CC BY
86
Экспериментальная биология и медицина УДК 615.357.631
ПОИСК АНТАГОНИСТОВ РЕЦЕПТОРОВ NR3C4 МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОГО
МОДЕЛИРОВАНИЯ
© Брылев М.И., Раменская Г.В., Лоторев Д.С., Мухачева Е.С., Кузнецова Н.Б.,
Павлова Л.А., Лизунов А.Ю.1, Пелевин Н.А.2
Лаборатория биологически активных соединений научно-исследовательского института фармации Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, Москва;
1 кафедра высшей математики Московского физико-технического института (государственный университет), Долгопрудный;
2 кафедра химии Курского государственного университета, Курск E-mail: thebryleff@ gmail. com
Рецепторы NR3C4 (nuclear receptor subfamily 3, group C, member 4) играют важную роль в возникновении и развитии различных физиологических нарушений. Проведен поиск потенциальных антагонистов рецепторов NR3C4 методом молекулярного моделирования. При построении молекулярной модели белок-лигандного связывания учитывалось наличие молекулы воды в активном сайте рецептора. Молекулярное моделирование проведено для 30000 соединений, относящихся к трем классам: амиды и сложные эфиры аминокислот, короткие пептиды. Синтезировано и исследовано 31 соединение, имеющее лучшие расчетные характеристики. Методами молекулярной биологии подтверждена антагонистическая активность у 3 образцов (2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3-фторфенил)ацетил]-Ь-пролина, 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]-Ь-пролина, 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил] -L-пролина).
Ключевые слова: молекулярный докинг, программный комплекс «Algocomb», рецепторы NR3C4, антагонисты рецепторов NR3C4.
SEARCH FOR ANTAGONISTS OF NR3C4 RECEPTORS BY MEANS OF MOLECULAR MODELING Brylev M.I., Ramenskaya G. V., Lotorev D.S., Mukhacheva E.S., Kuznetsova N.B.,
Pavlova L.A., Lizunov A. U.1, Pelevin N.A.2
Pharmacy Research Institute of I. M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow;
1 Department of Mathematics of Moscow Institute of Physics and Technology (State University), Dolgoprudny;
2 Department of Chemistry of Kursk State University, Kursk NR3C4 receptors (nuclear receptor subfamily 3, group C, member 4) play an important role in the emergence and development of various diseases. By means of molecular modeling the search for compounds being capable of potential blocking the NR3C4 receptors was conducted. The availability of a water molecule was taken into account when constructing the molecular model of protein-ligand binding. The molecular modeling for the 30000 compounds referring to amides, amino acid esters, and short peptides was performed. The 31 compounds with the most perspective characteristics in terms of presumptive assessments were synthesized. By using the molecular biology methods the antagonistic activity of 3 samples (2-(1-naphthyl) ethyl ester 1-[(3-fluorophenyl)acethyl]-L-proline, 2-(1-naphthyl) ethyl ester 1-[(4-chlorophenyl)acethyl]-L-proline, 2-(1-naphthyl) ethyl ester 1-[(4-methylphenyl)acethyl]-L-proline) was confirmed.
Keywords: molecular docking, software «Algocomb», NR3C4 receptors, antagonist of NR3C4 receptors.
Рецепторы NR3C4 (nuclear receptor subfamily 3, group C, member 4) модулируют клеточные процессы и действуют как транскрипционные факторы в контроле роста клеток, дифференциации, пролиферации и апоптоза в клетках-мишенях для половых гормонов у мужчин и женщин [1].
В настоящее время рецепторы NR3C4 интенсивно изучаются с целью поиска новых антагонистов, применяемых при гормональной терапии рака предстательной железы [6, 9]. Данные соединения блокируют связывание мужских половых гормонов с рецепторами NR3C4, препятствуя проявлению биологических эффектов данных гормонов в клетках предстательной железы, останавливая таким образом рост опухоли.
Цель данной работы состояла в поиске антагонистов рецепторов NR3C4 с применением методов молекулярного моделирования, их синтезе и выявлении антагонистической активности in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Метод молекулярного моделирования, целью которого является поиск наиболее выгодной для образования устойчивого комплекса ориентации и конформации одной молекулы по отношению к другой, называется молекулярным докингом. До-кинг позволяет дать оценку качеству связывания
лиганда с активным сайтом белка рецептора NR3C4.
Для молекулярного моделирования связывания веществ с рецепторами NR3C4 и оценки энергии белок-лигандного связывания использовали программный комплекс «Algocomb».
В процессе молекулярного моделировании использовалась стандартная методика докинга, подразумевающая удаление лигандов и всех закристаллизованных вспомогательных молекул (вода, растворители и т.п.) из белок-лигандного комплекса [3]. На оставшейся структуре белка задавался активный сайт связывания, в который производился докинг искомых лигандов [2, 3].
При помощи программ Accelrys Discovery Studio (DS Version 2.5.0.9167 DS Client Version 2.5.0.9164) и PASS 10.1 прогнозировали ADME/Т-свойства (растворимость соединения, пассивное всасывание в кишечнике, связывание с белками плазмы крови, коэффициент липофильности соединения) потенциальных лигандов рецептора NR3C4. Рассчитываемые параметры и соответствующие им диапазоны допустимых значений приведены в таблице 1.
Для оценки токсичности с помощью программ Accelrys Discovery Studio была выбрана модель, которая предсказывает острую токсичность для крыс (LD50) при пероральном введении.
Расчетные значения параметров ADME/Т-свойств потенциальных лигандов рецептора NR3C4, входящих в диапазон допустимых значений, свидетельствует о способности данных соединений обеспечить требуемый физиологический эффект при минимальных побочных эффектах.
Синтез рассчитанных соединений осуществляли с использованием автоматического пептидного синтезатора ABI 433 (Applied Biosystems, USA) и микроволнового реактора MARS (CEM Corporation, USA) [5, 7, 8].
Структуру синтезированных соединений подтверждали методами 'Н и 13С ЯМР-спектроскопии на спектрометрах Bruker AM-300 и Bruker AVANCE 600 (Bruker, Germany). Химические сдвиги измеряли относительно сигнала
растворителя DMCO-d6, 5H 2,5 м.д., 5С 39,5 м.д. Содержание целевого вещества и подтверждение его молекулярной массы осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-детектирование на жидкостном хромато-масс-спектрометре Waters Acquity MSD SQD -ESI (Waters Corporation, USA).
Цикл исследований биологической активности синтезированных образцов включал предварительное растворение исследуемых веществ, определение аффиности растворимых образцов к рецептору NR3C4 методом поляризационной спектрофлуорометрии с помощью тест-системы PolarScreen Green (Invitrogen P3018), исследование цитотоксичности синтезированных соединений на клетках AR-UAS-bla GripTite™ 293 методом флуоресцентной микроскопии, отбор наиболее аффинных и нетоксичных веществ и исследование их антагонистической активности к рецептору NR3C4 по их способности вызывать специфические клеточные сигналы при связывании с рецептором внутри клеток AR-UAS-bla GripTite™ 293 с регистрацией сигнала методом конфокальной микроскопии.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярное моделирование выполнялось с целью предварительного отбора перспективных веществ - потенциальных блокаторов рецепторов NR3C4 для их последующего синтеза и биологического тестирования in vitro на наличие антагонистической активности.
Основная задача, решаемая методом докинга - поиск лигандов, обладающих высокой энергией связывания с белком-мишенью.
Исходя из предположения, что одним из факторов, влияющих на возникновение антагонистического эффекта, вызываемого связыванием лиганда с белком рецептора NR3C4, является пространственная конфигурация (конформация), которую принимает белок рецептора в результате белок-лигандного взаимодействия, для докинга была выбрана конформация белка с известным
Таблица 1
Рассчитываемые параметры ADME/Т-свойств и соответствующие им диапазоны допустимых значений
Параметр Допустимое значение
Растворимость в воде при 25°С (log(Sw) От 0 до -8
Степень пассивного всасывания из кишечника 0 или 1
Вероятность ингибирования фермента цитохром Р450 2D6 Менее 0,5
Степень связывания с белками плазмы крови 0 или 1
антагонистом рецептора из базы данных структур белок-лигандных комплексов PDB (Protein Data Bank) [4]. Показано, что выбор конформации белка для докинга существенно влияет на результаты расчетов [2].
Для докинга была выбрана конформация белка с индексом 1XNN. Данная конформация представляла собой комплекс белка рецептора NR3C4 с селективным модулятором бицикло-Щ-изоиндол-1,3(2Ц)-дионом, содержащий две молекулы воды в активном сайте связывания (рисунок 1).
Расчеты для комплекса 1XNN проводились как с учетом наличия молекул воды в активном сайте связывания, так и без него. Результаты расчетов показали, что программа докинга правильно учитывает наличие или отсутствие воды. Так, при докинге без учета воды программа стремилась поместить на место удаленных молекул воды, заменяющие их атомы лиганда подходящего химического типа. При докинге же с учетом воды программа стремилась разместить лиганды так, чтобы они образовывали водородную связь с молекулой воды.
Докинг проводился для нескольких групп веществ. Вследствие малого размера активного сайта связывания белка рецептора NR3C4, наибольший интерес представляли соединения на основе аминокислот, коротких ди- и трипептидов и их модификации.
В итоге расчеты проводились среди 30000 соединений, относящихся к трем классам: ацилиро-ванные по N-концу ди- и трипептиды, ацилиро-ванные амиды L- и D-аминокислот, ацилирован-ные сложные эфиры L- и D-аминокислот.
Для наиболее перспективных по результатам докинга соединений проводились дополнитель-
ные расчеты ADME/Т-свойств.
Для синтеза и экспериментальных исследований было отобрано 31 соединение, показавшее наилучшие расчетные характеристики (таблица 2).
Из данных таблицы 2 следует, что большей энергией связывания при лиганд-белковом взаимодействии и лучшей растворимостью обладают N-ацилированные производные аминокислот по сравнению с модифицированными пептидами. Кроме того, по расчетным оценкам пептиды проявляют большую токсичность.
Структуры синтезированных соединений подтверждали с помощью методов 'Н и 13С ЯМР-спектроскопии. Методом ВЭЖХ-МС определяли содержание целевого вещества в каждом образце.
По результатам исследования биологической активности in vitro образцы 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3-фторфенил)ацетил]^-пролина (соединение 17, таблица 2), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]^-пролина (соединение 20, таблица 2), 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил]^-пролина (соединение 23, таблица 2) оказались высокоаффинными и малотоксичными антагонистами рецептора NR3C4, что подтвердило результаты молекулярного моделирования.
Таким образом, в работе описан поиск антагонистов рецептора NR3C4 с использованием методов молекулярного моделирования. Построение молекулярной модели белок-лигандного взаимодействия осуществлялось при помощи программного комплекса «Algocomb». С применением программы Accelrys Discovery Studio проведен расчет ADME/Т-свойств для наиболее перспективных (по расчетным оценкам) соединений.
Рис. 1. Лиганд-белковый комплекс 1XNN: белок рецептора NR3C4 (1) и селективный модулятор бицик-ло-1H-изоиндол-1,3(2H)-дион (2).
Таблица 2
Отобранные для синтеза и экспериментальных исследований соединения и их расчетные характеристики
№ Формула и название соединения Расчетные характеристик полученные с помощью программ и Accelrys Discovery Stuc ;и, ы Algocomb io
Оценка связывания с рецептором Ж3С4 Растворимость, log Sw Пассивное всасывание в кишечнике Связывание с белками плазмы крови log P1 LD50, мг/кг
1. ^'''°н° ^- [4-(ацетиламино)бензоил] ^1 -(2-нитробензил)^-треонинамид -15,59 ±0,77 -2,03 ±0,10 3 2 0,7 ±0,03 23 ±1
2. а н, с 1^яЫч;°ы N-фенилацетил^-триптофил-L-серинaмид -15,12 ±0,75 -2,18 ±0,1 1 2 0,9 ±0,04 1500 ±74
3. шП ° н ҐТ'Т' ° .А, ° ^ °Ы ^-[4-(ацетиламино)бензоил]-^-[2-(2-оксоимидазолидин-1 -ил)этил] -L-треонинaмид -15,09 ±0,74 0,21 ±0,01 2 0 1,6 ±0,07 596 ±28
4. 1 Ы СГ3 ^Метил^-{[2-(трифторметил)фенил]ацетил}-D-тирозинaмид -15,09 ±0,75 -4,03 ±0,19 0 2 2,9 ±0,14 377 ±18
5. (Рі н н 4 (3S)- 1-[4-(ацетиламино)бензоил] -3 -гидроксид -[2-(1 -нафтил)этил] -L-пролинaмид -15,03 ±0,74 -2,71 ±0,13 0 1 1,7 ±0,08 10000 ±486
6. ^Х'~'°''°хху 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил]-D-пролинa -15,01 ±0,74 -5,81 ±0,27 0 1 4,9 ±0,24 1100 ±53
№ Формула и название соединения Расчетные характеристик полученные с помощью программ и Accelrys Discovery Stuc ;и, ы Algocomb io
Оценка связывания с рецептором Ж3С4 Растворимость, log Sw Пассивное всасывание в кишечнике Связывание с белками плазмы крови log P1 LD50, мг/кг
7. & 3-аминобензиловый эфир 2-К-[(трифторметил)фенил]ацетил-D-аланина -15,01 ±0,75 -4,32 ±0,21 0 2 4,2 ±0,19 369 ±18
8. Н ' (3S)- 1-[4-(ацетиламино)бензоил] -3 -гидрокси-N-(3 -фенилпропил)-L-пролинамид -14,94 ±0,70 -1,81 ±0,09 0 2 1,3 ±0,06 10000 ±486
9. о ^^'С1 но 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]-4-гидрокси-D-пролина -14,79 ±0,73 -4,67 ±0,23 0 1 4,0 ±0,18 10000 ±498
10. ?02 2-(2-нитрофенил) этиловый эфир 1-[(4-фторфенил)ацетил]-D-пролина -14,69 ±0,72 -4,28 ±0,21 0 1 3,6 ±0,17 599 ±28
11. Г~0 \ Н н х (3S)- 1-[4-(ацетиламино)бензоил] -3 -гидрокси-N -[2-(2,3 -дигидро-1 -бензофуран-7-ил)этил] -L-пролинамид -14,68 ±0,70 -1,99 ±0,09 0 1 0,9 ±0,04 10000 ±486
12. ^-0о 1 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3-фторфенил)ацетил]-D-пролина -14,64 ±0,70 -5,57 ±0,26 0 1 4,6 ±0,22 1100 ±53
Расчетные характеристик полученные с помощью программ и Accelrys Discovery Stuc си, ы Algocomb io
№ Формула и название соединения Оценка связывания с рецептором Ж3С4 Растворимость, log Sw Пассивное всасывание в кишечнике Связывание с белками плазмы крови log P1 LD50, мг/кг
13. (| 1 I о N"4 Н 4 (3S)- 1-[4-(ацетиламино)бензоил] -3 -гидрокси-К-[2-(2-фторфенил)этил] -L-пролинамид -14,54 ±0,68 -2,03 ±0,10 0 1 1,0 ±0,04 5600 ±278
14. ХГ^л.хг 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]^-пролина -14,53 ±0,68 -5,61 ±0,26 0 1 4,9 ±0,24 1200 ±58
15. С1 Н (3S)- 1-[4-(ацетиламино)бензоил] -3 -гидрокси-К-[2-(2-хлорфенил)этил] -L-пролинамид -14,52 ±0,68 -2,43 ±0,12 0 1 1,5 ±0,07 5900 ±291
16. N^4 Н 4 (3S)- 1-[4-(ацетиламино)бензоил] -3-гидрокси-К-(2-фенилпропил)-L-пролинамид -14,51 ±0,68 -1,89 ±0,09 0 1 1,2 ±0,05 4300 ±211
17. 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3 -фторфенил)ацетил] ^-пролина -14,38 ±0,69 -5,57 ±0,26 0 1 4,6 ±0,22 1100 ±53
18. Оч о N-фенилацетил^-триптофил-глицинамид -14,06 ±0,7 -2,58 ±0,12 0 2 1,3 ±0,06 260 ±12
№ Формула и название соединения Расчетные характеристик полученные с помощью программ и Accelrys Discovery Stuc ;и, ы Algocomb io
Оценка связывания с рецептором Ж3С4 Растворимость, log Sw Пассивное всасывание в кишечнике Связывание с белками плазмы крови log P1 LD50, мг/кг
19. 1Ч°2 2-(2-нитрофенил) этиловый эфир 1-[(4-фторфенил)ацетил] -L-пролина -13,96 ±0,65 -4,28 ±0,21 0 1 3,6 ±0,17 599 ±28
20. 1гЛХгс 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил] -L-пролина -13,87 ±0,65 -5,61 ±0,26 0 1 4,9 ±0,24 1200 ±58
21. ^ о>-^ у1 нЧ ,о о 2 N-фенилацетил^-триптофил-L-аланинамид -13,58 ±0,67 -3,05 ±0,15 0 2 1,8 ±0,08 297 ±14
22. СШ^О н X о он ^(фенилсульфонил)^-треонил- L-фенилаланинамид -13,56 ±0,67 -2,47 ±0,12 1 2 0,7 ±0,03 2 ±0,09
23. С^_^о 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил] ^-пролина -13,32 ±0,65 -5,81 ±0,27 0 1 4,9 ±0,24 1100 ±53
24. но н HN Ч II о но^^^^ L-тирозил-L-триптофан -9,18 ±0,45 -2,73 1 2 0,5 ±0,02 315 ±15
25. хт о о г Но N >1 2 = н II т о ^ацетил^-глутамил- D-тирозинамид -9,05 ±0,45 -0,73 ±0,03 3 0 0,7 ±0,03 35 ±1,5
Расчетные характеристик полученные с помощью программ и Accelrys Discovery Stuc си, ы Algocomb io
№ Формула и название соединения Оценка связывания с рецептором NR3C4 Растворимость, log Sw Пассивное всасывание в кишечнике Связывание с белками плазмы крови log P1 LD50, мг/кг
26. HO. XX O H NH2 N-ацетил^-тирозил^-пролил-L-аланинамид -8,84 ±0,44 -0,99 ±0,04 2 1 0,6 ±0,02 10 ±0,4
27. o н o X ll ^ацетил^-фенилаланил- D-тирозинамид -8,48 ±0,42 -1,94 ±0,09 0 1 1,1 ±0,05 83 ±4
28. H N w""S o Ov yy\N> nh2 ' ' N-ацетил^-пролил-L-триптофанамид -8,33 ±0,41 -2,15 ±0,09 0 0 0,4 ±0,01 274 ±13
29. NHj hn'V , <A° Vm N H ^ацетил^-тирозил- L-триптофанамид -7,96 ±0,39 -2,73 ±0,13 1 2 1,4 ±0,06 315 ±15
30. O o4n^^^oh H ^o H2N ^ацетил^-пролил- L-тирозинамид -7,87 ±0,39 -1,03 ±0,05 0 2 0,1 ±0,04 36 ±1,5
31. O O^NH N-ацетил^-тирозил^-пролил-L-пролинамид -7,72 ±0,38 -1,35 ±0,06 1 0 0,3 ±0,01 10 ±0,4
Примечания: 1 - коэффициент липофильности соединения
По результатам молекулярного моделирования синтезирован и исследован 31 образец.
Проведен скрининг аффинности и цитотоксичности синтезированных образцов in vitro. У наиболее аффинных и малотоксичных соединений определена антагонистическая активность к
рецептору NR3C4 клеток AR-UAS-bla GripTite™ 293. Образцы 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(3-фторфенил)ацетил]^-пролина, 2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-хлорфенил)ацетил]^-пролина,
2-(1-нафтил) этиловый эфир 1-[(4-метилфенил)ацетил]^-пролина проявили выра-
женный антагонистический эффект. 5
ЛИТЕРАТУРА
6
1. Глыбочко П.В., Бутнару Д.В., Зезеров Е.Г.,
Аляев Ю.Г., Северин С.Е., Бараршков Г.К., Варшавский В.А., Винаров А.З., Безруков Е.А., Осипов Е.В., Зайцев Л.И. Микроэлементы при опухолях предстательной железы // Сеченовский вестник. -
2011. - № 1. - С. 35-41. 7
2. Королев В.Л., Алексеев А.А., Брылев М.И., Лото-
рев Д.С., Лизунов А.Ю., Батуев Е.А., Павлова Л.А. Молекулярное моделирование, синтез и оценка биологической активности новых антагонистов GPIIb/Ша-рецепторов тромбоцитов // Молекулярная медицина. - 2013. - № 5. - С. 61-63. 8
3. Кузнецов П.Е., Кузнецова Н.Б., Шульгин С.В.,
Шантроха А.В., Дубас Е.Н. Молекулярное моделирование трехмерной структуры внеклеточных петель ССК2 рецептора // Химикофармацевтический журнал. - 2008. - № 4. - 9
С. 30-34.
4. Электронная база данных Protein Data Bank [Электронный ресурс] // База данных расшифрованных трехмерных структур белковых комплексов - Режим доступа: http://www.rcsb.org/pdb/, свободный (15.12.2013).
Dick F. Acid cleavage/deprotection in FMOC/tBu solid-phase peptide synthesis // Methods in Molecular Biology. - 1994. - Vol. 35. - P. 63-72.
Marwah P., Marwah A., Lardy H.A., Miyamoto H., Chang C. CJ9-Steroids as androgen receptor modulators: Design, discovery, and structure-activity relationship of new steroidal androgen receptor antagonists // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2006. -Vol. 14. - P. 5933-5947.
Sheng, X.C., Pyun, H.-J., Chaudhary, K., Wang, J., Doerffler, E., Fleury, M., McMurtrie, D., Chen, X., Kim, C. U. Discovery of novel phosphonate derivatives as hepatitis C virus NS3 protease inhibitors // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. - 2009. -Vol. 19. - P. 3453-3457.
Wohlrab A., Lamer R., VanNieuwenhze M.S. Total Synthesis of Plusbacin A3: A Depsipeptide Antibiotic Active Against Vancomycin-Resistant Bacteria // Journal of the American Chemical Society. - 2007. -Vol. 129, № 14. - P. 4175-4177.
Yamamoto S., Kobayashi H., Kaku T., Aikawa K., Ha-ra T., Yamaoka M., Kanzaki N., Hasuoka A., Baba A., Ito M. Design, synthesis, and biological evaluation of
3-aryl-3-hydroxy-1-phenylpyrrolidine derivatives as novel androgen receptor antagonists // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2013. - Vol. 21. - P. 70-83.
