CC BY
9© Коллектив авторов, 2013 УДК 615.273.53.012: 577.2
молекулярное моделирование, синтез и оценка биологической активности новых антагонистов gpiib/iiia-рецепторов тромбоцитов
А.А. Алексеев1, М.И. Брылев1, В.Л. Королев1, доктор химических наук, Д.С. Лоторев1, кандидат химических наук, А.Ю. Лизунов2, Е.А. Батуев3, Л.А. Павлова1, кандидат фармацевтических наук, доцент
'Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ, 2Московский физико-технический институт (государственный университет), 3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Е-mail: [email protected]
C применением программы «Алгокомб» выполнено моделирование молекул пептидов — антагонистов GPIIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов. Серия смоделированных соединений синтезирована по стратегии FastMoc 0.25. Структура полученных соединений подтверждена методами хромато-масс-, ЯМР 'Н- и двумерной ЯМР 'Н/'Н (COSY, NOESYJ-спектроскопии. Оценка специфичности действия синтезированных соединений выполнена in vitro на крови здоровых доноров и показано дозозависимое снижение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.
Ключевые слова: молекулярное моделирование, GPIIb/IIIa-рецепторы тромбоцитов, пептиды, синтез, агрегация тромбоцитов, ингибирование
MOLECULAR MODELING, SYNTHESIS AND EVALUATION OF THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF NEW GLYCOPROTEIN IIB/IIIA (GPIIB/IIIA) RECEPTOR ANTAGONISTS А.А. Alekseev1, M.I. Brylev1, V.L. Korolev1, D.S. Lotorev1, A.Yu. Lizunov2, Е.А. Batuev3, L.A. Pavlova1
'Sechenov First Moscow State Medical University, 2Moscow Institute of Physics and Technology (State University), 3Lomonosov Moscow State University
We applied software «Algokomb» to perform mathematical modeling of polypeptide molecules of glycoprotein IIb/IIIa (gpIIb/IIIa) receptor antagonists. The modeled compounds have been synthesized accordingly to the protocol of strategy FastMoc 0.25. The structure of the compounds has been confirmed by LCMS, 'H NMR and 'Н/'Н (COSY, NOESY) NMR methods. The evaluation of the specificity of the synthesized compounds has been made in vitro and has shown dose-dependent reduction of ADP-inducedplatelet aggregation.
Key words: molecular modeling, platelet GPIIb/IIIa receptors, peptides, synthesis, platelet aggregation, inhibition
ВВЕДЕНИЕ
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти населения в России. Наиболее часто в основе указанных заболеваний лежит атеротромбоз — процесс патологического тромбообра-зования, ведущий к инфаркту миокарда и инсульту.
В образовании тромба значимую роль играют гли-копротеиновые рецепторы тромбоцитов. Именно связывание фибриногена с активированными GPПb/Шa-рецепторами тромбоцитов является конечным звеном в агрегации последних. Рецепторный комплекс глико-протеин ПЬ/Ша (интегрин аш/Р3) относится к семейству интегриновых рецепторов и является наиболее многочисленным среди всех рецепторов тромбоцитов [3].
Гетеродимер ПЬ/Ша представляет собой комплекс 2 субъединиц. Субъединица GPПb состоит из ковалентно связанных дисульфидной связью тяжелой (116 кД) и легкой (22 кД) цепей. Тяжелая цепь находится на поверхности тромбоцита, в то время как легкая является трансмембранным белком. Субъединица GPШa представляет собой гликированный полипептид с массой 92 кД, который состоит из 3 доменов —
внеклеточного на N-конце, трансмембранного и цито-плазматического доменов на С-конце [7].
Ингибиторы IIb/Ша-рецепторов тромбоцитов являются наиболее мощными антитромбоцитарными препаратами, используемыми в кардиологии, так как механизм их действия заключается в блокировании конечного этапа агрегации тромбоцитов — процесса образования мостиков из молекул фибриногена между соседними активированными тромбоцитами [5, 10].
Существенный интерес среди антиагрегантов представляют антагонисты GPIIb/Ша-рецепторов, имеющие пептидную природу [1, 2].
В настоящее время начальным этапом поиска фармакологически активных веществ, как правило, является использование доэкспериментальных методов in silico, предваряющих экспериментальные исследования in vitro и in vivo.
В этой связи целью 1-го этапа в нашей работе стало проведение виртуального скрининга пептидов, потенциально обладающих антитромботическими свойствами. Как следствие, задачами следующих этапов исследования были: синтез ряда потенциальных инги-
биторов агрегации тромбоцитов из числа смоделированных пептидов и оценка специфичности действия синтезированных соединений in vitro на крови здоровых доноров.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Моделирование взаимодействия белка интегрин aIIb/P3 с пептидными лигандами проводили с помощью программы «Алгокомб» [3, 8], модифицированной для учета внутренних нековалентных взаимодействий ли-ганда и явного учета молекул воды в сайте связывания. В отличие от других широко известных программ до-кинга [6] (например, «GOLD», «AutoDock», «FlexX», «Surflex», «LigandFit», «Glide»), программа «Алгокомб» при оценке позиции лиганда учитывает локальное пространственное сходство активного сайта белка-мишени и белковых комплексов, представленных в базе данных PDB. Благодаря этому удается добиться высокой эффективности в решении задач докинга и виртуального скрининга. Приведены подробное описание алгоритма работы программы «Алгокомб» и результаты тестирования этой программы [8].
Серия наиболее эффективных, согласно прогнозу, соединений была нами синтезирована на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 433А с использованием стратегии FastMoc 0.25.
Очистку пептидов осуществляли с помощью высокоэффективного препаративного жидкостного хроматографа PuriFlash 450 (InterChim). Строение синтезированных соединений подтверждено методами хромато-масс-, ЯМР 'Н- (в том числе с привлечением 2-мерных методик 'Н/'Н-спектров COSY, показывающих ближнее взаимодействие атомов, и 'Н/'Н-спектров NOESY, основанных на дальних взаимодействиях). Спектры ЯМР 'Н регистрировали на приборе «Broker Avance 600 mhz», химические сдвиги измеряли относительно сигнала растворителя (ДМСО^б, SH 2.5 м.д.). Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на приборе Waters MSD SQD — ESI с УФ-и масс-спектрометрическими детекторами: длина волны 220 нм, температура пробоотборника 15°С, температура термостата колонок 40°С. MSD-параметры: температура источника '30°С, температура газа 400°С, напряжение на капилляре 3kV; колонка Waters Acquity ',7 мкм 2.' • 50 мм. Градиент от 5 до '00% В за 4 мин (А: 0,'% муравьиной кислоты в воде; Б: 0,'% муравьиной кислоты в ацетонитриле).
Оценку специфической активности антиагрега-ционного действия пептидов проводили in vitro с использованием крови здоровых доноров. Кровь брали непосредственно перед исследованием, используя в качестве антикоагулянта водный раствор цитрата натрия (3,8%). Соотношение антикоагулянт/кровь соответствует ':9. Антиагрегационная активность полученных соединений изучалась на богатой тромбоцитами плазме с использованием АДФ в качестве индуктора агрегации тромбоцитов. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в те-
чение 10 мин при 1000 об/мин, после чего отбирали верхний слой плазмы, а остаток центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин для получения бес-тромбоцитарной плазмы. Все процедуры проводили в полистирольной посуде, обладающей тромборези-стентными свойствами. В течение всего периода исследования богатая и бестромбоцитарная плазма находилась при комнатной температуре, а запись агрегации тромбоцитов осуществляли при 37°С [11].
Исследование агрегации проводили по методу Борна [4]. Применяли 2-канальный лазерный анализатор агрегации тромбоцитов/счетчик 230LA-2 (НПФ «Биола»). Объем пробы составлял 300 мкл. Время проведения измерения — 8 мин. В качестве индуктора использовали АДФ в концентрации 50 мкМ. Получаемые агрегатограммы представляют собой зависимость степени агрегации от времени, прошедшего после добавления индуктора агрегации. Изучаемые соединения (в виде водного раствора, при необходимости содержащего ДМСО до 0,2%) добавляли в пробу до внесения индуктора агрегации (АДФ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Связывание с белком оценивали для пептидов вида А-В-С-Аяр-Б, где А, В, С, Б — L-аминокислотные остатки, структура которых варьировалась в процессе моделирования; в качестве аминокислоты С рассматривались глицин или аланин. Наличие остатка аспа-рагиновой кислоты в 4-й позиции положительно влияет на связывание с белком, так как этот остаток может образовывать ионную связь с ионом магния в активном сайте белка интегрин апь/Р3. Таким образом, было рассмотрено около 20000 пептидов.
В базе данных РБВ [9] представлено 17 комплексов белка интегрин а1Пь/Р3. Для докинга и расчета оценки связывания были выбраны структуры с идентификаторами 2уёр и 2уо2. 2уёр — комплекс белка-мишени с октапептидом. Преимуществом данного комплекса для докинга пентапептидов является то, что в комплексе с белком уже представлен пептид, т.е. теоретически кон-формация активного сайта белка лучше соответствует связыванию с веществами пептидной природы. При докинге учитывали наличие 2 молекул воды в активном сайте белка. Одна молекула воды образует водородную связь с С-концевым остатком нативного лиганда, другая — с кислородом 3-го С-конца остатка основной цепи нативного лиганда. 2уо2 — комплекс с лигандом непептидной природы. Преимуществом данного комплекса при докинге пептидов является то, что размер лиганда в комплексе близок к размерам пентапептидов (масса лиганда 522 дальтона). Поэтому можно было ожидать, что конформация активного сайта белка лучше подходит для взаимодействия с лигандами такого размера.
В обоих комплексах лиганды в активном сайте образуют ионную связь с ионом магния. Для учета наличия ионной связи перебор конформаций лиганда при докинге начинался с правильно позиционированного фрагмента кислоты.
62
№5, 2013 Молекулярная медицина
Для всех рассматриваемых пептидов был проведен докинг и рассчитана оценка связывания с конформаци-ями белка aIIb/P3, представленными в комплексах 2vdp и 2vc2. Для каждой конформации белка были выбраны вещества с наилучшими оценками связывания. Оценки связывания при докинге в комплекс 2vdp изменяются от 16,52 (лучшее вещество) до 13,89. При докинге в комплекс 2vc2 оценка связывания изменяется от 10,78 до 8,04. С учетом результатов рассчитанных оценок связывания можно заключить, что пептиды существенно лучше располагаются в сайте комплекса 2vdp.
Оценка специфической активности пептидов: His-Ile-Gly-Asp-Asp; Arg-Phe-Ala-Asp-Asp; Arg-Met-Ala-Asp-Asp; Arg-Phe-Gly-Asp-Asp; Met-His-Ala-Asp-Asp — показала способность полученных соединений уменьшать агрегацию тромбоцитов. Результаты исследований на крови здоровых доноров представлены в таблице 1. Полученные результаты свидетельствуют о наличии дозозависимого ингибирования АДФ — индуцированной агрегации тромбоцитов. Наиболее эффективным оказалось соединение с аминокислотной последовательностью His-Ile-Gly-Asp-Asp (HIGDD).
Полумаксимальное ингибирование (IC50) достигалось при концентрации His-Ile-Gly-Asp-Asp, равной 15,4 мкМ (табл. 1, 2, см. рисунок).
ВЫВОДЫ
1. С применением программного комплекса «Алгокомб» проведено молекулярное моделирование пептидов — потенциальных антагонистов GPIIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов.
2. Синтез серии наиболее эффективных смоделированных соединений выполнен твердофазным способом на автоматическом пептидном синтезаторе по стандартному протоколу стратегии FastMoc 0.25. Строение синтезированных соединений подтверждено методами хромато-масс-спектрометрии, ЯМР 1Н-спектроскопии с привлечением 2-мерных методик 1Н/1Н-спектров COSY и NOESY.
3. Выполнена оценка специфичности действия синтезированных соединений in vitro на крови здоровых доноров и показано дозозависимое снижение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.
Таблица 1
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИАГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Пептид IC50, мкМ
His-Ile-Gly-Asp-Asp 15,4
Arg-Phe-Ala-Asp-Asp 28,4
Arg-Met-Ala-Asp-Asp 34,5
Arg-Phe-Gly-Asp-Asp 60,8
Met-His-Ala-Asp-Asp 58,4
Таблица 2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИАГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ СОЕДИНЕНИЯ HIGDD
Концентрация HIGDD, М % агрегации в присутствии HIGDD
0 60,0
0,05«10-4 50,1
0,1*10-4 42,3
0,2*10-4 22,7
0,25«10-4 17,2
с«
| 30,0 ¡^ 20,0 10,0
0,05 0,1 0,15 0,2 Концентрация HIGDD, М'
Зависимость агрегации тромбоцитов от концентрации HIGDD
ЛИТЕРАТУРА
1. Белушкина Н.Н., Дегтярева О.Г., Махлай А.А. и др. Синтез пептидов RGD-класса, обладающих антиагрегационной активностью // Молекулярная медицина. - 2011; 1: 40-3.
2. Белушкина Н.Н., Дегтярева О.Г., Махлай А.А. и др. Рецепторы тромбоцитов - мишень для антиагрегационной терапии // Молекулярная медицина. - 2011; 3: 10-6.
3. Хельтье Х.-Д., Зиппель В., Роньян Д. и др. Молекулярное моделирование: теория и практика. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 318.
4. Born G. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal //
Nature. - 1962; 194: 927-9. Bussel J., Kunicki T., Michelson A. Platelets: new understanding of platelet glycoproteins and their role in disease. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program). -2000: 222-40.
Muryshev A., Tarasov D., Butygin A. et al. A novel scoring function for molecular docking // J. Of Comp. Aided Mol. Design. - 2003; 17: 597-605.
Newman P., Poncz M. Inherited disorders of platelets. N.Y. - 1995; 3: 3335-67. Ramensky V., Sobol A., Zaitseva N. et al. A novel approach to local similarity of protein binding sites substantially improves computational drug design results // Proteins.
- 2007; 69 (2): 349-57.
9. RCSB Protein Data Bank (PDB). Электронная база данных расшифрованных трехмерных структур белковых комплексов PDB. [Электронный ресурс] // [сайт the Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)]. [2003-2013]. URL: http://www.rcsb.org/pdb/ (дата обращения: 15.07.2012)
10. Ruoslahti E., Pierschbacher M. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins // Science. - 1987; 238: 491-515.
11. Zhou L., Schmaier A. Platelet Aggregation Testing in Platelet-Rich Plasma // Am. J. Clin. Pathol. - 2005; 172-83.
