CC BY
9Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 23 (62). 2010. № 3. С. 255-261.
УДК 547.918:577.112.387.2:543.422.3-76:581.142
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ С L-ФЕНИЛАЛАНИНОМ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
Яковишин Л.А.1, Гришковец В.И.2, Сергиенко Ю.И.1, Корж Е.Н.1
1 Севастопольский научно-производственный центр стандартизации, метрологии и
сертификации, Севастополь, Украина
2Таврический национальный университет им В.И. Вернадского, Симферополь, Украина
E-mail: chemsevntu@rambler.ru
Впервые методом УФ-спектроскопии исследовано молекулярное комплексообразование L-фенилаланина с 3-О-а^-рамнопиранозил-(1^2)-О-а^-арабинопиранозидом хедерагенина (а-хедерином) и его 28-О-а^-рамнопиранозил-(1^4)-О^-,0-глюкопиранозил-(1^6)-О^-Г>-глюкопиранозиловым эфиром (хедерасапонином С) в водных растворах. Установлено, что гликозиды образуют комплексы с L-фенилаланином состава 1:1. Сделан вывод о влиянии строения гликозидов и L-фенилаланина на процесс комплексообразования. Проведено сравнительное изучение влияния гликозидов и их комплексов на всхожесть семян Avena sativa L.
Ключевые слова: тритерпеновые гликозиды, а-хедерин, хедерасапонин С, L-фенилаланин, молекулярный комплекс, УФ-спектроскопия, Avena sativa L., всхожесть семян.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время широко изучается молекулярное комплексообразование сапонинов с разнообразными биологически активными молекулами. Возросший интерес к данным супрамолекулярным продуктам обусловлен, прежде всего, возможностью создания новых лекарственных препаратов за счет снижения терапевтических доз, повышения биодоступности и расширения спектра биологической активности лекарственных веществ [1, 2].
В связи с этим были получены комплексы ароматических протеиногенных аминокислот с некоторыми стероидными и тритерпеновыми гликозидами. Комплексы L-тирозина (Tyr), L-триптофана (Trp) и L-фенилаланина (Phe) с сердечным гликозидом К-строфантином-ß имеют практически одинаковые константы устойчивости. Однако наблюдаются сильные отличия в устойчивости комплексов этих аминокислот с другим гликозидом - дигоксином. Наиболее прочный комплекс дает Tyr, а наименее прочный - Trp. Также были синтезированы тройные комплексы, содержащие дополнительно катионы Ca2+ и Mg2+ [3].
Методом времяпролетной плазменно-десорбционной масс-спектрометрии с ионизацией осколками деления 252Cf были охарактеризованы комплексы аминокислот со стероидными агликонами неотигогенином и гитогенином, а также их гликозидами [4, 5]. Установлено, что биозид и триозид неотигогенина дают устойчивые комплексы с Phe, однако слабо взаимодействуют с Tyr и не дают
комплексов с Trp. В отличие от них, петуниозид D образует комплекс со всеми ароматическими аминокислотами. Причем комплексы Trp и Tyr имеют близкую устойчивость, а комплекс с Phe оказался наиболее прочным.
В качестве перспективных молекулярных носителей биомолекул и фармаконов нами предложены 3 -О-а-£-рамнопиранозил-(1 ^2)-О-а-£-арабинопиранозид хедерагенина (а-хедерин, гликозид 1, рис. 1) и его 28-О-а-Х-рамнопиранозил-(1 ^4)-О-Р-^-глюкопиранозил-(1 ^6)-О-Р-,0-глюкопиранозиловый эфир
(хедерасапонин С, гликозид 2, рис. 1) [6, 7]. Гликозиды 1 и 2 входят в состав противокашлевых лекарственных препаратов на основе экстрактов листьев плюща обыкновенного Hedera helix L. [8-10].
Рис. 1. Строение компонентов молекулярных комплексов (гликозид 1: Я=Н; гликозид 2: R=^pGlc£>-(6^1)-PGlc£>-(4^1)-aRha£>).
Масс-спектрометрически с ионизацией электрораспылением рассмотрено комплексообразование Tyr, Trp и Phe с гликозидами 1 и 2 [11]. Недавно мы сообщали о молекулярных комплексах Trp с гликозидами 1 и 2 в водных растворах, для которых методом УФ-спектроскопии был определен их состав [12]. УФ-спектроскопическое исследование комплексообразования Phe с гликозидами 1 и 2 в водном растворе ранее не проводилось.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Гликозиды 1 и 2 выделяли из листьев плющей Hedera taurica Carr. и Hedera canariensis Willd. и подтверждали их строение по методикам, приведенным в работах [13, 14]. Комплексы получали путем смешивания водных растворов Phe и гликозидов 1 и 2. Полученные смеси выдерживали при комнатной температуре (2022 °С) в течение 40 мин при постоянном перемешивании.
УФ-спектры получены при комнатной температуре (20-22 °С) на спектрофотометре Unico UV-Vis 4802 (США) в кварцевых кюветах (l = 1 см). Для составления изомолярной серии использовали 10-4 М растворы гликозидов и Phe. УФ-спектры приведены на Рис. 2 и 3, изомолярные кривые - на Рис. 4.
30
'OH
O
OH
Влияние на всхожесть проверяли в лабораторных условиях на семенах Avena sativa L. (семейство Poaceae) при комнатной температуре (23-25 °C). Для биоиспытаний смеси водных растворов Phe и гликозидов 1 и 2 предварительно перемешивали 40-60 мин при комнатной температуре. Концентрации индивидуальных гликозидов и Phe, а также веществ в смесях, составляли по 10-4 М. К семенам в количестве 25 штук добавляли 5 мл исследуемого раствора и выдерживали их в нем 24 ч. Растворы сливали, семена промывали дистиллированной водой и помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой. Всхожесть семян определяли через 24, 48 и 72 ч (табл. 1). Доверительный интервал вычисляли со степенью надежности а=0.95.
Таблица 1
Прорастание семян Avena sativa в лабораторных условиях (концентрации индивидуальных веществ и веществ в смесях по 10-4 М)
Соединение
Параметр H2O 1 2 Phe Смесь Смесь
(контроль) 1-Phe 2-Phe
Через 24 ч:
Всхожесть, % 0 0 0 0 0 0
Длина ростка, мм - - - - - -
Количество с корнем, % 92 92 84 100 96 96
Длина корня, мм 2.6±0,6 3.0±1.4 3.3±0.7 2.7±1.2 3.5±1.2 2.5±1.1
Через 48 ч:
Всхожесть, % 56 28 40 24 72 88
Длина ростка, мм 1.0±0.6 0.6±0.9 0.5±1.3 1.4±1.2 1.2±1.2 1.6±1.1
Количество с корнем, % 94 100 88 100 100 96
Длина корня, мм 4.6±0.5 3.3±0.8 3.5±1.2 4.6±1.2 4.3±1.2 7.3±0.5
Через 72 ч:
Всхожесть, % 92 60 68 80 76 88
Длина ростка, мм 4.2±0.6 3.5±1.3 3.7±0.6 2.5±0.8 6.0±0.6 5.8±1.2
Количество с корнем, % 96 100 96 100 100 96
Длина корня, мм 7.1±0.6 5.5±1.1 6.4±0.8 5.3±1.2 9.0±0.7 9.7±1.1
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Наличие межмолекулярных взаимодействий между РЬе и гликозидами 1 и 2 установлено методом УФ-спектроскопии. При увеличении концентрации гликозидов 1 и 2 и постоянной концентрации аминокислоты (10-3 М) наблюдается повышение оптической плотности растворов - гиперхромный эффект (рис. 2 и 3). При анализе спектральных данных установлено, что максимум поглощения РЬе, составляющий 257 нм (10-3 М раствор), при увеличении концентрации гликозидов 1 и 2 практически не изменяется.
Состав комплексов определен методом изомолярных серий [15]. Для комплекса гликозида 1 с РЬе получено молярное отношение 1.06 (рис. 4), что соответствует комплексу состава 1:1 (рис. 1). Для комплекса гликозида 2 и РЬе получено молярное отношение 0.99 (рис. 4). Таким образом, состав комплекса также равен 1:1 (рис. 1). Образование комплексов аналогичного состава между РЬе и гликозидами 1 и 2 было недавно подтверждено масс-спектрометрически с ионизацией электрораспылением [11]. Молярное соотношение компонентов в ранее полученных комплексах гликозидов 1 и 2 с Тгр в водных растворах также составило 1:1 [12].
X, нм
Рис. 2. УФ-спектры растворов Phe (10-3 М = const) при различных концентрациях гликозида 1: 0 М (кривая 1), 0.50-10-4 М (2), 10-4 М (3), 0.25-10-3 М (4), 0.50-10-3 М (5), 0.75-10-3 М (6) и 10-3 М (7).
Ранее сообщалось о связывании аминокислот с макроциклическими лигандами посредством группы NH3 [16]. На основе ИК-спектроскопии нами было показано, что в межмолекулярном взаимодействии в основном участвуют карбоксильная группа агликона хедерагенина гликозида 1 и цвиттер-ион аминокислот [17, 18].
Следовательно, группа NH3+ цвиттер-ионной формы Phe образует водородную связь с группой СО карбоксила гликозида 1 типа NH3---O=C. Гликозид 2 связывается с NH3 аминокислоты посредством водородных связей с ОН-группами моносахаридных остатков и ион-дипольных взаимодействий N ...OH. Возможно, что связывание также происходит за счет гидрофобных взаимодействий бензольного кольца аминокислоты с неполярным агликоном гликозидов.
Тритерпеновые гликозиды являются факторами аллелопатического взаимодействия в фитоценозах, что связано с их токсическим действием, приводящим к подавлению роста и развития растений [19]. Для предварительной оценки токсичности комплексов 1 и 2 с Phe нами рассмотрено их действие на всхожесть семян Avena sativa (табл. 1).
Через 48 ч всхожесть семян, предварительно вымоченных в смесях гликозидов с Phe, оказалась существенно выше, чем у тех, которые были обработаны
растворами индивидуальных гликозидов и аминокислоты или находились в контрольной группе. Отмечен значительный рост корня после обработки смесью гликозида 2 и РЬе.
А, нм
Рис. 3. УФ-спектры растворов Phe (10-3 М = const) при различных концентрациях гликозида 2: 0 М (кривая 1), 0.25-10-4 М (2), 0.50-10-4 М (3), 10-4 М (4), 0.50-10-3 М (5), 0.75-10-3 М (6) и 10-3 М (7).
Спустя 72 ч после обработки семян смесями гликозид-Phe их всхожесть была больше, чем у тех, которые выдерживались в растворах гликозидов. Длины ростков и корней у семян, на которые действовали смесями гликозидов с Phe, также оказались максимальными.
Рис. 4. Зависимость оптической плотности А от соотношения компонентов изомолярной серии при А,=257 нм: с(гликозидов)=10-4 М, с(РЬе)=10-4 М.
Следовательно, взаимодействие между РЬе и гликозидами 1 и 2 приводит к получению соединений, увеличивающих всхожесть семян и наиболее активно
влияющих на рост их корня и ростка. Таким образом, продукты комплексообразования
являются менее токсичными, чем индивидуальные гликозиды.
ВЫВОДЫ
1. Впервые получены молекулярные комплексы тритерпеновых гликозидов с Phe в водных растворах.
2. Mетодом изомолярных серий установлено, что Phe образует комплексы с гликозидами l и 2 состава i:i.
3. Показано, что межмолекулярное взаимодействие сопровождается гиперхромным эффектом.
4. Сделано предположение об участии группы NH3+ аминокислоты в связывании с гликозидами.
5. Комплексы являются менее токсичными, чем индивидуальные гликозиды. Они увеличивают всхожесть семян и наиболее активно влияют на рост их корня и ростка.
Список литературы
1. Толстикова Т.Г. На пути к низкодозным лекарствам / Т.Г. Толстикова, А.Г. Толстиков, Г.А. Толстиков // Вестник РАН. - 2GG7. - Т. 77, № iG. - С. 8б7-874.
2. Солодка: Биоразнообразие, химия, применение в медицине / [Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Гранкина В.П. и др.]. - Новосибирск: Академическое изд-во «Гео», 2GG7. - 311 с.
3. Комплексообразование сердечных гликозидов с аминокислотами и щелочноземельными металлами / Н.А. Горчакова, Т.Г. Самарская, В.А. Самарский [и др.] // Фармакол. и токсикол. -1992. - № 27. - С. 1G6-1G9.
4. Взаемодш стероïдних глжозидш з амшокислотами: дослвдження методом плазменно-десорбцiйноï мас-спектрометрп / В.В. Пилипенко, С.О. Аксьонов, ОМ. Калiнкевич [та ш.] // Biopolym. сell. -20GG. - Т. 1б, № 3. - С. 212-219.
5. 252Cf Plasma desorption mass spectrometric study of interactions of steroid glycosides with amino acids / V.V. Pilipenko, L.F. Sukhodub, S.A. Aksyonov [et al.] // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2GGG. -Vol. 14. - P. 819-823.
6. Яковшин Л.О. Вплив тритерпенових глжозидш та ïх комплексш на молюсюв / Л.О. Яковшин, В.А. Сртахова, К.А. Базюра // Ukr. Bioorg. Acta. - 2GG6. - Т. 4, № 2. - С. 22-2б.
7. Mолекулярный комплекс тритерпенового гликозида a-хедерина с силденафилом (виагрой) / Л.А. Яковишин, MA. Рубинсон, А.Л. Кузнецова [и др.] // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2GG6. - Т. 19 (58), № 1. - С. 179-182.
S. Яковишин Л.А. Комплекс тритерпеновых гликозидов лекарственного препарата Hedelix® / Л.А. Яковишин, В.И. Гришковец // Химия природ. соедин. - 2GG3. - № 5. - С. 417-418.
9. Исследование тритерпеновых гликозидов лекарственного препарата проспан® / Л.А. Яковишин, MA. Вожжова, А. Л. Кузнецова [и др.] // Журн. орг. и фарм. химии. - 2GG5. - Т. 3, вып. 1. - С. 57-59.
1G. Зузук БЖ. Плющ вьющийся Hedera helix L. / БЖ. Зузук, Р.В. Куцик, Л.И. Зузук // Провизор. -2GG3. - № 12. - С. 13-14.
11. Mатериалы X Mеждунар. семинара по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология), 2-7 мар. 2G1G г., Ростов-на-Дону. - Ростов-на-Дону: Рос. фонд фунд. исслед. - 2G1G. - С. 3G.
12. Mолекулярное комплексообразование тритерпеновых гликозидов с триптофаном в водных растворах / Л.А. Яковишин, В.И. Гришковец, Н.В. Епишина [и др.] // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». -2G1G. - Т. 23 (б2), № 2. - С. 27G-275.
13. Тритерпеновые гликозиды Hedera taurica I. Строение таурозида Е из листьев Hedera taurica / А.С. Шашков, В.И. Гришковец, А.А. Лолойко [и др.] // Химия природ. соедин. - 1987. - № 3. -С. 363-366.
14. Тритерпеновые гликозиды Hedera canariensis I. Строение гликозидов L-A, L-B1, L-B2, L-C, L-D, L-E1, L-G1, L-G2, L-G3, L-G4, L-H1, L-H2 и L-I1 из листьев Hedera canariensis / В.И. Гришковец, Д.Ю. Сидоров, Л.А. Яковишин [и др.] // Химия природ. соедин. - 1996. - № 3. - С. 377-383.
15. Булатов М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа / М.И. Булатов, И.П. Калинкин. - [5-е изд.]. - Л.: Химия, 1986. - 432 с.
16. Куликов О.В. Термодинамика образования молекулярных комплексов в водных растворах аминокислот, пептидов, нуклеиновых оснований и макроциклических соединений: автореф. дис. на соиск. уч. степени докт. хим. наук: спец. 02.00.04 «Физическая химия» / О.В. Куликов. -Иваново, 2005. - 36 с.
17. Комплексообразование тритерпенового гликозида а-хедерина с гидрофильными протеиногенными аминокислотами / Л.А. Яковишин, В.И. Гришковец, М.А. Рубинсон [и др.] // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2009. - Т. 22 (61), № 1. - С. 208-213.
18. Яковшин Л.О. Молекулярш комплекси тритерпенового глжозиду а-хедерину з атфатичними протешогенними амшокислотами / Л.О. Яковшин, М.А. Рубшсон // Ukr. Bioorg. Acta. - 2009. -Т. 7, № 1. - С. 32-35.
19. Анисимов М.М. О биологической роли тритерпеновых гликозидов / М.М. Анисимов, В.Я. Чирва // Успехи современной биологии. - 1980. - Т. 6, № 3. - С. 351-364.
Яковшин Л. О. Молекулярне комплексоутворення тритерпенових глiкозидiв з L-феншаланшом у водних розчинах / Л. О. Яковi шин, В.1 Гришковець, Ю.1. Серпенко, Е.Н. Корж // Вчет записки Тавршського национального унгверситету ím. В.1. Вернадського. Сeрiя „Бюлопя, хiмiя". - 2010. -Т. 23 (62), № 3. - С. 255-261.
Уперше методом УФ-спектроскопй дослвджено молекулярне комплексоутворення L-феншаланшу з 3-О-а^-рамнотранозил-(1^2)-О-а^-арабшошранозидом хедерагенiну (а-хедерином) та його 28-О-а-L-рaмноmрaнозил-(1^4)-О-P-D-глк>коmрaнозил-(1^6)-О-P-D-глк>коmрaнозиловьIм естером
(хедерасапоншом С) у водних розчинах. Встановлено, що глжозиди утворюють комплекси з L-феншаланшом складу 1:1. Зроблено висновок про вплив будови гл1козид1в та L-феншаланшу на процес комплексоутворення. Проведено п^вняльне вивчення впливу глiкозидiв та 1х комплексiв на проростання насшня Avena sativa L.
KnwHoei слова: тритерпенж глжозиди, а-хедерин, хедерасапонш С, L-феншалашн, молекулярний комплекс, УФ-спектроскопiя, Avena sativa L., проростання нaсiння.
Yakovishin L.A. Molecular complexation of triterpene glycosides with L-phenylalanine in water solutions / L.A. Yakovishin, V.I Grishkovets, U.I. Sergienko, E.N. Kordg // Scientific Notes of Taurida V.Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2010. - Vol. 23 (62), No. 3. - P. 255-261. Using a method UV-spectroscopy, the molecular complexation of ¿-phenylalanine with hederagenin 3-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1^2)-O-a-L-arabinopyranoside (a-hederin) and its 28-0-a-L-rhamnopyranosyl-(1^4)-0-P-L>-glucopyranosyl-(1^6)-0-P-L>-glucopyranosyl ester (hederasaponin C) in water solutions was for the first time investigated. The glycosides form complexes with L-phenylalanine in the 1:1 molar proportion. The structures of glycosides and L-phenylalanine are concluded to have an impact on the complexation process. Comparative study of influence of glycosides and complexes on seeds germination Avena sativa L. has been made.
Keywords: triterpene glycosides, a-hederin, hederasaponin C, L-phenylalanine, molecular complex, UV-spectroscopy, Avena sativa L., seeds germination.
Поступила в редакцию 20.09.2010 г.
