 73. - P. 914-919.
56. Tugekar M. F., Gatter R. E., Dunnill M. S., Mason D. Y. // Histopathology. — 1991. — Vol. 19. — P. 545—550.
57. Kubota Y., Petres R. E., Easley K. A. et al. // Cancer. — 1992.
- Vol. 70. - P. 2602-2609.
58. Schwarting R. // Lab. Invest. — 1993. — Vol. 68. — P. 597—599.
59. Simony J., Pujol J. L., Radal M. et al. // Cancer Res. — 1996.
- Vol. 50. — P. 4382-4387.
60. Kawai T., Suzuci M., Kono S. et al. // Cancer. — 1994. — Vol.
74. - P. 2468-2475.
61. Tolsma S., Volpert O., Good D. et al. //J. Cell Biol. — 1993. — Vol. 122.-P. 497-511.
62. FraizierW., Prater C., Jaye D., Kosfeld M. //Thrombospondin. — Boca Raton, 1993. - P. 91-109.
63. Dameron K., Voipert O., Tainski M., Bouck N. // Science. —
1994. - Vol. 126. - P. 1582-1584.
64. Zabrenetzky V., Harris C., Steeg P., Roberts D. // Int. J. Cancer. _ 1994.— Vol. 59. —P. 191—195.
65. Mattern J., Koomagi R., Volm M. // Br. J. Cancer. — 1996. —
Vol. 73.-P. 931-934.
66. Fontanini G., Vignati S., Lucchi M. et al. // Ibid. — 1997. — Vol.
75.-P. 1295-1301.
67. Volm M., Koomagi R., Mattern J. // Int. J. Cancer. — 1997. — Vol. 74. - P. 64—68.
68. Ohta Y., Watanabe Y., Murakami S. et al. // Br. J. Cancer. —
1997. — Vol. 76. — P. 1041—1045.
69.Takanami I., ImamuraT., HashizumeT.// Jap. J. clin. Oncol.—
1997.— Vol. 26. — P. 293—297.
70. Volm M., Koomagi R., Mattern J., Stammler G. // Eur. J. Cancer.
- 1997. - Vol. 33. - P. 691-693.
71. Mattern J., Koomagi R.., Volm M. // Anticancer. — 1997. — Vol.
17.-P. 2249-2252.
72. Goto F., Goto K., Weindel K., Folkman J. // Lab. Invest. —1993. -Vol. 69.-P. 508-517.
73. Pepper M. S., Ferrara N., Orci L., Montesano R. // Biochem. biophys. Res. Commun. — 1992. — Vol. 189. — P. 824—831.
74. Weidner N. // Semin. Diagn. Pathol. — 1993.— N 10. — P. 302—313.
75. Weidner N.//Am. J. Pathol. - 1995. -Vol. 147. - P. 9-19.
76. Craft P. S., Harris A. L. // Ann. Oncol. — 1994.— N 5. — P. 305-311.
77. Leedy D. A., Trune D. R., Kronz J. D. et al. // Otolaringol. Head Neck Surg. - 1994. - Vol. 111. - P. 417-422.
78. Pezella F., Pastorino U., Tagliabue E. et al. // Am. J. Pathol.
- 1997. - Vol. 151. - P. 1417-1423.
79. Giatromanolaki A., Kuokuorakis M., O’Byrne K. et al. // J. Pathol. - 1995. - Vol. 179. - P. 80-88.
80. Macchiarini P., Fontanini G., Hardin M. J. et al. // Lancer. —
1992. - Vol. 340. - P. 145-146.
81. Fontanini G., Bigini D., Vignati S. et al. // J. Pathol. — 1995 — Vol. 177. - P.57—63.
82. Yamaziki K., Abe S., Takekawa H. et al. // Cancer. — 1994. — Vol. 74. - P. 2245-2250.
83. Anseletti C. A., Lucchi M., Fontanini G. et al. // Ibid. — 1996. -Vol. 78.-P. 409-415.
84. Kalra R., Jones A. M., Kirk J. et al. // Int. J. Cancer. — 1993. -Vol. 58.-P. 650-655.
85. Rice G. C., Ling V., Schimke R. T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1987. - Vol. 84. - P. 9261-9264.
nocTymtJia 25.06.99 / Submitted 25.06.99
