CC BY
42
УДК 577.1: 547.96
МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ АДЕНОЗИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
А.А. Иванов, И.И. Баскин, В.А. Палюлин, Н.С. Зефиров
(кафедра органической химии)
В работе проведено обобщение данных по компьютерному моделированию аденози-новых рецепторов и молекулярному докингу их лигандов. Показано, что на сегодняшний день наиболее изученными являются А1-, А2а- и АЗ-подтипы аденозиновых рецепторов, в то время как структура и механизмы связывания лигандов А2Ь-подти-па практически не исследованы. Рассмотрены разные подходы к построению моделей данных рецепторов, а также основные закономерности и отличия в механизмах связывания лигандов.
Как известно, все пуриновые рецепторы подразделяются на две большие группы - Р1 (или аденозиновые) и Р2 [1]. Общим природным агонистом аденозиновых рецепторов является аденозин, в то время как общим лигандом Р2-рецепторов служит АТФ [2]. Кроме того, Р2-рецепторы не чувствительны к антагонистическому действию метилксантинов, являющихся эффективными антагонистами Р1-рецепторов [3, 4]. Основываясь на разной селективности к аналогам аденозина, а также на биохимических и фармакологических свойствах, аденозиновые рецепторы разделяют на четыре подтипа (А1, А2а, А2Ь и А3), которые клонированы для разных видов млекопитающих и человека. Все они являются сопряженными с О-белками. Аденозиновые рецепторы широко представлены в разных типах тканей и участвуют в регуляции целого ряда биологических процессов. Активация А1- и АЗ-рецепторов вызывает снижение уровня цАМФ [5, 6], а активация А2а- и А2Ь-рецепто-ров приводит к его увеличению [7, 8]. Кроме того, стимулирование А1-рецепторов вызывает активацию калиевых и дезактивацию кальциевых каналов [9, 10], а стимулирование А2а-рецепторов приводит к ингибированию функциональной активности Б2-дофаминовых рецепторов, что имеет важное значение в развитии неврологических и психических заболеваний [11, 12]. Лиганды аденозиновых рецепторов находят широкое применение в фармакологии и медицине, что в свою очередь делает крайне важной и актуальной задачу изучения структуры данных рецепторов и поиска их новых, более эффективных и селективных лигандов. На сегодняшний день существует достаточно большое число публикаций, посвященных молекулярному моделированию аденозино-вых рецепторов с использованием различных подходов к построению моделей. В лаборатории органического синтеза кафедры органической химии активно ведутся работы по моделированию аденозиновых рецепторов и компьютерному дизайну их селективных лигандов. Целью данного обзора является обобщение накопленных данных по моделированию аденозиновых рецепторов.
Аденозиновые рецепторы, как и другие рецепторы, сопряженные с О-белками, представляют собой мембранные белки, плохо поддающиеся кристаллизации, а следовательно, точному структурному изучению методом рентгеноструктурного анализа. На рис. 1 представлено общее строение сопряженных с О-белками рецепторов, состоящих из семи трансмембранных а-спира-лей, попарно соединенных тремя внешними и тремя внутриклеточными гидрофильными петлями.
К настоящему времени существуют надежные данные рентгеноструктурного анализа двух схожих мембранных белков - бактериородопсина и родопсина. Как правило, именно эти белки используют в качестве шаблонов для построения молекулярных моделей рецепторов, сопряженных с О-белками.
Рис. 1. Общее строение рецепторов, сопряженных c G-белками
Первые модели рецепторов, сопряженных с О-белка-ми, базировались на структуре бактериородопсина, полученной методом электронной микроскопии [13, 14]. Предполагалось, что рецепторы, сопряженные с О-бел-ками, имеют такое же расположение трансмембранных а-спиралей, что и бактериородопсин. Однако было высказано предположение, что бактериородопсин не является подходящим шаблоном для построения моделей, так как не является сопряженным с О-белком. Данные электронной микроскопии родопсина коровы, лягушки и кальмара показали, что действительно расположение а-спиралей в родопсине и бактериородопсине существенно отличается [15-17]. В 1993 г., анализируя аминокислотные последовательности более двухсот рецепторов, сопряженных с О-белками, и данные электронной микроскопии, Болдуин предложил два правила расположения семи трансмембранных спиралей [18]: 1) каждая а-спираль должна располагаться после предыдущей в аминокислотной последовательности; 2) первая, четвертая и пятая спирали должны находиться в наибольшей, а третья спираль - в наименьшей близости к ли-пидному окружению рецептора. На основании этих правил была построена молекулярная модель р2-адре-норецептора [19]. Были построены также модели с использованием автоматизированного подхода, основанного на детальном анализе аминокислотных последовательностей, множественном выравнивании этих последовательностей и использовании интерактивных графических пакетов [20, 21]. Была предложена методика "упаковки" семи а-спиралей рецептора в трансмембранный домен, учитывающая правила Болдуина и базирующаяся на экспериментальных и теоретических данных [22, 23]. В 1997 и 1999 гг. были построены модели, основанные на расчетах по методу дистанционной геометрии и учитывающие максимальное число водородных связей внутри а-спиралей для рецепторов, сопряженных с О-белками [24, 25].
Первой моделью аденозиновых рецепторов стала модель А1-подтипа, построенная в 1992 г. [26] по гомологии со структурой бактериородопсина низкого разрешения. К этому моменту уже были опубликованы данные по клонированию и мутагенезу А1-рецептора коровы [27], было известно, что при замене №8278 на Ьеи278 в седьмой а-спирали способность как агонистов ([1251]ЛРКБСЛ), так и антагонистов ([3Н]ХЛС) связываться с рецептором падает более, чем на 90%, в то время как замена Н1в251 на Ьеи251 в шестой а-спирали приводила к падению афинности для антагонистов в гораздо большей степени, чем для агонистов. На основании полученных данных авторами [27] был сделан вывод, что оба гистидиновых остатка важны для связывания как агонистов, так и антагонистов, но Н1в251 особенно важен для связывания антагонистов аденозино-вых рецепторов. В работе [26] с помощью компьютер-
ного моделирования было показано, что химическая модификация двух гистидиновых остатков, расположенных в шестой и седьмой а-спиралях, сильно влияет на связывание лигандов. Эти данные, заложившие основу для дальнейшего изучения сайта связывания лигандов с аденозиновыми рецепторами, позволили авторам провести докинг эффективного и А1-селективного агониста К6-циклопентиладенозина. В 1994 г. в работе [28] была описана подобная модель, базирующаяся на структуре бактериородопсина и учитывающая важность двух гистидиновых остатков для связывания лиган-дов, для А2а-рецептора крысы. Докинг селективного аго-ниста БНЛ174 показал, что непротонированный атом азота №8245 образует водородную связь с К6-протоном лиганда. Кроме того, возможно образование водородных связей между №8245 и 2'- и 3'-ОН-группами рибозного фрагмента (рис. 2). В работе отмечено, что некоторые другие аминокислотные остатки рецептора расположены на достаточно близком расстоянии от функциональных групп лиганда. Было показано, что аминогруппа карбоксамида Л8п248 может взаимодействовать с К!-по-ложением пуринового кольца, гидроксильная группа Бег129 - с непротонированым атомом азота гидразино-вой части БНЛ174, а Бег276 образует водородную связь с 5'-ОН-группой рибозной части лиганда. В этой же работе описаны взаимодействия функциональных групп селективных антагонистов с аминокислотными остатками А2а-рецептора. Стоит отметить, что докинг антагонистов несколько отличает данную работу от большинства других, в которых рассматриваются лишь взаимодействия агонист - рецептор. Докинг наиболее
Рис. 2. Фрагмент первой модели А2а аденозинового рецептора [28]
селективного антагониста CSC показал, что Trp241 может взаимодействовать с карбонильной группой (С6=О) лиганда, образуя водородную связь. 3-Хлорстирил (гидрофобный заместитель лиганда) оказался "утопленным" в гидрофобный карман, образованный Ile132, Tyr174, Phe177, Cys249 и Phe252. Кроме того, His245, Asn248 и His273 также находятся в непосредственной близости от лиганда и могут участвовать в его связывании. Позднее с помощью работ по мутагенезу было установлено, что как гистидиновые, так и другие аминокислотные остатки важны для связывания агонистов и антагонистов аденозиновых рецепторов. Важность изолейци-на-274 и треонина-277 для связывания лигандов A1-рецептора человека была более детально изучена в [29], где показано, что изолейцин взаимодействует с заместителями в ^-положении аденозина, а Thr277 важен для взаимодействия с рибозной частью, особенно при отсутствии заместителей в ^-положении. К тем же выводам относительно Thr277 пришли авторы [30]. Одной из наиболее интересных и важных работ последнего времени, посвященных построению модели А1-подтипа и определению сайта связывания, является работа [31], где анализируется докинг шести лигандов данного подтипа, среди которых присутствует природный агонист аденозин. На его примере, подтверждаются данные о взаимодействии рибозной группы лиганда с Thr277 и His278, хотя ничего не сообщается о взаимодействиях с Ile274. В работе также показано, что при наличии фе-нильного заместителя во втором положении аденозино-вого кольца антагонистов может образовываться водородная связь между этим заместителем и двумя аминокислотами рецептора (Phe86 и Phe275), хотя Thr277 и His278 также участвуют в связывании.
Между тем существуют данные [32], позволяющие предположить, что His278 может и не принимать участия в связывании антагонистов. В работе [33] описана модель А 2 а-рецептора человека, основанная на структуре родопсина. Авторами было проведено мутирование двенадцати аминокислотных остатков в пятой, шестой и седьмой а - спиралях, а именно Phe182, Asn253, Cys254, Ile274, His278 и Ser281, присутствующих во всех аденозиновых рецепторах, Phe181 и His250, присутствующих в А1- и А 2-рецепторах, Ser277, характерного для А2- и А3-подтипов, Phe257 и Tyr271, характерных для А2-рецепторов и Phe180 (Tyr180), присутствующего в аденозиновых рецепторах либо как Phe, либо как Tyr. Каждая аминокислота подвергалась индивидуальному мутированию на аланин. Было установлено, что при замене Phe 180 и Cys254 на Ala, рецептор обладает такой же афинностью к NECA, DPMA, CGS15943 и XAC (рис. 3), что и большинство других аденозиновых рецепторов.
Эти данные позволяют сделать вывод о том, что ароматическая группа в Phe 180 и SH-группа в Cys254
не участвуют в связывании лигандов. Мутации Бег277 показали, что гидроксильная группа в боковой цепи се-рина необходима для эффективного связывания не антагонистов, а агонистов, особенно не замещенных в К6-положении. При мутациях Л8п181 теряется афинность для агонистов, замещенных в К6- и С-2-положениях, не в С-5'. Мутации РЬе182, №8250, Л8п253, 11е274, №8278 и Бег281 показали, что данные аминокислоты важны для связывания как агонистов, так и антагонистов А2а-рецептора. Описанная выше работа получила продолжение, и год спустя те же авторы опубликовали новые данные о взаимодействиях между лигандом и аминокислотами в третьей и седьмой а-спиралях [34]. Было показано, что при мутациях Бег90Л1а, Бег91Л1а и Бег277Су8 афинность лигандов меняется незначительно. В то же время более детальное изучение роли Бег281 при связывании с лигандами позволило предположить, что серин в 281 положении в большей степени важен для связывания антагонистов и в меньшей агонистов. Существенным вкладом в изучение аденозиновых рецепторов явилась экспериментальная работа по мутагенезу сайта связывания А1-рецептора человека, а именно аминокислотных остатков, входящих в первые четыре а-спирали [35]. Было установлено, что замена О1и16 и Л8р55 на аланин вызывает серьезные изменения в афинности агонистов, что свидетельствует о важности данных аминокислот при связывании агонистов с рецептором. При замене Бег94 на Л1а94 не удалось зафиксировать каких-либо изменений в уровне цЛМР даже при высокой концентрации лиганда, эти данные показывают, что Бег94 оказывается важным для связывания как агонистов, так и антагонистов. При этом в работе отмечено, что Бег94 взаимодействует с С2- или С6-по-ложениями аденинового кольца антагониста, и с N -или N -положениями агониста. На основании модели, приведенной в [33], была построена модель А1-рецеп-тора человека [36]. В работе [36] основное внимание уделено изучению роли аминокислотных остатков в 1-4 а-спиралях; показано, что группировки, расположенные в К6-положении лигандов, взаимодействуют с Ьеи88, !Ьг91 и О1п92 (рис. 4).
Было отмечено, что замена О1п14 на 1Ъг14 повышает афинность агонистов, в то время как мутации О1и16 в А1-рецепторе и О1и11 в А2а-рецепторе приводят к ее падению. На основании этих данных, было сделано предположение, что мутации в первой а-спирали косвенным образом влияют на взаимодействие рибозной группы лиганда с седьмой а-спиралью, находящейся в непосредственной близости от первой. Важность первой а-спирали для связывания лигандов и возможность ее взаимодействия с гистидином в седьмой а-спирали были также рассмотрены в работе [37]. Для изучения взаимодействий между лигандами и А2а-рецептором, был проведен мутагенез остатка глутаминовой кислоты
Рис. 3. Лиганды аденозиновых рецепторов
(О1и13), входящей в первую а-спираль, на глутамин и гистидина (№8278), входящего в седьмую трансмембранную спираль, на тирозин. Все тестируемые в этой работе лиганды проявляли более низкую афинность к мутированным рецепторам по сравнению с неизмененным А2а-рецептором, что говорит о непосредственном или косвенном влиянии данных аминокислот на связывание агонистов. Афинность агонистов практически не изменялась при мутациях О1и13, но значительно падала
при мутациях гистидина, что говорит о большей значимости №8278 для связывания антагонистов.
К настоящему времени также достаточно хорошо изученным является А3-подтип. К сожалению, для данного подтипа не проводились эксперименты по мутагенезу сайта связывания, что существенным образом затрудняет задачу построения модели и докинга ли-гандов. Тем не менее существует ряд работ, посвященных именно моделированию данного подтипа и изуче-
Рис. 4. Связывание агонистов А1-рецептора [36]
нию роли разных аминокислотных остатков при связывании как агонистов, так и антагонистов А3-рецепто-ра. Первые данные о сайте связывания АЗ-подтипа [38] показали, что взаимодействие лигандов с рецептором осуществляется за счет образования водородных связей с аминокислотами, принимающими участие в связывании лигандов других подтипов аденозиновых рецепторов, а именно с №8274 и Бег277. Как и в случае остальных подтипов, лиганды А3-рецептора взаимодействуют с №8274 посредством 2'- и 3'-ОН-групп, а с Бег277 за счет 5'-ОН-группы рибозного фрагмента. Стоит отметить, что описанная в данной работе модель строилась по аналогии с построенной ранее моделью А1-рецептора [26] и докинг лигандов проводился по аналогии с А1-подтипом. Так как в А3-рецепторе на
месте гистидинового остатка, взаимодействующего с лигандами в других подтипах, находится серин (Бег249), был проведен анализ возможного участия данной аминокислоты в связывании лигандов рецепторов А3-подтипа и было показано, что Бег249 находится на слишком большом (~7 А) расстоянии от К6-Н для возникновения водородной связи и не может участвовать в связывании лигандов А3-подтипа. В 2001 г. появилась работа Якобсона [39], также посвященная А3-подтипу аденозиновых рецепторов, в которой основное внимание было уделено идентификации аминокислот в седьмой а-спирали, принимающих участие в связывании лигандов. Для построения модели А3-рецептора в качестве шаблона использовали структуру родопсина. Построенная модель содержит семь трансмембранных а-спиралей и вторую внутриклеточную гидрофильную петлю. №8272 в модели оказался расположенным на расстоянии 2,40 А от 01и19, вполне достаточном для взаимодействия этих двух аминокислот. Кроме того, в работе говорится, что 01и19 может взаимодействовать с Туг265 и Бег73. Докинг САБО и С1-1В-МЕСА (агонистов А3-адено-зиновых рецепторов) показал, что КН2-группа САБО расположена на достаточном для образования водородной связи расстоянии от атомов кислорода Тгр243 и Бег247 (2,76 и 2,51 А соответственно), в то время как в С1-1В-МЕСА такое взаимодействие наблюдается только с Бег247 (рис. 5).
К6-Бензил-замещенное С1-1В-МЕСА в основном взаимодействует с РЬе182, 11е186 и РЬе187, благодаря чему весь лиганд оказывается сдвинутым к пятой и шестой а-спиралям и, соответственно, удален от седьмой. Очевидно по этой причине 3'-ОН-группа С1-1В-МЕСА
Тф243 Эег247
1ЧН2
САйО 1 1 ?
Не 186
РИе182 У4*
РИе187
Бег247
СГ НОСН. о
61п167
И /
НО он Эег271 Н'1б272
/
ын
хх>
сн^нс" о но он
СМВ-МЕСА
/
8ег271
Рис. 5. Связывание лигандов А3-подтипа [39]
взаимодействует лишь с Ser271, тогда как эта же группа в CADO образует водородные связи как с Ser271, так и с His272. Кроме того, отмечено, что гидроксиль-ная группа в 2'-положении рибозного кольца СADO находится на достаточном для образования водородной связи расстоянии от кислорода Gln167 и азота Lys152. Помимо этого, было показано [40], что Ser242, Ser271, His274 и Ser275 могут играть особенно важную роль при связывании антагонистов. В этой работе в качестве антагонистов предложены и синтезированы биологически активные производные пиразоло[4,3-e]-1,2,4-триазо-ло[1,5-с]пиримидинов. Докинг данных соединений показал, что Ser275 оказывается крайне важным при связывании лигандов.
Анализ литературных данных показывает, что к настоящему времени относительно хорошо изучено строение А1-, А2а- и А3-аденозиновых рецепторов, суще-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Freedholm B.B., Ijzerman A.P., Jacobson K.A., Klotz K.N.,
Linden J. // Pharmacol. Rev. 2001. 53. P. 527.
2. Ralevic V., Burnstock G. // Pharmacol. Rev. 1998. 50. P. 413.
3. De Gubareff T, Sleator W.J. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1965. 148.
P. 202.
4. SattinA., Rall T.W. // Mol. Pharmacol. 1970. 6. P. 13.
5. Jockers R., Linder M.E., Hoehnegger M. // J. Biol. Chem. 1994.
269. P. 32077.
6. Palmer T.M., Gettys T.W., Stiles G.L. // J. Biol. Chem. 1995. 270.
P. 16895.
7. Kull B., Svenningsson P., Fredholm B.B. // Mol. Pharmacol. 2000.
58. P. 771.
8. Bruns R.F., Lu G.H., Pugsley T.A. // Mol. Pharmacol. 1986. 29.
P. 331.
9. Iredale P.A., Alexander S.P.H., Hill S.J. // Br. J. Pharmacol. 1994.
111. P. 1252.
10. Bunemann M., Pott L. // J. Physiol. 1995. 482. P. 81.
11. Fuxe K, Ferre S., ZoliM., Agnati L.F. // Brain Res. Rev. 1998. 26.
P. 258.
12. Franco R., Ferre S., Agnati L., Torvinen M., Gines S., Hillion J. // Neuropsychoparmacol. 2000. 23. P. S50.
13. HibertM.F., Trumppkallmeyer S., Bruinvels A., Hoflack J. // Mol. Pharmacol. 1991. 40. P. 8.
14. Findlay J., Eliopoulos E. // Trends Pharmacol. Sci. 1990. 12. P. 492.
15. Schertler G.F.X., Hargrave P.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. 92. P. 11578.
16. Schertler G.F.X., Villa C, Henderson R. // Nature. 1993. 362. P. 770.
17. Davies A., Schertler G.F.X., Gowen B.E., Saibil H.R. // J. Struct. Biol. 1996. 117. P. 36.
18. Baldwin J.M. // EMBO J. 1993. 12. P. 1693.
19. Donnelly D., Overington J.P., Ruffle S.V. // Protein Sci. 1993. 2. P. 55.
20. Alkorta I, Du P. // Protein Eng. 1994. 7. P. 1231.
ствует обширный набор селективных и эффективных лигандов данных подтипов. В то же время практически неизученным остается А2Ь-подтип, для которого не существует надежных молекулярных моделей. Кроме того, для данного подтипа ненайденными остаются селективные и эффективные лиганды (как агонисты, так и антагонисты). В заключение необходимо отметить, что на данный момент не построено ни одной молекулярной модели аденозиновых рецепторов, содержащей гидрофильные петли, что в значительной мере затрудняет понимание механизмов селективного связывания ли-гандов с рецепторами. Тем не менее накопленные к сегодняшнему дню данные, позволяют объяснить основные закономерности и отличия в структуре аденозиновых рецепторов в лиганд-рецепторных взаимодействиях и дают общее представление о перспективных путях поиска новых более эффективных и селективных лигандов.
21. Taylor W.R., Jones D.T., Green N. M. // Proteins. 1994. 3. P. 281.
22. HerzykP., HubbardR.E. // Biophys. J. 1995. 69. P. 2419.
23. Herzyk P., Hubbard R.E. // J. Mol. Biol. 1998. 281. P. 741.
24. Pogozheva I.D., Lomize A.L., Mosberg H.I. // Biophys. J. 1997. 72.
P. 1963.
25. Lomize A.L., Pogozheva I.D., Mosberg H.I. // JCAMD. 1999. 13. P. 325.
26. Ijzerman A.P., van Galen P.J.M., Jacobson K.A. // Drug Des. Discov. 1992. 9. P. 49.
27. Olah M.E., Ren H., Ostrowski J., Jacobson K.A., Stiles G.L. // J. Biol. Chem. 1992. 267. P. 10764.
28. Ijzerman A.P., van der Wenden E.M., van Galen P.J.M. // Eur. J. Pharmacol. 1994. 268. P. 95.
29. Tucker A.L., Robeva A.S., Taylor H.E., Holeton D., Bockner M. // J. Biol. Chem. 1994. 269. P. 27900.
30. Townsend-Nicholson A., SchofieldP.R. // J. Biol. Chem. 1994. 269. P. 2373.
31. Bianucci A.M., BigiM.U., Biagi G., Giorgi I., Livi O., Scartoni V. // Drug Des. Discov. 1998. 15. P. 149.
32. Dawson E.S., Wells J.N. // Mol. Pharmacol. 2001. 59. P. 1187.
33. Kim J., Wess J., van Rhee A.M., Schoneberg T., Jacobson K.A. // J. Biol. Chem. 1995. 270. P. 13987.
34. Jiang Q., van Rhee A.M., Kim J., Yehle S., Wess J., Jacobson K.A. // Mol. Pharmacol. 1996. 50. P. 512.
35. Barbhaiya H., McClain R., Ijzerman A., Rivkees S.A. // Mol. Pharmacol. 1996. 50. P. 1635.
36. Rivkees S.A., Barbhaiya H., Ijzerman A.P. // J. Biol. Chem. 1999. 274. P. 3617.
37. Gao Z.G., Jiang Q., Jacobson K.A., Ijzerman A.P. // Biochem. Pharmacol. 2000. 60. P. 661.
38. Galen van P.J.M., Bergen van A.H., Gallo-Rodriguez C. // Mol. Pharmacol. 1994. 45. P. 1101.
39. Jacobson K.A., Gao Z.G., Chen A., Barak D. // J. Med. Chem. 2001. 44. P. 4125.
40. Baraldi P.G., Cacciari B., Moro S., Spalluto G., Pastorin G. // J. Med. Chem. 2002. 45. P. 770.
Поступила в редакцию 01.07.02
